CN112870331B

CN112870331B - 一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112870331B
Application number: CN202110202812.4A
Authority: CN
Inventors: 胡章; 洪鹏志; 卢思彤; 孔松芝; 程瑜; 张岭誉; 张兆宇; 廖铭能
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2021-02-23
Filing date: 2021-02-23
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2041-02-23
Also published as: CN112870331A; WO2022179050A1; LU500771B1

Abstract

本发明公开了一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域，该组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚10～30份、海藻酸钠2～6份、鲍鱼肽30～55份和亚精胺0.5～3份；本发明具有良好的产品稳定性，安全无毒，对酒精性肝损伤具有显著的保肝护肝效果，工艺简单，易于工业化生产。

Description

一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用。

背景技术

酒是人类生活中的主要饮料之一。适量饮酒具有促进血液循环、疏通经络、益气养胃、祛痛、止湿等功效。然而，随着经济的发展和社交活动的增加，爱好饮酒的人群比例不断上升，酒精引起的疾病和问题日益严重。长期过度饮酒则会引起慢性酒精中毒，导致酒精性肝病，使人体产生心肌乏力、黏膜损伤、血管变脆、肾功能衰竭等病理变化，还会引起机体生理功能紊乱，危害人体健康。

酒精进入人体后，首先在乙醇脱氢酶的作用下转化为乙醛，随之通过乙醛脱氢酶进一步氧化成乙酸和水，最终进入三羧酸循环系统。当机体摄入大量的酒精时，酒精本身不会对身体造成危害，但在代谢过程中形成的乙醛和自由基比如超氧阴离子基团、高活性氢氧自由基却能对身体造成不良影响。乙醛能够与细胞中的多种蛋白质结合，使得肝细胞内堆积大量的蛋白质和脂质，最终导致细胞病变坏死，出现炎症反应，引发酒精性肝炎；乙醛还能抑制DNA修复和甲基化，通过转化生长因子诱导肝星状细胞活化，促进炎症并破坏组织再生和修复功能，进而促进肝纤维化的病理变化。酒精性肝损伤的发病机制复杂，现代病理学研究发现“二次打击”学说即氧化应激和炎症性反应，其中氧化应激是酒精性肝损伤发生与发展的关键因素。因此，制备一种能快速清除饮酒后机体产生的大量自由基的产品，进而降低酒精对人体的副作用，具有一定的市场价值。

现有技术中公开了多种防治酒精性肝损伤的物质，如中国专利CN202010728038.6公开了一种防治酒精性肝损伤的西洋参和枳椇子组合物，通过改善脂质代谢和提高抗氧化性对酒精性肝损伤具有保护作用。中国专利CN 201210046322.0公开了一种能够缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌，具有抗氧化、缓解慢性酒精性肝损伤的作用。中国专利CN 201811162358.9公开了防治酒精性肝损伤的多肽，主要由具有抗氧化和护肝活性的多肽来起到防治酒精性肝损伤的功效。中国专利CN 201811339367.0公开了防治酒精性肝损伤的盐酸去亚甲基四氢小檗碱，主要通过抗炎和抗氧化活性治疗酒精性肝病。这些产品多数通过抗氧化途径来防治酒精性肝损伤，但抗氧化剂具有不稳定性，不能完全确保有效成分在体内的抗氧化活性，不能快速清除体内过量的自由基，见效慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的现有防治酒精性肝损伤产品中抗氧化活性物质不稳定及作用途径单一的问题，该组合物配方简单，稳定性好，抗氧化性强，保肝护肝效果好。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚10～30份、海藻酸钠2～6份、鲍鱼肽30～55份和亚精胺0.5～3份。

进一步地，以重量份计，所述组合物包括以下组分：海藻多酚20份、海藻酸钠4份、鲍鱼肽40份和亚精胺1.5份。

本发明还提供一种上述的防治酒精性肝损伤的组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.取海藻酸钠加入水中配制成海藻酸钠溶液，调节溶液pH 6.0-7.5，加入亚精胺，室温搅拌5-8小时，冰水浴处理，待溶液体系降温至5-10℃，加入海藻多酚，继续搅拌1-3小时，冷冻干燥，液氮碎化，得到海藻多酚复合粉粒；

