CN112889812A - 表儿茶素的用途及细胞冷冻保存液和细胞冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表儿茶素的用途及细胞冷冻保存液和细胞冷冻保存方法。将表儿茶素作为细胞冷冻保存液的成分添加至细胞冷冻保存液中，能够提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率。

Description

表儿茶素的用途及细胞冷冻保存液和细胞冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及一种表儿茶素的用途及细胞冷冻保存液和细胞冷冻保存方法。

背景技术

针对帕金森等药物无法根治的神经系统退行性疾病，神经干细胞细胞治疗带来前所未有的光明。神经干细胞具有无限自我更新和分化为神经元和胶质细胞的潜能。在细胞治疗过程中，一方面可通过内部刺激患者大脑中存在的神经干细胞，使其分化、迁移至患病处，恢复所被限制的生理过程；另一方面，通过体外移植功能性神经干细胞，补充体内缺少或丧失正常功能的细胞。现已被广泛认可的移植细胞来源于多能干细胞定向诱导分化得到的诱导性神经干细胞。然而，迄今为止，诱导性神经干细胞数量远远少于科学研究和临床应用的需要，并且神经干细胞在体外持续稳定培养较为困难。因此，神经干细胞的冷冻保存和复苏对于细胞治疗的科学研究和临床应用具有非常重要的价值。一方面，其可为科学研究提供稳定的细胞来源，提高临床细胞移植治疗的可实施性；另一方面，其还可以避免细胞退化、衰老，甚至避免微生物污染的个体变异，以及避免在长期培养过程中经费和时间的消耗。

目前，按神经干细胞冷冻保存对象的不同，神经干细胞的冷冻保存主要包括神经球的冷冻保存和单个神经干细胞的冷冻保存。以神经干细胞完全培养基和二甲基亚砜作为冷冻保存液可以对以直径为80～100μm的细胞克隆为标准进行冷冻保存。由于冷冻保存单位为直径较大的神经球，使细胞冷冻保存和复苏时细胞数量不易控制，且二甲基亚砜的渗透导致细胞复苏率降低。此外，可以将神经球包埋固定于胶原培养基中，冷冻保存管中成胶；将DMSO导入胶原-神经球复合物中；再将冷冻保存管转入控速降温冷冻保存盒中，并放于-85℃冰箱，最后转入-196℃液氮保存(参见CN101070534A)。该方法虽然减轻了DMSO渗透过程中对细胞膜两侧造成的压差损伤，但细胞复苏率较低。以神经干细胞完全培养基和二甲基亚砜作为冷冻保存液可以对单个神经干细胞进行冷冻保存。虽然该方法细胞数量可控，但是细胞裸露于冷冻环境中，缺少维持细胞活性的因子，从而使细胞复苏率仅在70％左右。

综上，无论是神经球还是单个神经干细胞的冷冻保存，均需要使用二甲基亚砜作为冷冻保护剂。研究表明，当培养基中DMSO浓度达到10vol％时，细胞生长抑制率近100％。即使培养基中DMSO浓度为0.04vol％，DMSO对细胞生长也具有抑制作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种表儿茶素的用途。本发明惊喜地发现，将表儿茶素作为细胞冷冻保存液的成分添加至细胞冷冻保存液中，能够提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率。

本发明的另一个目的在于提供一种细胞冷冻保存液。该细胞冷冻保存液可用于人或其它动物的神经干细胞、神经元和/或神经胶质细胞的冷冻保存，且该细胞冷冻保存液的成分明确，毒副作用低，冷冻保存复苏率高。

本发明的再一个目的在于提供一种细胞冷冻保存方法。该方法能够提高细胞的冷冻保存复苏率，从而获得优质的细胞冷冻保存复苏产品。

一方面，本发明提供一种表儿茶素在提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率中的用途。

根据本发明的用途，优选地，所述神经干细胞复苏率为75％以上。

根据本发明的用途，优选地，所述表儿茶素作为细胞冷冻保存液的成分添加至细胞冷冻保存液中；基于细胞冷冻保存液，所述表儿茶素在所述细胞冷冻保存液中的浓度为130～190μg/ml。

