CN112852775A

CN112852775A - 一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN112852775A
Application number: CN202011580982.8A
Authority: CN
Inventors: 李赛妮; 章卫民; 许丽琼; 陈玉婵; 叶伟; 李浩华
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112852775B

Abstract

本发明公开了一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示将乙酰转移酶GliK的编码基因克隆入大肠杆菌表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的乙酰转移酶GliK，通过诱导表达得到深海真菌FS140新型乙酰转移酶GliK纯化蛋白，对其进行酶学性质测定结果表明新型乙酰转移酶GliK最适反应温度为35℃，最适PH值为7，热稳定性较好，该酶反应动力学参数Km和Vmax的值分别为302.8μM和4092U/mg。通过对GliK的酶学性质分析测定发现来源于深海真菌G.pallida FS140的GliK基因极有可能是一种新型的乙酰转移酶，在胶霉毒素酰基化过程中发挥关键作用。这为后期通过转录调控和异源表达以提升乙酰胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。

Description

一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用。

背景技术

胶霉毒素(gliotoxin，GT)是一种重要的疏水性真菌代谢产物，属于表聚硫代哌嗪二酮类化合物(Epidithiodiketopiperazines，ETPs)。ETPs是一类主要由真菌产生的活性次级代谢产物，其结构特征是都含有二硫键的二酮哌嗪(diketopiperazine，DKP)核心，具有广泛的生物活性，包括抗增殖、细胞毒、免疫抑制、抗病毒以及抗菌等生物活性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种深海真菌来源的新型乙酰转移酶GliK。

本发明的乙酰转移酶GliK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述乙酰转移酶GliK的乙酰转移酶基因GliK。

优选，所述的乙酰转移酶基因GliK的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供含有上述的乙酰转移酶基因GliK的重组表达质粒，以及含有该重组表达质粒的重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供上述乙酰转移酶GliK在催化胶霉毒素得到乙酰胶霉毒素中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的深海真菌G.pallida FS140分离自南海沉积物，本课题组前期对该菌进行了转录组测序并对胶霉毒素生物合成相关基因进行了注释。鉴于目前关于深海真菌G.pallidaFS140的胶霉毒素生物合成基因GliK的功能相关研究尚未见报道，而转录组测序及文献调研结果也表明，编码胶霉毒素的生物合成基因GliK是个假定蛋白，在GT生物合成途径中的具体功能还不清楚。因此本发明通过载体构建大量表达，纯化获得深海真菌FS140新型乙酰转移酶基因GliK蛋白，并进行酶学性质测定，从而为后期通过转录调控和异源表达以提升乙酰胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。

本发明的深海真菌G.pallida FS140，其公开于文献：Zhang-Hua Sun,JiangyongGu,We i Ye,Liang-Xi Wen,Qi-Bin Lin,Sai-Ni Li,Yu-Chan Chen,Hao-Hua Li,Wei-MinZhang.G eospallins A–C:New Thiodiketopiperazines with Inhibitory Activityagainst Angiotensin-Conv erting Enzyme from a Deep-Sea-Derived FungusGeosmithia pallida FS140.Marine Drugs 20 18,16(12),464.https://doi.org/10.3390/md16120464。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1为深海真菌FS140新型乙酰转移酶基因GliK序列的获得：其中A为重组载体pET30a-GliK构建载体图谱；B为以FS140 cDNA文库为模板，基因GliK扩增产物的电泳图；

图2为纯化得到新型乙酰转移酶GliK蛋白验证；其中A为SDS-PAGE蛋白电泳图；B为Western-blot验证图，并经质谱验证；

图3为新型乙酰转移酶GliK的酶学性质测定结果图表。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本实施例中所用的YPD固体培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

实施例1深海真菌G.pallida FS140新型乙酰转移酶基因GliK表达载体构建与蛋白纯化

将深海真菌G.pallida FS140接种于YPD培养基平板，37℃培养72h，挑取新鲜的菌丝体，利用植物RNA提取试剂盒提取RNA，利用All-in-one RT Master Kit逆转录获得cDNA，保存于-20℃备用。通过转录组测序获得编码新型乙酰转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliK(GliK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：atgaccatacaactccctcacacacctgacagagaagaaggccctggtgcttctcctgcatgcaagttcaatgcaatccagacattccggtggttatgggacctagtcatcccaactagcgaccttactcaagaaaccggtcgatatcctccgaagacgacgatcgagagacggcgcgcatcaaccacagatagatcgctcgataaggacgaatacctagctgagaaggtcgcaggtcatcaggtcgaagaacatgtccccccggagaagaccgtcctctacctcgcgtacggctcgaatctggccgcggagaccttcctgggcaagcgaggcattaggcctctatcccagatcaacgttgtcgttcccggcctacgactaactttcgaccttcctgggttaccatacgttgagccatgcttcgcagcgactcggcactggactcatacaccaagagtaacacaaacagaaggaaatggaagtaatgaaggggtcgatgcagaagtgttggagaattcgtccctcgtgccacaggagaagaacgacatgcctctcgtcggcgtcgtgtatgaggtcactgtcgccgattatgccaagataatagccacagagggtggtgggcgcggataccgagacgtcgttgtcgattgctatccttttcccaaatcatacagtcccaccgatccggtccctgagtgccccgaaaccaaacccttcaagtcccacaccctcctctctccagccgacgacgcagtctcgggtctcctggccgcagggaagtcataccgacccgtccgacccaatcctggctacgcccagccctccgcttga)，使用引物pET30a-GliK-F:

(划线为NdeI识别序列)；

pET30a-GliK-R:

(划线为XhoI识别序列)。以菌株FS140 cDNA为模板，进行GliK的基因扩增，反应程序：98℃变性5min，以98℃20s，55℃15s，72℃20s反应35个循环后，72℃延伸7min，最后冷却至4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后(图1B)采用PCR产物纯化试剂盒纯化。然后采用限制性内切酶NdeI和XhoI对pET-30a载体进行双酶切。酶切产物经胶回收试剂盒回收，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112(Vazyme)同源重组试剂盒将克隆出的GliK片段重组至pET-30a载体中，转化至trans5α感受态中，利用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆测序验证，获得pET30a-GliK质粒(经过测序验证，如SEQ ID NO.1所示的乙酰转移酶基因GliK插入到了pET-30a中，载体图谱如图1A所示)。最后用终浓度为40％的甘油保藏菌种(菌液和甘油各800μL)，-80℃冻存。

分别取冻存的含有pET30a-GliK的trans5α菌液扩大培养至5mL的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床200rpm过夜振荡培养，提质粒，并分别取2μL重组载体pET30a-GliK转化至BL21(DE3)感受态中，培养12h，挑取单菌落，加入500μL加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养至浑浊，然后分别扩大培养至200mL，37℃摇床200rpm/min培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，各加入200μL的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导剂后，22℃摇床200rpm/min继续培养10h收集菌体沉淀，并分别溶解于25-30mL的1xPBS缓冲液中，并利用超声破碎仪进行细胞破碎(振幅30％，工作5s/停顿5s)至菌液澄清(冰上破碎)，12,000rpm 4℃离心15min，破碎后轻轻取上清放置于新的50mL离心管中，用0.22μm滤膜过滤，冰上保存。

镍柱纯化新型乙酰转移酶GliK蛋白操作方法：采用AKTA蛋白纯化仪，先用BufferA(pH 7.4，0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、20mM咪唑)平衡镍柱，然后以1mL/min流速进行上样；再用BufferA以1mL/min流速冲洗掉镍柱中没有结合蛋白质；最后，用Buffer B(pH 7.4，20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、0.5M咪唑)以流速为1mL/min进行梯度洗脱。纯化后将收集液进行SDS-PAGE电泳分析，纯化得到30.25kD GliK蛋白(图2A)将纯化的目的蛋白用5mLHiPrepDesalting脱盐柱脱盐。脱盐后浓缩的蛋白使用Nanodrop测定蛋白浓度(0.725mg/mL)并进行Western-blot验证分析(图2B)，获得新型乙酰转移酶GliK，保存于-20℃冰箱，备用。

实施例2深海真菌Geosmithiapallida新型乙酰转移酶GliK的酶学性质测定方法

A.本发明将纯化得到的新型乙酰转移酶GliK进行酶活测定，酶活力测定反应体系见表1。

方法参照Garvey G.S.等(Garvey G.S.et al，2009)并加以优化，以胶霉毒素和乙酰辅酶A为底物，缓冲溶液为0.1M，pH 8.0磷酸钾缓冲液，加入GliK蛋白进行催化反应。反应原理是：乙酰转移酶催化乙酰COA转移乙酰基到胶霉毒素上生成乙酰胶霉毒素，同时将DTNB还原为TNB，TNB在412nm有吸收峰。(Garvey G.S.,McCormick S.P.,AlexanderN.J.,etal.Structural and functional characterization ofTRI3 trichothecene15-O-acetyltransferase fromFusarium sporotrichioides[J].Protein Science,2009,18(4):747-761.)

表1酶活力测定反应体系

组成体系成分	各组分在体系中的量
		乙酰辅酶A(5mM)	10％
胶霉毒素(1mg/mL)	10％
		DTNB(20mM)	1％
磷酸钾缓冲液(0.1M，PH＝8.0)	69％
		乙酰转移酶GliK	10％

B.配制溶液，BufferA：5mM乙酰辅酶A，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液；Buffer B：1mg/mL胶霉毒素，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液；Buffer C：0.1-0.2mg/mL乙酰转移酶GliK蛋白，0.5mg/mLBSA；Buffer D：20mM DTNB(Sigma)，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液。反应体系为(按体积分数)：10％BufferA；10％Buffer B；10％Buffer C；1％Buffer D；最后加0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液补足至500uL。将所有的溶剂加到比色皿中，充分混匀，同时设置空白对照组(空白体系：将Buffer C的蛋白液替换为0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液，其余不变)，并设置3个重复。利用分光光度计在412nm处测吸光值，通过吸光度的变化计算乙酰转移酶GliK的酶活力。比酶活定义U/mg：常温下每mL反应体系下每mg蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。通过下文公式计算：