S2.用水溶解鲍鱼肽，制成鲍鱼肽溶液，在搅拌状态下加入所述海藻多酚复合粉粒，混悬均匀，冷冻干燥，即得所述防治酒精性肝损伤的组合物。

进一步地，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为1％-3.5％；所述鲍鱼肽溶液的质量浓度为18％-26％。

进一步地，所述海藻酸钠溶液pH调节至6.5。

本发明还提供一种上述的组合物在制备治疗/预防酒精性肝损伤的药物中的应用。

本发明还提供一种防治酒精性肝损伤的药物制剂，包括上述的组合物，及药学上可接受的辅料。

进一步地，所述药物制剂为胶囊剂，所述辅料包括乳糖、玉米淀粉和滑石粉；

所述胶囊剂中各组分的质量分数为：

所述组合物10-30wt％、乳糖10-20wt％、玉米淀粉50-60wt％和滑石粉5-15wt％。

进一步地，所述药物制剂为片剂，所述辅料包括玉米淀粉、滑石粉和硬脂酸镁；

所述片剂中各组分的质量分数为：

所述组合物10-20wt％、玉米淀粉65-75wt％、滑石粉11-17wt％和硬脂酸镁0.5-2wt％。

进一步地，所述药物制剂为颗粒剂，所述辅料包括玉米淀粉、羟甲基纤维素钠和硬脂酸镁；

所述颗粒剂中各组分的质量分数为：

所述组合物5-15wt％、玉米淀粉74-84wt％、羟甲基纤维素钠5-15wt％和硬脂酸镁0.5-2wt％。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明将具有抗氧化、抗菌功能的海藻多酚和富含多种营养、多重生物功效的鲍鱼肽组合，通过氢键、静电、π-π堆叠等多重作用，二者形成复合物；经动物模型试验证明，该组合物在酒精性肝损伤的防治中发挥多途径、多靶点、协同增效作用。

(2)本发明利用海藻酸盐的水凝胶特性，在胃中低pH环境下形成海藻酸胶质，包裹海藻多酚和鲍鱼肽复合物，避免其在体内复杂环境中活性的丧失；在肠道中海藻酸转换为离子盐状态，缓控释放海藻多酚和鲍鱼肽，发挥持久活性效应。

(3)本发明中添加的亚精胺，利用其“三胺”特性，分别与海藻酸盐和海藻多酚相连接，对海藻多酚形成“伞”式保护结构，使得海藻多酚的稳定性、物理性状及口感均得到改善，有利于其发挥在酒精性肝损伤中的保肝护肝作用。

(4)本发明原料均来自天然食材，绿色安全；制备工艺简单，易于工业化生产；而且安全无毒，服用方便，无不良气味，依从性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物对DPPH自由基清除能力。

图2是本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物对OH自由基清除能力。

图3是本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物的抗氧化稳定性。

图4是本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物对小鼠肝脏指数的影响。

图5是本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物对小鼠肝脏病理切片的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

作为本发明的一方面，本实施方式旨在提供一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚10～30份、海藻酸钠2～6份、鲍鱼肽30～55份和亚精胺0.5～3份。

其中，海藻多酚是从海藻中提取出来的多酚类化合物，主要成分是间苯三酚及其衍生物，其羟基是具有抗氧化活性的重要基团。由于海藻多酚具有直接或间接清除自由基和活性氧的能力，被认为是预防或减少慢性疾病的天然抗氧化剂。但多酚类物质稳定性差，体内生物利用度低。

海藻酸钠是一类从海洋中提取的生物高分子材料，具有生物相容性、亲水性、无毒等优点，可在温和条件下通过电离作用形成水凝胶，通常采用物理交联、化学交联、酶交联等方式制备海藻酸水凝胶，广泛应用于药物活性肽和蛋白质的控制释放系统。

鲍鱼肽是鲍鱼肉经过酶解制成，其氨基酸种类齐全、配比合理，被誉为海洋“软黄金”。鲍鱼中EPA、DHA、微量元素、牛磺酸及超氧化物歧化酶等营养成分丰富，具有抗氧化、增强免疫力、抗疲劳等作用。