根据本发明的用途，优选地，所述细胞冷冻保存液还包括二甲基亚砜；基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

另一方面，本发明还提供一种细胞冷冻保存液，包括表儿茶素和二甲基亚砜；基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

根据本发明的细胞冷冻保存液，优选地，基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.7≤α×β≤6.5 (1)

13.6≤α×β≤15.2 (2)。

根据本发明的细胞冷冻保存液，优选地，二甲基亚砜浓度α为3～8vol％，表儿茶素浓度β为130～190μg/ml。

根据本发明的细胞冷冻保存液，优选地，所述细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β选自如下组合之一：

(1)α＝5vol％，且β＝130μg/ml；

(2)α＝8vol％，且β＝170μg/ml；

(3)α＝3vol％，且β＝190μg/ml；或者

(4)α＝8vol％，且β＝190μg/ml。

根据本发明的细胞冷冻保存液，优选地，还包括神经干细胞完全培养基；所述神经干细胞完全培养基包含70～90vol％的DMEM/F12培养基，0.5～2vol％的N2添加剂，0.5～1.5vol％的链霉素-青霉素混合溶液，10～50ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和10～50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF。

再一方面，本发明还提供一种采用上述细胞冷冻保存液进行细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：

将细胞以0.8～1.2×10⁶个细胞/ml的浓度置于装有细胞冷冻保存液的容器中，-70～-90℃静置过夜，然后在液氮中冷冻保存，所述细胞包括神经干细胞、神经元和/或神经胶质细胞。

本发明首次将表儿茶素添加至细胞冷冻保存液中，用于神经干细胞的冷冻保存。一方面，表儿茶素作为神经干细胞冷冻保存时的维持因子，能够提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率；另一方面，表儿茶素的添加可以减少冷冻保护剂二甲基亚砜的含量。

实验表明，表儿茶素与二甲基亚砜、神经干细胞完全培养基组成的细胞冷冻保存液，能够用于提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率，最高可达91.27％。采用细胞冷冻保存液冷冻保存的神经干细胞更适用于大脑类器官药物筛选体系的制作。

附图说明

图1为采用实施例1～4和比较例1～8的细胞冷冻保存液冷冻保存神经干细胞后的复苏率统计图。

图2为采用比较例9～17的细胞冷冻保存液冷冻保存神经干细胞后的复苏率统计图。其中，星号表示对照组9～17复苏率相比于对照组18复苏率具有显著差异，*为T值＜0.05，差异显著；**为T值＜0.01，差异较显著；***为T值＜0.001，差异极显著。

图3为实验组3(3％DMSO、190μg/ml EC和神经干细胞完全培养基)神经干细胞冷冻前活细胞比率检测图。

图4为实验组3(3％DMSO、190μg/ml EC和神经干细胞完全培养基)神经干细胞冷冻复苏后活细胞比率检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

在本发明中，vol％表示体积百分比。

本发明中，神经干细胞包括神经球和/或单个神经干细胞。

＜表儿茶素的用途＞

本发明提供一种表儿茶素在提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率中的用途。表儿茶素(EC)是一种存在于绿茶、红酒、可可制品和许多水果中的黄烷醇儿茶素类化合物，分子式为C₁₅H₁₄O₆，分子量为290.27。本发明惊喜地发现，将表儿茶素作为细胞冷冻保存液的成分添加至细胞冷冻保存液中，表儿茶素在细胞冷冻保存液中的浓度为130～190μg/ml，表儿茶素能够作为神经干细胞冷冻保存时的维持因子，提高人或其它动物神经干细胞冷冻保存后的复苏率。因此，本发明的细胞冷冻保存液包括表儿茶素。在细胞冷冻保存液中，表儿茶素的浓度为130～190μg/ml。

