CN112904048B - 一种透射电镜样品中心位置的调节方法 - Google Patents

Abstract

一种透射电镜样品中心位置的调节方法，包括：（1）衍射测试前调节：先将样品置于成像区域中心，再将样品台先后旋转至正、负对称角度下，采集样品的两张实空间放大图像，进行卷积计算，根据图像关联信息的相似性，调节样品台高度，再改变样品台先后旋转的正、负对称角度，重复操作并调节至共心高度；（2）衍射测试中调节：切换为衍射模式，调节转角速度后，启动样品台的旋转，按照固定的曝光间隔，收集样品的衍射图像以及散焦后的图像，通过计算机图形学的方法，计算出样品中心的移动方向和距离，调节样品台，将样品移动至衍射区域的中心。本发明方法能实时获取样品的位置信息并调整，固定在衍射区域的中心，衍射数据收集的效率和质量高。

Description

一种透射电镜样品中心位置的调节方法

技术领域

本发明涉及一种样品中心位置的调节方法，具体涉及一种透射电镜样品中心位置的调节方法。

背景技术

微晶电子衍射是一种前沿的分子晶体的结构解析技术。它使用比 X 射线更短的电子束作为辐射源，电子束在电磁透镜的作用下会聚，透射穿过具有周期性的微晶，并在探测器上产生衍射图样。通过旋转晶体，可获得一系列不同角度的衍射图像，再对衍射图像数据进行简化和解析，最终可以得到原子分辨率的晶体三维结构。该方法可以快速、高分辨率（原子尺度）的测定小分子化合物和生物大分子的三维结构，是小分子药物解析的有力工具。

透射电子显微镜是一种利用高能量电子束穿过薄样品后，探测其透射电子投影图像的技术。透射电子显微镜可以在实空间和倒易空间两种模式下观测样品。在实空间观测样品时，可以确定电子束辐照区域中的颗粒的位置、形貌；而在倒易空间，也就是衍射模式下，电子束中部分电子在样品中产生布拉格衍射，从而得到特定颗粒的衍射图谱。但是，在微晶电子衍射实验数据的旋转收集过程中，因为转角台带动样品旋转，样品会转出电子束照射区域，该情况的出现使探测器收集不到衍射数据，导致数据收集失败，更引发一系列的后续问题，比如收集时间变长会加大电子辐照损伤，增加样品损坏率等。因此，如何在样品旋转过程中，将样品固定保持在电子束的中心照射区域，避免衍射数据质量不高，影响最后的结果分析，是微晶电子衍射数据收集是否成功的重要影响因素，也是微晶电子衍射领域目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能实时获取样品的位置信息并调整，将样品固定保持在电子束衍射区域的中心，衍射数据收集的效率和质量高，样品结构解析的成功率高的透射电镜样品中心位置的调节方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种透射电镜样品中心位置的调节方法，包括以下步骤：

（1）衍射测试前调节：先将样品台上的样品置于成像区域中心，再将样品台先后旋转至正、负对称角度下，用探测器采集样品的两张实空间放大图像，进行卷积计算，根据所得两张图像关联信息的相似性，调节样品台高度，再改变样品台先后旋转的正、负对称角度，重复操作并调节至共心高度；

（2）衍射测试中调节：将透射电镜切换为衍射模式，调节透射电镜的转角速度后，启动样品台的旋转，按照固定的曝光间隔，用探测器收集样品的衍射图像以及透射电镜的透镜散焦后的图像，通过计算机图形学的方法，计算出样品中心的移动方向和距离，通过调节样品台，将样品移动至衍射区域的中心。

本发明方法的原理是：步骤（1）负责对样品台的竖直高度（Z方向）进行调整，在正、负对称角度下采集样品的实空间放大图像，对这两张图像进行卷积计算，得到它们的图像关联信息，从而判断样品台高度是否因旋转而偏离出电子束照射区域，并根据图像关联值预测竖直方向共心高度，并调节样品台至该高度，以确保在初始状态时样品台位于正确的竖直高度，从而减少旋转时的样品偏移；步骤（2）负责跟踪样品的移动方向（XY方向），固定曝光间隔后，获取样品的衍射图像，通过计算机图形学的方法，预测曝光间隔内样品的移动，并将该样品移回衍射区域的中心，保证电子束始终照射到样品上，从而获得连续的高质量微晶电子衍射数据。

优选地，步骤（1）中，将样品台上的样品置于成像区域中心的具体操作是：先将电子枪加压，样品载入样品台后，再将样品台插入转角仪，透射电镜抽真空，调节成像系统为实空间的放大模式，将样品置于成像区域的中心。

优选地，将所述电子枪加压至200kV。

优选地，所述实空间的放大倍数为2000倍。

优选地，步骤（1）中，所述正、负对称角度为±1°～±45°（更优选±5°～±20°）。更优选地，将样品台从正、负对称角度为±5°开始，依次增加±5°改变样品台角度。