亚精胺是一种天然存在的多胺，是一种安全、高效的细胞自噬诱导剂，几乎存在于所有细胞中，具有抗衰老、抗癌、保护心血管和神经等作用。亚精胺有利于辅助药物输送，提高药物分子的水溶解度、稳定性和膜渗透能力从而进一步提高药物在生物体内的吸收。

本发明是将海藻酸盐和亚精胺与具有抗氧化、抗菌功能的海藻多酚通过共混，制成海藻多酚颗粒。亚精胺分子含有三个氨基，两端和中间的氨基可以分别与海藻酸钠、海藻多酚相连接，对海藻多酚形成“伞”式保护结构，提高产品的稳定性。海藻多酚颗粒和富含多种营养与多重功效的鲍鱼肽通过氢键、静电、π-π堆叠等多重非共价键作用，形成复配组合物，通过多种途径、多个靶点，对酒精性肝损伤的防治产生对协同增效作用。当组合物进入胃中，海藻酸钠在胃酸的作用下形成海藻酸胶体，包裹海藻多酚和鲍鱼肽，避免在体内复杂环境下活性的丧失；在肠道中海藻酸转换为离子盐状态，持续释放海藻多酚和鲍鱼肽，发挥持久活性，提高其生物利用度。

作为一优先的实施方式，所述防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚20份、海藻酸钠4份、鲍鱼肽40份和亚精胺1.5份。

进一步优选，所述海藻多酚来源于可食用大型海藻，包括海带、昆布、马尾藻、龙须菜、羊栖菜、裙带菜或江蓠。所述海藻多酚的提取方法可按本领域海藻多酚的常规提取方法进行。进一步优选，本发明实施例所采用的海藻多酚中总酚重量含量不少于30％。

进一步优选，所述鲍鱼肽是采用鲍鱼肉经生物酶解制备得到的复合肽。所述鲍鱼肽的酶解方法可按本领域的常规方法酶解进行。进一步优选，本发明实施例所采用的鲍鱼肽的分子量分布范围为：分子量>3.0kDa多肽含量为2.15％，分子量1.0～3.0kDa多肽含量为16.59％，分子量<1.0kDa多肽含量为81.26％。

作为另一实施方式，所述海藻多酚也可购自山东洁晶集团股份有限公司，所述鲍鱼肽也可购自山东海龙元生物科技有限公司。

作为本发明的另一方面，本实施方式还提供一种上述的防治酒精性肝损伤的组合物的制备方法，包括以下步骤：

在所述防治酒精性肝损伤的组合物的制备过程中，海藻酸钠溶液和鲍鱼肽溶液的浓度对组合物的稳定性和协同增效作用有重要影响。

作为一优先的实施方式，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为1％-3.5％，更优选为1.5％；若海藻酸钠溶液的质量浓度过大(＞3.5％)，容易粘团，难以形成均匀的海藻多酚颗粒，功效差；若海藻酸钠溶液的质量浓度过小(＜1％)，与亚精胺作用弱，达不到对海藻多酚的保护效果。

作为一优先的实施方式，所述鲍鱼肽溶液的质量浓度为18％-26％，更优选为22％；若鲍鱼肽溶液的质量浓度过大(＞26％)，易受微生物感染，丧失活性；若鲍鱼肽溶液的质量浓度过小(＜18％)，与海藻多酚的协同作用减弱，达不到防治酒精性肝损伤的效果。

作为一优先的实施方式，在步骤S1中，需要严格控制溶液的pH范围。本发明调节pH的方法为常规方法，由于海藻酸钠溶液呈弱碱性，因此，本发明调节pH采用的为0.1mol/L的HCl溶液。若溶液的pH过小(＜6.0)，则酸性过强，海藻酸钠生成海藻酸胶体析出；若溶液的pH过大(＞7.5)，亚精胺难以通过静电作用与海藻酸钠和海藻多酚形成复合“伞”式结构。因此，本实施方式中，所述海藻酸钠溶液pH优选为6.0-7.5，更优选为6.5。