本发明的细胞冷冻保存液可以包括表儿茶素和二甲基亚砜。二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，分子式为C₂H₆OS，分子量为78.13，常温下为无色无臭的透明液体。二甲基亚砜在细胞冷冻保存时，可提高细胞膜流动性，保持细胞内离子浓度，防止细胞内液产结晶、细胞结构紊乱和细胞内渗透压改变所导致的损伤。在本发明的细胞冷冻保存液中，二甲基亚砜浓度α为3～8vol％；表儿茶素浓度β为130～190μg/ml。采用上述浓度关系范围的二甲基亚砜与表儿茶素组成的细胞冷冻保存液，可以提高冷冻后的神经干细胞的复苏率。从改善复苏率的角度讲，二甲基亚砜浓度α为3vol％，且表儿茶素浓度β为190μg/ml；或者二甲基亚砜浓度α为8vol％，且表儿茶素浓度β为190μg/ml。从兼顾成本和复苏率的角度讲，二甲基亚砜浓度α为8vol％，且表儿茶素浓度β为170μg/ml。为了进一步降低成本且兼顾复苏率，二甲基亚砜浓度α为5vol％，且表儿茶素浓度β为130μg/ml。

以细胞冷冻保存液为基准，本发明的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

采用上述浓度关系范围的二甲基亚砜与表儿茶素组成的细胞冷冻保存液，既能够降低二甲基亚砜的含量，还能使冷冻后的神经干细胞的复苏率达到75％以上，且复苏后的神经干细胞能够保持良好的细胞形态和活性，为后期神经干细胞的移植提供物质基础。

根据本发明的一个实施方式，5.5≤α×β≤7.0。优选地，5.7≤α×β≤6.5。这样可以提高神经干细胞复苏率。更优选地，鉴于表儿茶素的价格远高于二甲基亚砜，则6≤α×β≤6.5。这样可以降低表儿茶素用量，从而兼顾成本和神经干细胞复苏率。

根据本发明的另一个实施方式，13.0≤α×β≤15.5。优选地，13.6≤α×β≤15.2。这样可以提高神经干细胞复苏率。更优选地，鉴于表儿茶素的价格远高于二甲基亚砜，则13.6≤α×β≤13.9。这样可以降低表儿茶素用量，从而兼顾成本和神经干细胞复苏率。

＜细胞冷冻保存液＞

本发明的细胞冷冻保存液包括表儿茶素和二甲基亚砜。在某些实施方案中，本发明的细胞冷冻保存液还包括神经干细胞完全培养基。

基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

在某些实施方案中，基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.7≤α×β≤6.5 (1)

13.6≤α×β≤15.2 (2)。

采用上述浓度关系范围的二甲基亚砜与表儿茶素组成的细胞冷冻保存液，既能够降低二甲基亚砜的含量，还能使冷冻后的神经干细胞的复苏率达到75％以上，且复苏后的神经干细胞能够保持良好的细胞形态和活性，为后期神经干细胞的移植提供物质基础。

根据本发明的一个实施方式，5.5≤α×β≤7.0。优选地，5.7≤α×β≤6.5。这样可以提高神经干细胞复苏率。更优选地，鉴于表儿茶素的价格远高于二甲基亚砜，则6≤α×β≤6.5。这样可以降低表儿茶素用量，从而兼顾成本和神经干细胞复苏率。

根据本发明的另一个实施方式，13.0≤α×β≤15.5。优选地，13.6≤α×β≤15.2。这样可以提高神经干细胞复苏率。更优选地，鉴于表儿茶素的价格远高于二甲基亚砜，则13.6≤α×β≤13.9。这样可以降低表儿茶素用量，从而兼顾成本和神经干细胞复苏率。

在另一些实施方案中，以细胞冷冻保存液为基准，二甲基亚砜浓度α为3～8vol％，表儿茶素浓度β为130～190μg/ml。符合上述浓度关系的二甲基亚砜和表儿茶素组成的细胞冷冻保存液，使冷冻后的神经干细胞的复苏率达到75％以上。

本发明细胞冷冻保存液中，各原料均为已知物质，可通过市售购买得到，或采用本领域公知的方法制备得到。本发明细胞冷冻保存液可以采用本领域常规混合的方法制备，也可以采用其他方法制备，没有特别限定。