优选地，步骤（1）中，所述实空间放大图像的获取方法包括散焦或移动样品台的高度等。

优选地，步骤（1）中，所述卷积计算是指：对两张图像分别做傅里叶变换后，再将变换后的两个图像做傅里叶相乘。

优选地，步骤（1）中，当图像关联信息的相似性≥±95%的绝对值时，相似性高，不需要调节样品台的高度，当图像关联信息的相似性＜±95%的绝对值时，相似性较低，根据相似性的正负性升高或降低样品台的高度。

优选地，步骤（2）中，所述转角速度为0.5°/s或1°/s。

优选地，步骤（2）中，按照固定的曝光时间间隔，用探测器收集样品的衍射图像，再按照固定的曝光时间间隔或帧数间隔，将透射电镜的透镜散焦，用探测器收集透镜散焦后的图像。

优选地，所述曝光时间间隔为0.3～1.0s。

优选地，所述帧数间隔为5～15帧。

优选地，步骤（2）中，所述散焦的电流为1000～1500μA。

优选地，步骤（2）中，所述计算机图形学的方法包括高斯滤波、热度图或光流定位等。

优选地，所述高斯滤波方法的具体操作为：通过高斯滤波获取图像阴影区域，该阴影区域代表样品，再经过XY方向像素扫描，计算出图像阴影区域的中心，对比相邻两张散焦的图像，计算出图像阴影区域中心的移动方向和距离。该散焦的图像记录了经过选区光阑后电子照射的区域，该区域中的阴影区域代表样品。

优选地，步骤（2）中，所述移动的具体方式是：将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

本发明方法的有益效果如下：本发明方法利用计算机图像学，结合透射电镜的自动控制，与以前的衍射实验方法相比，存在巨大优势，其能够通过图像实时获取样品的位置信息，并自动进行位置调节，保持样品在旋转过程中，始终处于电子束衍射区域的中心，提高了微晶电子衍射数据收集的效率和质量，样品结构解析的成功率高，对小分子药物设计提供可靠的分子结构信息。

附图说明

图1是本发明实施例2对样品图像在正负对称角度下的关联信息图；

图2是本发明实施例2对样品散焦后的相邻两张衍射图像的移动轨迹图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

实施例1

（1）衍射测试前调节：先将电子枪加压至200kV，某商业用户样品（C₁₉NO₂Cl₂）铜网载入样品台后，再将样品台插入转角仪，透射电镜抽真空，调节成像系统为实空间的放大模式（放大倍数为2000倍），移动样品台的高度，将样品置于成像区域的中心，再将样品台先后旋转至+5°、-5°下，用探测器采集样品的两张实空间放大图像，对两张图像分别做傅里叶变换后，再将变换后的两个图像做傅里叶相乘，所得两张图像关联信息的相似性为+99%，相似性高，不需要调节样品台的高度，分别再将样品台先后旋转至+10°、-10°，+15°、-15°，+20°、-20°下，重复操作，所得两张图像关联信息的相似性依次为+98%、+97%、+96%，相似性高，不需要调节样品台的高度，所处高度即为共心高度；

（2）衍射测试中调节：将透射电镜切换为衍射模式，调节透射电镜的转角速度为1°/s后，启动样品台的旋转，按照固定的曝光时间间隔0.5s，用探测器收集样品的衍射图像，再按照固定的帧数间隔10帧，将透射电镜的透镜散焦（电流为1200μA），用探测器收集透镜散焦后的图像，通过高斯滤波获取图像阴影区域，该阴影区域代表样品，再经过XY方向像素扫描，计算出图像阴影区域的中心，对比相邻两张散焦的图像，计算出图像阴影区域中心的移动方向和距离（方向为237.9°，距离为172 nm），通过调节样品台，将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

经微晶电子衍射检测，样品（C₁₉NO₂Cl₂）的晶胞参数为a = 7.11 Å， b = 20.08Å，c = 3.71Å，α = 90°，β = 110.9°，γ= 90°，空间群（对称性信息）为P2₁ /n，与PXRD的实验数据一致，说明本发明方法实施例提高了微晶电子衍射数据收集的效率和质量，样品结构解析的成功率高。

实施例2

（1）衍射测试前调节：先将电子枪加压至200kV，某商业用户样品COTZAN07：N-(4-hydroxyphenyl)ethanamide（C₈H₉NO₂，简称扑热息痛）铜网载入样品台后，再将样品台插入转角仪，透射电镜抽真空，调节成像系统为实空间的放大模式（放大倍数为2000倍），移动样品台的高度，将样品置于成像区域的中心，再将样品台先后旋转至+5°、-5°下，用探测器采集样品的两张实空间放大图像，对两张图像分别做傅里叶变换后，再将变换后的两个图像做傅里叶相乘，所得两张图像关联信息（如图1所示）的相似性为-85%，相似性较低，向左上方偏移，升高样品台的高度20nm，再将样品台先后旋转至+10°、-10°，重复操作，所得两张图像关联信息的相似性为+90%，相似性较低，向右下方偏移，降低样品台的高度10nm，分别再将样品台先后旋转至+15°、-15°，+20°、-20°下，重复操作，所得两张图像关联信息的相似性依次为+97%、+96%，相似性高，不需要调节样品台的高度，所处高度即为共心高度；