作为说明，本发明中所涉及的室温，也成为常温或者一般温度，一般定义为25℃，本领域技术人员可对其进行合理调整，其也在本发明的保护范围内。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的防治酒精性肝损伤的组合物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚20份、海藻酸钠4份、鲍鱼肽40份和亚精胺1.5份。

所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.按所述重量份数，取海藻酸钠加入蒸馏水中配制成1.5wt％海藻酸钠溶液，调节溶液pH 6.5，加入亚精胺，室温搅拌6.5小时，冰水浴处理，待溶液体系降温至8℃，加入海藻多酚，继续搅拌2小时，冷冻干燥，液氮碎化，得到海藻多酚复合粉粒；

S2.按所述重量份数，用蒸馏水溶解鲍鱼肽，制成22wt％鲍鱼肽溶液，在搅拌状态下，加入S1所述海藻多酚复合粉粒，混悬均匀，冷冻干燥，即可得到所述组合物。

实施例2

一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚15份、海藻酸钠3份、鲍鱼肽35份和亚精胺1份。

所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.按所述重量份数，取海藻酸钠加入蒸馏水中配制成2.0wt％海藻酸钠溶液，调节溶液pH 7.0，加入亚精胺，室温搅拌7小时，冰水浴处理，待溶液体系降温至6℃，加入海藻多酚，继续搅拌1.5小时，冷冻干燥，液氮碎化，得到海藻多酚复合粉粒；

S2.按所述重量份数，用蒸馏水溶解鲍鱼肽，制成24wt％鲍鱼肽溶液，在搅拌状态下，加入S1所述海藻多酚复合粉粒，混悬均匀，冷冻干燥，即可得到所述组合物。

实施例3

一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚10份、海藻酸钠2份、鲍鱼肽30份和亚精胺0.5份。

所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.按所述重量份数，取海藻酸钠加入蒸馏水中配制成1wt％海藻酸钠溶液，调节溶液pH 6.0，加入亚精胺，室温搅拌5小时，冰水浴处理，待溶液体系降温至5℃，加入海藻多酚，继续搅拌1小时，冷冻干燥，液氮碎化，得到海藻多酚复合粉粒；

S2.按所述重量份数，用蒸馏水溶解鲍鱼肽，制成18wt％鲍鱼肽溶液，在搅拌状态下，加入S1所述海藻多酚复合粉粒，混悬均匀，冷冻干燥，即可得到所述组合物。

实施例4

一种防治酒精性肝损伤的组合物，以重量份计，包括以下组分：海藻多酚30份、海藻酸钠6份、鲍鱼肽55份、亚精胺3份。

所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.按所述重量份数，取海藻酸钠加入蒸馏水中配制成3.5wt％海藻酸钠溶液，调节溶液pH 7.5，加入亚精胺，室温搅拌8小时，冰水浴处理，待溶液体系降温至10℃，加入海藻多酚，继续搅拌3小时，冷冻干燥，液氮碎化，得到海藻多酚复合粉粒；

S2.按所述重量份数，用蒸馏水溶解鲍鱼肽，制成26wt％鲍鱼肽溶液，在搅拌状态下，加入S1所述海藻多酚复合粉粒，混悬均匀，冷冻干燥，即可得到所述组合物。

对比例1

与实施例1的不同之处仅在于，用维生素C代替海藻多酚。

对比例2

与实施例1的不同之处仅在于，用精胺代替亚精胺。

对比例3

与实施例1的不同之处仅在于，直接原料共混，具体如下：

所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

按所述重量份数，取海藻酸钠、亚精胺、海藻多酚和鲍鱼肽原料，加入蒸馏水，混悬均匀，冷冻干燥，即可得到所述组合物。

对比例4

与实施例1的不同之处仅在于，用牡蛎肽代替鲍鱼肽。

应用例1防治酒精性肝损伤的组合物的抗氧化实验

1、实验方法

(1)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的测定

将2.0mL不同质量浓度的样品溶液(实施例1～4组和对比例1～4组制备得到的组合物)与2mL DPPH无水乙醇溶液混合，室温下避光放置60min后，在517nm处测定溶液的吸光度。以蒸馏水代替样品溶液作空白对照，按下式(1)计算DPPH自由基的清除率，用IC₅₀表示清除效果。