本发明的细胞冷冻保存液包括二甲基亚砜、表儿茶素和神经干细胞完全培养基；优选地，细胞冷冻保存液由二甲基亚砜、表儿茶素和神经干细胞完全培养基组成。

从改善复苏率的角度讲，本发明的细胞冷冻保存液中的二甲基亚砜浓度α为3vol％，且表儿茶素浓度β为190μg/ml；或者二甲基亚砜浓度α为8vol％，且表儿茶素浓度β为190μg/ml。从兼顾成本和复苏率的角度讲，二甲基亚砜浓度α为8vol％，且表儿茶素浓度β为170μg/ml。为了进一步降低成本且兼顾复苏率，二甲基亚砜浓度α为5vol％，且表儿茶素浓度β为130μg/ml。

本发明的神经干细胞完全培养基包含70～90vol％的DMEM/F12培养基，0.5～2vol％的N2添加剂(N2 supplement)，0.5～1.5vol％的链霉素-青霉素混合溶液，10～50ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和10～50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF。链霉素-青霉素混合溶液中链霉素的浓度为8000-20000mcg/ml，青霉素的浓度为9000-20000Units/ml。根据本发明的一个实施方式，本发明的神经干细胞完全培养基包含88vol％的DMEM/F12培养基，1vol％的N2添加剂(N2 supplement)，1vol％的链霉素-青霉素混合溶液，20ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，链霉素-青霉素混合溶液中链霉素的浓度为10,000mcg/ml，青霉素的浓度为12,000Units/ml。本发明神经干细胞完全培养基所用原料均是培养神经干细胞常用的添加剂，均可购过市售购得。选用上述物质组成神经干细胞完全培养基能够不影响细胞的生长特性。表皮生长因子(EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成。本发明选择表皮生长因子作为神经干细胞完全培养基中的原料，是因为表皮生长因子在神经干细胞体外稳定培养中，是细胞干性维持所必须的。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多肽，分子量为16～18.5kDa。本发明选择碱性成纤维细胞生长因子作为神经干细胞完全培养基中的原料，是因为碱性成纤维细胞生长因子在神经干细胞体外稳定培养中，是细胞干性维持和增值所必须的。

本发明细胞冷冻保存液既能用于能够提高人或其它动物神经干细胞、神经元和/或神经胶质细胞冷冻保存后的复苏率，也能用于动物细胞来源类器官的冷冻保存。经本发明细胞冷冻保存液所冷冻保存的神经干细胞更适用于大脑类器官药物筛选体系的制作。

＜冷冻保存方法＞

本发明还提供一种采用上述细胞冷冻保存液进行细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：将细胞以0.8～1.2×10⁶个细胞/ml的浓度置于装有细胞冷冻保存液的容器中，-70～-90℃静置过夜，然后在液氮中冷冻保存，细胞包括神经干细胞、神经元和/或神经胶质细胞，神经干细胞包括神经球和/或单个神经干细胞。本发明冷冻保存方法既能提高人或其它动物神经干细胞冷冻保存后的复苏率，也能提高动物神经元和神经胶质细胞冷冻保存后的复苏率。经本发明冷冻保存方法冷冻保存后的神经干细胞、神经元和神经胶质细胞，能够保持其原有生物学特性。

本发明中，细胞冷冻保存液所用二甲基亚砜、表儿茶素和神经干细胞完全培养基各原料的加入顺序和混合方式不做特殊限定，例如可以先配置神经干细胞完全培养基，混匀后再加入二甲基亚砜和表儿茶素，再次混合均匀，即得细胞冷冻保存液。

本发明中，细胞以0.8～1.2×10⁶个细胞/ml的浓度置于装有细胞冷冻保存液的容器中。细胞浓度优选为0.9×10⁶～1.1×10⁶个细胞/ml，更优选为1×10⁶个细胞/ml。将细胞冷冻保存液中的细胞浓度控制在上述范围，有利于保持细胞的形态和生物学特性，进而提高冷冻保存后细胞的复苏率。

