CN112881579A - L-苹果酸中异构体的检测方法 - Google Patents

L-苹果酸中异构体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑苹果酸中对映异构体（D‑苹果酸）的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测。本发明L‑苹果酸和D‑苹果酸的分离，检测成本低且具有良好的灵敏度、专属性和准确度，是L‑苹果酸原料药质量控制的行之有效的检测方法，从而进一步地最终保证L‑苹果酸相关制剂的产品质量和患者用药安全。

Description

L-苹果酸中异构体的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及L-苹果酸中对映异构体（D-苹果酸）检测方法。
背景技术
复方电解质注射液(Ⅱ)是由德国贝朗医疗有限公司推出的产品，英文名称为Multiple Electrolytes Injection(Ⅱ)，临床用于伴随或预期出现酸中毒的等渗性脱水，补充细胞外液的流失。其主要组分为：每1000ml中含氯化钠6 .80g，氯化钾0 .30g，氯化钙0.37g，氯化镁0 .20g，醋酸钠3 .27g，L-苹果酸0 .67g。
主药成分有L-苹果酸，英文名称为L-Malic acid，中文化学名为L-羟基丁二酸，分子式为C4H6O5，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
苹果酸，又名2-羟基丁二酸，有两种对映异构体，即D-苹果酸和L-苹果酸。大自然中，苹果酸以DL-苹果酸存在。L-苹果酸会在人体中自然产生并具有生物活性，是人体一种必须的有机酸。并且作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品行业；D-苹果酸的生理活性低，生物体内积累过量的D-苹果酸时会产生病变。D-苹果酸（即R构型）每天可摄入量为0~100mg/kg，婴幼儿不建议使用。美国粮食和药物管理局(FDA)规定DL-苹果酸不能用于婴儿食品添加剂。在医药行业，L-苹果酸是人体可以利用的形式，它常配以复合氨基酸注射液（手术后重要的营养药品）中，以提高氨基酸的利用率，这对手术后虚弱和肝功能障碍病人尤其重要。L-苹果酸钾是良好的钾补充药，它能保持人体的水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚等症。L-苹果酸是治疗肝病，尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良好药物。L苹果酸钠具有食盐的1/3咸味，可作肾脏病人代食盐。L-苹果酸常作为一种药物成分添加在一些药物制剂中，能明显提高药物主要成分的吸收率；在药物研究中L-苹果酸作为一种药物成分，就必须严格控制其本身带来的其它杂质，即必须严格控制D-苹果酸的限度，所以对L-苹果酸中的D-苹果酸的测定方法的研究具有重大意义。
L-苹果酸工业化生产主要是由酶工程法或发酵法，由于工艺控制的局限性，原料药富马酸都会或多或少地带到成品中去，另外还会产生马来酸、D-苹果酸等副产物。目前国内只有药用辅料级的L-苹果酸，有关物质中富马酸含量小于0.1%、马来酸含量小于0.05％，这些杂质其结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE004
富马酸 马来酸 D-苹果酸
《中国药典2015年版第四部》药用辅料L-苹果酸有关物质富马酸(≤1.0％)和马来酸（≤0.05%）的含量，未规定D-苹果酸的限度。现有技术下，L-苹果酸与相邻峰之间的分离度为2.6，D-苹果酸与相邻峰之间的分离度为2.9（段先哲等、正相高效液相色谱法测定L-苹果酸中的对映异构体D-苹果酸，分析仪器，2016年第2期，25-29页），但其系统适用性溶液中未加入富马酸和马来酸，若加入以上两者，在同样的条件下，很难实现马来酸、L-苹果酸、D-苹果酸的分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱分离测定L-苹果酸中D-苹果酸的方法，控制L-苹果酸中手性异构体含量从而保证药物安全性和质量可靠性。
本发明所述L-苹果酸的对映异构体结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
D-羟基丁二酸
本发明具体技术方案如下：
L-苹果酸中对映异构体的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，使L-苹果酸中对映异构体获得分离。
优选的，采用纤维素二氯苯基氨基甲酸脂为填充剂的色谱柱进行分离分析。
本发明所述的检测方法，高效液相色谱法可采用等度或者梯度洗脱，流动相为正己烷、异丙醇、乙醇及三氟乙酸，三氟乙酸的浓度为0.1%或0.2%。
优选的，所述三氟乙酸的浓度为0.2%。
优选的，所述高效液相色谱法采用等度洗脱，正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸的体积比为（85:12:3:0.2）。
本发明所述的检测方法，高效液相色谱法流动相的流速为0.4~0.6ml/min，色谱柱柱温是30~40℃，检测器为紫外检测器，检测波长为200~400nm。
本发明使用正相色谱法分析检测，实现了L-苹果酸中D-苹果酸的分离，检测成本低且具有良好的灵敏度、专属性和准确度，是L-苹果酸中对映异构体质量控制行之有效的检测方法，从而进一步地保证L-苹果酸相关制剂产品质量和患者用药安全。
附图说明
图1 常规高效液相色谱手性柱对L-苹果酸中对映异构体的分离（以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（80:20:0.1）为流动相）。
图2 以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1）为流动相的系统适用性溶液及马来酸溶液的HPLC图谱。
图3以正己烷-异丙醇-甲醇-三氟乙酸（85:10:5:0.1）为流动相的系统适用性溶液及马来酸溶液的HPLC图谱。
图4以正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）为流动相的系统适用性溶液及马来酸溶液的HPLC图谱。
图5 以不同浓度的三氟乙酸为流动相的系统适用性溶液的HPLC图谱。
图6本发明实施例4的系统适用性溶液的HPLC图谱。
图7本发明实施例5中各溶液HPLC对比图谱。
具体实施方式
下面将结合具体实施例、对比例和试验例对本发明进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1常规高效液相色谱手性柱对L-苹果酸中对映异构体的分离。
试验例1
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK IC (4.6*250mm，5μm）；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为0.5ml/min；以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（80:20:0.1）为流动相。等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-三氟乙酸（80:20:0.1）]：取三氟乙酸100μl，正己烷800ml和异丙醇200ml，混匀，即得。
D-苹果酸贮备液：D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