其中，A_X为样品的吸光度，

为空白对照的吸光度。

(2)羟自由基清除能力的测定

在同一比色管中分别加入浓度为1mL H₂O₂溶液(8.8mmol/L)、1mL FeSO₄溶液(9mmol/L)和12mL不同质量浓度的样品溶液(实施例1～4组和对比例1～4组制备得到的组合物)，再加入1mL水杨酸的乙醇溶液(9mmol/L)，摇匀，置37℃水浴30min，在波长510nm处测定吸光度；以蒸馏水替代样品溶液作空白对照。羟自由基清除率按公式(1)计算，用IC₅₀表示清除效果。

2、实验结果

(1)DPPH自由基清除效果

IC₅₀值越小，清除自由基能力越强。维生素C(Vc)是一种强抗氧化剂，作为阳性对照。防治酒精性肝损伤的组合物的DPPH自由基清除效果如图1所示，实施例1～4组的IC₅₀都接近维生素C组，表现出强的DPPH自由基清除效果，尤以实施例1的DPPH自由基清除能力最强。虽然对比例1组也表现出与实施例1～4组接近的DPPH自由基清除效果，但对比例2-4组的DPPH自由基清除能力远远不如实施例1～4组。

(2)羟自由基清除效果

维生素C(Vc)是一种强抗氧化剂，作为阳性对照。防治酒精性肝损伤的组合物的羟自由基清除效果如图2所示，实施例1～4组的IC₅₀差不多接近维生素C组，表现出强的羟自由基清除效果，尤以实施例1的羟自由基清除能力最强。虽然对比例1组也表现出与实施例1～4组接近的羟自由基清除效果，但对比例2-4组的羟自由基清除能力远远不如实施例1～4组。

综合以上两个实验结果，实施例1-4组都表现出强的自由基清除效果，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物具有强的抗氧化活性，尤以实施例1组抗氧化活性最强。本发明组合物的配方或者制备方法改变，都达不到预期的抗氧化效果。

应用例2防治酒精性肝损伤组合物的抗氧化稳定性实验

采用铁离子还原/抗氧化能力法(FRAP法)检测组合物存储期间的总抗氧化能力。

样品储存：样品存储于棕色瓶中，室温条件下放置。样品每隔一定时间取样，进行总抗氧化能力测试。

测试方法：取0.02mL FeSO₄溶液，加入0.18mL FRAP液(现配现用)，混匀，37℃水浴10min，采用紫外-可见分光光度计在593nm测吸光值。以FeSO₄溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，建立FeSO₄当量标准曲线。以V_C溶液为阳性对照，根据标准曲线计算出FeSO₄当量。根据FeSO₄当量计算出各样品的V_C相对百分比。

防治酒精性肝损伤的组合物的抗氧化稳定性结果如图3所示，由于多酚性质的不稳定性，多酚易被氧化，长期储存中极易变质，对比例3组合物的总抗氧化能力在储存过程中几乎呈直线下降，而实施例1的组合物在相同的环境中，在5天内随着储存时间的延长，其总抗氧化能力几乎保持稳定状态。由此可见，本发明组合物的配方和制备方法，可有效提高组合物的抗氧化稳定性。

应用例3防治酒精性肝损伤组合物的护肝功效测定

1、实验方法

实验动物：昆明雄性小鼠，6-8周龄，体重18-22克，SPF级，动物饲养条件：(25±1)℃，相对湿度：(55±5)％。

实验分组：取132只小鼠随机分为11组，每组12只，分为空白对照组、模型组、水飞蓟素阳性对照组，实施例1～4组和对比例1～4组。

各组小鼠每日按照剂量10g/kg·BW(体重)灌胃小鼠相对应体积的受试物，空白对照组和模型组灌胃蒸馏水，连续6天，第6天给受试物后开始禁食不禁水24h。24h后继续给受试物，并在60min后按13mL/kg·BW的剂量分别给各组小鼠灌胃56度红星二锅头白酒，空白对照组灌胃蒸馏水，60min后进行样本采集：