本发明中，装有细胞冷冻保存液的容器于-70～-90℃静置过夜，优选为-75～-85℃，更优选为-80℃。将温度控制在上述范围，有利于提高冷冻保存后细胞的复苏率。

下面介绍以下实施例、比较例和实验例使用的原料。

DMEM/F12培养基购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，货号11330032。

N2添加剂购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，货号17502048。

二甲基亚砜(DMSO)购自VWR，货号0457C072。

表儿茶素(EC)购自Sigma，货号E4018。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自Sigma，货号93894。

链霉素-青霉素混合溶液(链霉素&青霉素)购自赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，货号10378016。

表皮生长因子(EGF)购自派普泰克(Peprotech)，货号315-09。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自派普泰克(Peprotech)，货号450-33。

实施例1

准备神经干细胞完全培养基，其包含88vol％的DMEM/F12培养基，1vol％的N2添加剂，1vol％的链霉素-青霉素混合溶液，20ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF。链霉素-青霉素混合溶液中链霉素的浓度为10,000mcg/ml，青霉素的浓度为12,000Units/ml。在神经干细胞完全培养基中添加浓度为5vol％的二甲基亚砜，浓度为130μg/ml的表儿茶素，得到细胞冷冻保存液。详情参见表1。

实施例2～4和比较例1～8

除了二甲基亚砜浓度、表儿茶素浓度，其他条件与实施例1相同。详情参见表1。

比较例9

准备神经干细胞完全培养基，其包含88vol％的DMEM/F12培养基，1vol％的N2添加剂，1vol％的链霉素-青霉素混合溶液，20ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF。链霉素-青霉素混合溶液中链霉素的浓度为10,000mcg/ml，青霉素的浓度为12,000Units/ml。在神经干细胞完全培养基中添加浓度为3vol％的二甲基亚砜，浓度为150μg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，得到细胞冷冻保存液。详情参见表2。

比较例10～18

除了二甲基亚砜浓度、表没食子儿茶素没食子酸酯浓度，其他条件与比较例9相同。详情参见表2。

实验例-神经干细胞冷冻保存实验

1.实验方法

神经干细胞自提于12.5天ICR小鼠胚胎纹状体中，再进行传代纯化。当神经干细胞进入指数生长期之后收集细胞球，移液枪吹打使细胞球分离至单个细胞，离心，弃掉培养基。

细胞计数，取1×10⁵个细胞做活率检测。剩余的部分以1×10⁶个细胞/ml浓度分别分装至盛有实施例1～4、比较例1～18的细胞冷冻保存液的细胞冷冻保存管中。

细胞冷冻保存管中的细胞装入程序冷冻保存盒中，-80℃过夜，第二天移入液氮罐中冷冻保存1天以上。

取1×10⁵个细胞，1000转/分钟，4℃，5分钟离心，弃掉上清。

细胞用磷酸缓冲液洗一次，重悬于300μl磷酸缓冲液中。

样品中加入0.3μl的PI染色3分钟，以未染色的细胞作为对照组。

流式细胞仪上PE通道检测活细胞比率，结果为80.33±7.26％。

将液氮中的冷冻保存细胞取出，迅速置于37℃水浴锅中，不断摇晃融化至冰水混合物。

细胞加到10倍体积的神经干细胞完全培养基中，反复吹打。

1000转/分钟，4℃，5分钟离心，弃掉上清。

用磷酸缓冲液洗一次，检测活细胞比率。

用以下公式检测细胞复苏率：

细胞复苏率＝(复苏后活细胞比率/冷冻保存前活细胞比率)×100％。

2.实验结果

实验结果如表1～2所示。由表1可知，表儿茶素不仅可以提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率，而且可以降低二甲基亚砜浓度。与对照组1～8进行比较可知，采用满足本发明关系的细胞冷冻保存液(实验组1～4)进行神经干细胞冷冻保存，复苏率更高。例如，二甲基亚砜浓度最低且复苏率最高组为：190μg/ml EC、3％DMSO，其神经干细胞的复苏率为91.27％，如图3和图4所示。