D-苹果酸定位溶液：量取D-苹果酸贮备液1.0ml，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
富马酸贮备液：富马酸5mg，置5ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
马来酸贮备液：马来酸5mg，置5ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
混合溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，加富马酸贮备液和马来酸贮备液0.1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取混合溶液、富马酸、马来酸贮备液及D-苹果酸定位溶液各100μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。结果如图1所示，结果显示在此色谱条件下，各成分出峰顺序为富马酸、L-苹果酸、马来酸、D-苹果酸；富马酸在4.8min出峰，L-苹果酸在11.8min出峰，马来酸在12.5min出峰，D-苹果酸在12.5min出峰，L-苹果酸的降解杂质马来酸与D-苹果酸峰重叠，两者无法有效分离，专属性差。因富马酸出峰较快，后续研究中混合溶液中不对富马酸进行定位研究。
实施例2 本发明所述检测方法流动相的筛选
试验例1 ：流动相比例的筛选1
实验目的：选用正己烷-异丙醇-三氟乙酸，考察不同流动相比例对D-苹果酸检测的影响，选取合适的条件用于D-苹果酸检测。
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK IC (4.6*250mm，5μm）；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为0.5ml/min；以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1）为流动相。等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1）]：取三氟乙酸100μl，正己烷850ml和异丙醇150ml，混匀，即得。
D-苹果酸贮备液：D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
马来酸贮备液：马来酸5mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
系统适用性溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
马来酸定位溶液：取马来酸贮备液0.1ml，至10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取系统适用性溶液及马来酸定位溶液100μl并注入液相色谱仪，在以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1）为流动相条件下检测，记录色谱图。图2为采用正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1）为流动相的系统适用性溶液检测得到的HPLC对比图谱。结果显示，当流动相的比例为正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85:15:0.1），马来酸的保留时间依旧与D-苹果酸保留时间相近，分离度较差。
试验例2 ：流动相比例的筛选2
实验目的：选用正己烷-异丙醇-三氟乙酸，添加甲醇或乙醇为流动相、考察不同流动相比例对D-苹果酸检测的影响，选取合适的条件用于D-苹果酸检测。
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK IC (4.6*250mm，5μm）；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为0.5ml/min；以正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）或正己烷-异丙醇-甲醇-三氟乙酸（85:10:5:0.1）为流动相。等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）]：取三氟乙酸100μl，正己烷850ml和异丙醇130ml和乙醇20ml，混匀，即得。
流动相[正己烷-异丙醇-甲醇-三氟乙酸（85:10:5:0.1）]：取三氟乙酸100μl，正己烷850ml和异丙醇100ml和甲醇50ml，混匀，即得。
D-苹果酸贮备液：D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
马来酸贮备液：马来酸5mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
系统适用性溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
马来酸定位溶液：精密量取马来酸贮备液0.1ml，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
取系统适用性溶液及马来酸定位溶液各100μl并注入液相色谱仪，图3~图4为采用正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）或正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）对系统适用性溶液检测得到的HPLC对比图谱。结果显示，当流动相的比例为正己烷-异丙醇-甲醇-三氟乙酸（85:10:5:0.1），马来酸的保留时间为8.3 min，L-苹果酸的保留时间为8.7 min，D-苹果酸的保留时间为9.2 min，分离度为2.1，但基线波动较大，不予采用；当流动相的比例为正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1），马来酸保留时间为14.1min，L-苹果酸保留时间为14.5 min，D-苹果酸保留时间为16.7 min，D-苹果酸相邻峰的分离度为3.0，分离情况良好。同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
试验例3：不同酸浓度的筛选
实验目的：考察不同酸浓度对D-苹果酸检测的影响，选取合适的条件用于L-苹果酸中D-苹果酸检测。
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK IC (4.6*250mm，5μm）；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为0.6ml/min；以正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）或（85:13:2:0.2）为流动相。等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）]：取三氟乙酸100μl，正己烷850ml和异丙醇130ml和乙醇20ml，混匀，即得。
流动相[正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.2）]：取三氟乙酸200μl，正己烷850ml和异丙醇130ml和乙醇20ml，混匀，即得。
D-苹果酸贮备液：D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