(1)摘眼球取血，静置至分层，冷冻离心，转速1000rpm，4℃离心15min取血清，采用速度法以全自动生化分析仪测定小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量。

(2)小鼠解剖后，取出肝脏，用预冷的生理盐水洗去表面的血水，用滤纸吸干后快速称重，用公式计算肝脏指数：

肝脏指数(％)＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％

(3)快速解剖肝脏，取肝左叶组织固定于4％多聚甲醛中，梯度乙醇逐步脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，用普通光学显微镜观察。

(4)快速解剖肝脏，-80℃保存，制备成10％肝组织匀浆，按照相应试剂盒要求，严格操作，测定肝组织匀浆中乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的含量。

(5)快速解剖肝脏，-80℃保存，制备成10％肝组织匀浆，按照相应试剂盒要求，严格操作，测定抗氧化系统中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量。

2、实验结果

(1)肝脏指数

肝脏指数对肝脏的健康状况的评定有一定的意义，小鼠服用防治酒精性肝损伤的组合物的肝脏指数变化如图4所示。当肝脏指数增加时，很可能是肝脏发生了肿大，出现增生、充血、水肿等病变。小鼠造模后，模型组肝脏指数显著升高，与空白对照组比较，具有显著差异(p＜0.01)，表明造模成功。与模型组对比，实施例1～4组的小鼠肝脏指数均显著降低，具有统计学差异(p＜0.01)，其中实施例1组的效果更优，几乎接近空白对照组水平，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物能有效地改善肝脏指数，减少肝脏出现增生、水肿等病变，对酒精性肝损伤具有显著的防治作用。与模型组对比，虽然对比例1～4组的小鼠肝脏指数都有降低，但无统计学差异，且都高于阳性对照组。由此说明，本发明组合物的配方或者制备方法改变，都不能有效地改善肝脏指数。

(2)HE染色结果

通过对肝脏组织切片的HE染色，能够直观地观察出小鼠肝脏组织病理的变化。如图5所示(HE染色，放大倍数×200)，在空白对照组中，肝小叶的结构清楚，肝细胞呈放射状排列且排列整齐，肝窦正常，细胞核结构清晰。相比之下，酒精灌胃后导致小鼠出现严重的肝损伤，酒精模型组小鼠肝细胞排列无序，肝窦变窄、分散，可见血管充血等病理改变。实施例1～4组肝细胞均有明显地不同程度地正常化，其中实施例1组肝细胞尤为明显，肝细胞排列逐渐趋于整齐，肝小叶的结构有所恢复。说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物可以有效缓解酒精引起的肝细胞损伤。

(3)ALT和AST分析结果

酒精性肝损伤的早期阶段主要表现为肝细胞膜通透性增加，而释放入血的ALT和AST活性含量则会显著提高。防治酒精性肝损伤的组合物对小鼠ALT和AST活性含量的影响如表1所示，模型组中，小鼠血清中ALT和AST含量显著高于空白对照组，具有显著性差异(p＜0.01)。与模型组对比，实施例1～4组小鼠血清中ALT和AST含量显著降低，具有统计学差异(p＜0.01)，其中实施例1组的效果更优，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物能有效地降低血清中ALT和AST含量，缓解肝损伤。与模型组对比，对比例1～4组小鼠血清中ALT和AST含量的变化无统计学差异，由此说明，本发明组合物的配方或者制备方法改变，对小鼠血清中ALT和AST含量无明显影响，对酒精性肝损伤无防治效果。

表1各组小鼠血清中ALT和AST浓度(U/L)