表1

编号	细胞冷冻保存液	α/vol％	β/μg/ml	α×β	复苏率
						对照组1	比较例1	3％	130	3.9	<70％
实验组1	实施例1	5％	130	6.5	>75％
						对照组2	比较例2	8％	130	10.4	<70％
对照组3	比较例3	3％	150	4.5	<70％
						对照组4	比较例4	5％	150	7.5	<70％
对照组5	比较例5	8％	150	12	70％～75％
						对照组6	比较例6	3％	170	5.1	<70％
对照组7	比较例7	5％	170	8.5	<70％
						实验组2	实施例2	8％	170	13.6	>75％
实验组3	实施例3	3％	190	5.7	>75％
						对照组8	比较例8	5％	190	9.5	<70％
实验组4	实施例4	8％	190	15.2	>75％

采用未添加EC及EGCG的细胞冷冻保存液(10vol％DMSO，比较例18)进行神经干细胞冷冻保存，复苏率为66.06±6.71％。由对照组9～17可知，将表没食子儿茶素没食子酸酯添加至细胞冷冻保存液，复苏率也均低于70％，且大多数低于对照组18的复苏率。

表2

编号	细胞冷冻保存液	DMSO浓度/vol％	EGCG浓度/μg/ml	复苏率
					对照组9	比较例9	3％	150	＜40％
对照组10	比较例10	5％	150	＜40％
					对照组11	比较例11	8％	150	＜40％
对照组12	比较例12	3％	250	＜40％
					对照组13	比较例13	5％	250	＜40％
对照组14	比较例14	8％	250	＜40％
					对照组15	比较例15	3％	350	＜40％
对照组16	比较例16	5％	350	＜40％
					对照组17	比较例17	8％	350	＜40％
对照组18	比较例18	10％	0	＜75％

由上述可知，虽然表儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯均为儿茶素类物质，且表没食子儿茶素没食子酸酯是茶多酚中最有效的活性成分，但是，表没食子儿茶素没食子酸酯不能提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率。表儿茶素却能提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率。由此可见，选择表儿茶素提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率不是本领域的常规手段，更不是容易想到的。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种表儿茶素在提高神经干细胞冷冻保存后的复苏率中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经干细胞复苏率为75％以上。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述表儿茶素作为细胞冷冻保存液的成分添加至细胞冷冻保存液中；基于细胞冷冻保存液，所述表儿茶素在所述细胞冷冻保存液中的浓度为130～190μg/ml。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞冷冻保存液还包括二甲基亚砜；基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

5.一种细胞冷冻保存液，其特征在于，包括表儿茶素和二甲基亚砜；基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.5≤α×β≤7.0 (1)

13.0≤α×β≤15.5 (2)

其中，二甲基亚砜浓度的单位为vol％；表儿茶素浓度的单位为μg/ml。

6.根据权利要求5所述的细胞冷冻保存液，其特征在于，基于细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β满足如下关系之一：

5.7≤α×β≤6.5 (1)

13.6≤α×β≤15.2 (2)。

7.根据权利要求5所述的细胞冷冻保存液，其特征在于，二甲基亚砜浓度α为3～8vol％，表儿茶素浓度β为130～190μg/ml。

8.根据权利要求5所述的细胞冷冻保存液，其特征在于，所述细胞冷冻保存液的二甲基亚砜浓度α与表儿茶素浓度β选自如下组合之一：

(1)α＝5vol％，且β＝130μg/ml；

(2)α＝8vol％，且β＝170μg/ml；

(3)α＝3vol％，且β＝190μg/ml；或者

(4)α＝8vol％，且β＝190μg/ml。

9.根据权利要求5～8任一项所述的细胞冷冻保存液，其特征在于，还包括神经干细胞完全培养基；所述神经干细胞完全培养基包含70～90vol％的DMEM/F12培养基，0.5～2vol％的N2添加剂，0.5～1.5vol％的链霉素-青霉素混合溶液，10～50ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和10～50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子bFGF。

10.一种采用权利要求5～9任一项所述的细胞冷冻保存液进行细胞冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

将细胞以0.8～1.2×10⁶个细胞/ml的浓度置于装有细胞冷冻保存液的容器中，-70～-90℃静置过夜，然后在液氮中冷冻保存，所述细胞包括神经干细胞、神经元和/或神经胶质细胞。

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