D-苹果酸定位溶液：精密量取D-苹果酸贮备液50μl，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
系统适用性溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
取系统适用性溶液和D-苹果酸定位溶液100μl并注入液相色谱仪，图5~图6为采用正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.1）或正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.2）对系统适用性溶液检测得到的HPLC对比图谱。当使用三氟乙酸浓度为0.1%和0.2%时，L-苹果酸在13min出峰，D-苹果酸在14min出峰，两者能有效分离，从图5可见，采用0.2%三氟乙酸，D-苹果酸峰响应有所增加，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
实施例3本发明所述检测方法L-苹果酸中D-苹果酸的检测分离。
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为DAICEL CHIRALPAK IC，4.6×250mm，5μm；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为215nm；流动相流速为0.5ml/min；以正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:12:3:0.2）为流动相，等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:13:2:0.2）]：取三氟乙酸200μl，正己烷850ml和异丙醇130ml和乙醇20ml，混匀，即得。
D-苹果酸贮备液：D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
D-苹果酸定位溶液：量取D-苹果酸贮备液1.0ml，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
富马酸贮备液：富马酸5mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
马来酸贮备液：马来酸5mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
富马酸和马来酸定位溶液：分别取富马酸和马来酸贮备液各1.0ml，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度
混合溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，加富马酸贮备液和马来酸贮备液0.1ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
混合溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
取空白溶剂（即流动相）、马来酸定位溶液、富马酸定位溶液、D-苹果酸定位溶液、混合溶液、供试品溶液及系统适用性溶液100μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图4为采用本发明的检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，在本发明的色谱条件下，L-苹果酸在14.5min出峰，D-苹果酸在16.7min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
实施例4本发明所述检测方法L-苹果酸中D-苹果酸的检测分离。
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为DAICEL CHIRALPAK IC，4.6×250mm，5μm；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为215nm；流动相流速为0.5ml/min；以正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:12:3:0.2）为流动相，等度采集30min。
实验步骤：
流动相[正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸（85:12:3:0.2）]：取正己烷850ml、异丙醇120ml、乙醇30ml、三氟乙酸0.2ml，混匀，即可。
D-苹果酸贮备液： D-苹果酸10mg，置10ml量瓶，用流动相稀释至刻度。
D-苹果酸对照品：精密量取D-苹果酸贮备液1.0ml，至100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。
系统适用性溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相使溶解，加D-苹果酸贮备液0.1ml，用流动相剂稀释至刻度，摇匀，即得。
回收率溶液：取L-苹果酸10mg，置10ml量瓶中，平行称取3份，加适量流动相使溶解，分别加D-苹果酸贮备液800μl、1000μl、1200μl，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。依次为回收率溶液（1）、（2）、（3）。
L-苹果酸供试品溶液：取L-苹果酸10mg，至10ml量瓶中，加流动相溶解并用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
空白溶液：即流动相。
取空白溶液、D-苹果酸对照品溶液、L-苹果酸供试品溶液、回收率溶液各100μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图6为本发明的检测方法检测得到上述溶液的HPLC对比图谱。结果显示，在本发明的色谱条件下，空白溶液不干扰D-苹果酸的检测，D-苹果酸与相邻峰之间能有效分离，D-苹果酸回收率良好，3份回收率溶液的回收率分别为92.1%、95.3%、91.8%，检测灵敏度高，限度浓度（1%）的D-苹果酸的信噪比高达50，远高于定量限。

Claims (6)

1.L-苹果酸中对映异构体（D-苹果酸）的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用纤维素二氯苯基氨基甲酸脂为填充剂的色谱柱。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述高效液相色谱法采用等度或者梯度洗脱，流动相为不同比例的正己烷、异丙醇、甲醇、乙醇及三氟乙酸。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述三氟乙酸的浓度为0.2%。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述高效液相色谱法采用等度洗脱，流动相中正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸的体积比为（85:12:3:0.2）。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于流动相的流速为0.4~0.6ml/min，色谱柱柱温是32~38℃，检测器为紫外检测器，检测波长为200~400nm。
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