注：与空白对照组比较，^##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01。

(4)ALDH和ADH结果分析

ADH和ALDH是乙醇进入机体后主要的代谢酶，首先ADH催化乙醇转化为乙醛，进而ALDH催化乙醛转化为乙酸，最后进入三羧酸循环，生成二氧化碳和水。由于生成的乙醛对肝细胞具有直接毒害作用，乙醇的过量摄入在一定程度上会抑制肝脏ADH和ALDH活力。当机体内的细胞防御体系不能及时清除乙醛时，其残留的乙醛会导致肝细胞的损伤或炎症反应的发生、细胞外基质的产生和纤维化的形成。防治酒精性肝损伤的组合物对小鼠肝脏ADH及ALDH活性影响结果见表2。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏ADH和ALDH活力下降显著，具有统计学差异(p＜0.01)，表明急性大量酒精摄入了抑制肝脏ADH和ALDH活力，极易造成酒精性肝损伤。与模型组对比，实施例1～4组小鼠肝脏ADH和ALDH活力显著提高(p＜0.01)，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物干预均能够提高小鼠肝脏ADH和ALDH活力，加速乙醇代谢分解，催化乙醛进一步氧化成乙酸，减缓乙醇及其代谢产物直接毒害小鼠肝脏，从而保护酒精诱导所致小鼠急性肝损伤。与模型组对比，在对比例1～4中，除了对比例3外，小鼠肝脏ADH和ALDH活力的变化无统计学差异，由此说明，本发明组合物的配方改变，对小鼠肝脏ADH和ALDH活力无明显影响，对酒精性肝损伤无防治效果。

表2各组小鼠肝脏中ADH和ALDH含量(U/mg-protein)

注：与空白对照组比较，^##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01。

(4)CAT、SOD、GSH-Px和MDA结果分析

酒精会在人体代谢中产生大量的活性氧物质(ROS)，影响机体的抗氧化系统，导致酒精性肝损伤。以多种抗氧化酶作为评价小鼠肝脏氧化应激水平的参数，结果如表3所示。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px和CAT含量显著降低，具有统计学差异(p＜0.01)，表明造模后小鼠肝脏氧化应激能力降低，容易造成酒精性肝损伤。与模型组对比，实施例1～4组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px和CAT含量显著提高(p＜0.01)，其中实施例1组尤以为甚，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物能显著降低酒精引起小鼠肝脏中过氧化物水平，增强机体抗氧化能力。MDA是自由基作用于脂质过氧化的产物，通过测定MDA的量可以反映体内脂质过氧化的程度，实施例1～4组小鼠肝脏组织中MDA含量显著低于模型对照组(p＜0.01)，其中实施例1组MDA含量最低，说明本发明制备的防治酒精性肝损伤的组合物能降低体内脂质过氧化的程度，减轻酒精性肝损伤。

表3各组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px、CAT和MDA含量

注：与空白对照组比较，^##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

应用例4急性毒性实验

动物：取健康小鼠，体重18-22g，雌雄各半，共20只，随机分为实验组和空白对照两组。

受试物：以实施例1的组合物作为受试物。

实验方法：在预实验中，未能测出半数致死量，故选用上述实验给药量进行试验。以小鼠的体重为准，按10g/kg的剂量，每24h灌胃一次，连续灌胃实验组小鼠2周,空白对照组灌胃蒸馏水，在饲喂期间均自由饮水和觅食，实验期间观察小鼠的活动状态、饮食、粪便、呼吸、体重及死亡情况。

实验结果：实验组小鼠灌胃受试物2周内无一例死亡，与对照组相比，体重变化无显著差异，进食和饮水均无异常，且小鼠精神状态良好，活泼好动。将动物处死后，肉眼观察各主要脏器无异常现象。结果表明，本发明的防治酒精性肝损伤组合物口服应用，对动物无明显损害，未发现对机体产生的毒性反应，安全无毒。

实施例5一种防治酒精性肝损伤的片剂

该防治酒精性肝损伤的片剂，以质量分数计，包括以下组分：

实施例6一种防治酒精性肝损伤的片剂

实施例7一种防治酒精性肝损伤的片剂

实施例8一种防治酒精性肝损伤的胶囊剂

该防治酒精性肝损伤的胶囊剂，以质量分数计，包括以下组分：

实施例9一种防治酒精性肝损伤的胶囊剂

实施例10一种防治酒精性肝损伤的胶囊剂

实施例11一种防治酒精性肝损伤的颗粒剂

实施例12一种防治酒精性肝损伤的颗粒剂

实施例13一种防治酒精性肝损伤的颗粒剂

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。