（2）衍射测试中调节：将透射电镜切换为衍射模式，调节透射电镜的转角速度为0.5°/s后，启动样品台的旋转，按照固定的曝光时间间隔0.8s，用探测器收集样品的衍射图像，再按照固定的帧数间隔10帧，将透射电镜的透镜散焦（电流为1200μA），用探测器收集透镜散焦后的图像，通过高斯滤波获取图像阴影区域，该阴影区域代表样品，再经过XY方向像素扫描，计算出图像阴影区域的中心，对比相邻两张散焦的图像（如图2所示），计算出图像阴影区域中心的移动方向和距离（方向为211.3°，距离为235 nm），通过调节样品台，将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

由图1可知，波纹形成的椭圆形主轴方向代表了Z高度的移动方向。

由图2可知，图像的阴影区域是样品在相邻固定帧数间隔的散焦图像中的表象，可看出在样品台的旋转过程中样品发生了轻微的移动，白色箭头矢量表明了样品移动的方向和距离。

经微晶电子衍射检测，样品COTZAN07：N-(4-hydroxyphenyl)ethanamide（C₈H₉NO₂，简称扑热息痛）的晶胞参数为a = 7.16 Å，b = 9.36 Å，c = 11.5 Å，α = 90°，β = 98.7°，γ= 90°，空间群（对称性信息）为P2₁ /n，与CCDC的国际标准数据一致，说明本发明方法实施例提高了微晶电子衍射数据收集的效率和质量，样品结构解析的成功率高。

Claims (8)

1.一种透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）衍射测试前调节：先将样品台上的样品置于成像区域中心，再将样品台先后旋转至正、负对称角度下，用探测器采集样品的两张实空间放大图像，进行卷积计算，根据所得两张图像关联信息的相似性，调节样品台高度，再改变样品台先后旋转的正、负对称角度，重复操作并调节至共心高度；

（2）衍射测试中调节：将透射电镜切换为衍射模式，调节透射电镜的转角速度后，启动样品台的旋转，按照固定的曝光间隔，用探测器收集样品的衍射图像以及透射电镜的透镜散焦后的图像，通过计算机图形学的方法，计算出样品中心的移动方向和距离，通过调节样品台，将样品移动至衍射区域的中心；所述计算机图形学的方法包括高斯滤波、热度图或光流定位；所述高斯滤波方法的具体操作为：通过高斯滤波获取图像阴影区域，该阴影区域代表样品，再经过XY方向像素扫描，计算出图像阴影区域的中心，对比相邻两张散焦的图像，计算出图像阴影区域中心的移动方向和距离。

2.根据权利要求1所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（1）中，将样品台上的样品置于成像区域中心的具体操作是：先将电子枪加压，样品载入样品台后，再将样品台插入转角仪，透射电镜抽真空，调节成像系统为实空间的放大模式，将样品置于成像区域的中心。

3.根据权利要求1或2所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（1）中，所述正、负对称角度为±1°～±45°；所述实空间放大图像的获取方法包括散焦或移动样品台的高度；所述卷积计算是指：对两张图像分别做傅里叶变换后，再将变换后的两个图像做傅里叶相乘；当图像关联信息的相似性≥±95%的绝对值时，相似性高，不需要调节样品台的高度，当图像关联信息的相似性＜±95%的绝对值时，相似性较低，根据相似性的正负性升高或降低样品台的高度。

4.根据权利要求1或2所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（2）中，按照固定的曝光时间间隔，用探测器收集样品的衍射图像，再按照固定的曝光时间间隔或帧数间隔，将透射电镜的透镜散焦，用探测器收集透镜散焦后的图像；所述曝光时间间隔为0.3～1.0s；所述帧数间隔为5～15帧。

5.根据权利要求3所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（2）中，按照固定的曝光时间间隔，用探测器收集样品的衍射图像，再按照固定的曝光时间间隔或帧数间隔，将透射电镜的透镜散焦，用探测器收集透镜散焦后的图像；所述曝光时间间隔为0.3～1.0s；所述帧数间隔为5～15帧。

6.根据权利要求1或2所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（2）中，所述移动的具体方式是：将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

7.根据权利要求3所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（2）中，所述移动的具体方式是：将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

8.根据权利要求4所述透射电镜样品中心位置的调节方法，其特征在于：步骤（2）中，所述移动的具体方式是：将样品沿所计算移动方向的反方向和计算的距离实时移动至衍射区域的中心。

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