SP＝(△A测-△A空)/0.001/(Cpr*0.1mL)/5min

式中：SP：比酶活(U/mg)；△A测＝△A(10min)-△A(5min)；Cpr是蛋白质的初始浓度

C.乙酰转移酶GliK酶促反应中最适温度的确定：按表1中的方法配制反应体系，温度适应范围是在pH 8.0的磷酸钾缓冲体系中，测定乙酰转移酶GliK在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下催化酶活力。根据GliK酶活力计算公式，确定GliK酶促反应的最适温度值，以在最优反应温度下的酶活3430U/mg为100％。由图3A可知，当温度低于35℃时，催化效率随温度的升高而快速增加；当反应温度为35℃时，催化效率最大；当反应温度在40-50℃时，酶活从80％下降至20％。

D.最适PH的确定：按表1中的反应体系进行配置，将缓冲液根据需要替换成：乙酸钠缓冲液(pH 4-6)，磷酸缓冲液(pH 6-8)，Tris-Cl缓冲液(pH 8-9)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9-10)。25℃下反应完成后根据酶活力计算公式，计算不同缓冲液下的GliK蛋白乙酰转移酶的酶活力，以酶在最优条件下的酶活1868U/mg为100％，由图3B可知，在PH值5-9的范围内，GliK蛋白均能保持50％左右的活性，具有较宽的PH适应范围；最适反应PH为7；在酸性条件下，催化效率随PH值下降迅速降低；在碱性条件下，催化效率随PH值升高而下降较缓，PH为9时，仍保持着较高酶活，表明GliK蛋白相对于酸性环境下碱性环境更加稳定。

E.热稳定性分析：按表1中的方法配制反应体系(25℃下反应)，将酶液分别在45℃和50℃条件下保温30、60、90和120min，测定GliK的残留比酶活，以酶在未加热温度下的酶活1253U/mg为100％。由图3C可知，在45℃条件下反应60min，GliK蛋白仍能保持50％左右的活性；当温度超过50℃时，催化效率随温度的升高而迅速降低，当反应60min时候，催化效率仅有20％。

F.酶动力学研究：按表1中的方法配制反应体系，以不同浓度梯度的0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mM乙酰辅酶A的BufferA(母液为5mM乙酰辅酶A，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液)溶液为底物，在37℃条件下测定对应的表观催化速率。利用软件GraphPadPrism8.4.3，拟合得到酶动力参数Km和Vmax，由图3D可知，该酶反应动力学参数Km和Vmax的值分别为302.8μM/min和4092U/mg。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 831

<212> DNA

<213> 深海真菌FS140(Geosmithia pallida)

<400> 1

atgaccatac aactccctca cacacctgac agagaagaag gccctggtgc ttctcctgca 60

tgcaagttca atgcaatcca gacattccgg tggttatggg acctagtcat cccaactagc 120

gaccttactc aagaaaccgg tcgatatcct ccgaagacga cgatcgagag acggcgcgca 180

tcaaccacag atagatcgct cgataaggac gaatacctag ctgagaaggt cgcaggtcat 240

caggtcgaag aacatgtccc cccggagaag accgtcctct acctcgcgta cggctcgaat 300

ctggccgcgg agaccttcct gggcaagcga ggcattaggc ctctatccca gatcaacgtt 360

gtcgttcccg gcctacgact aactttcgac cttcctgggt taccatacgt tgagccatgc 420

ttcgcagcga ctcggcactg gactcataca ccaagagtaa cacaaacaga aggaaatgga 480

agtaatgaag gggtcgatgc agaagtgttg gagaattcgt ccctcgtgcc acaggagaag 540

aacgacatgc ctctcgtcgg cgtcgtgtat gaggtcactg tcgccgatta tgccaagata 600

atagccacag agggtggtgg gcgcggatac cgagacgtcg ttgtcgattg ctatcctttt 660

cccaaatcat acagtcccac cgatccggtc cctgagtgcc ccgaaaccaa acccttcaag 720

tcccacaccc tcctctctcc agccgacgac gcagtctcgg gtctcctggc cgcagggaag 780

tcataccgac ccgtccgacc caatcctggc tacgcccagc cctccgcttg a 831

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 深海真菌FS140(Geosmithia pallida)

<400> 2

Met Thr Ile Gln Leu Pro His Thr Pro Asp Arg Glu Glu Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Pro Ala Cys Lys Phe Asn Ala Ile Gln Thr Phe Arg Trp Leu

20 25 30

Trp Asp Leu Val Ile Pro Thr Ser Asp Leu Thr Gln Glu Thr Gly Arg

35 40 45

Tyr Pro Pro Lys Thr Thr Ile Glu Arg Arg Arg Ala Ser Thr Thr Asp

50 55 60

Arg Ser Leu Asp Lys Asp Glu Tyr Leu Ala Glu Lys Val Ala Gly His

65 70 75 80

Gln Val Glu Glu His Val Pro Pro Glu Lys Thr Val Leu Tyr Leu Ala

85 90 95

Tyr Gly Ser Asn Leu Ala Ala Glu Thr Phe Leu Gly Lys Arg Gly Ile

100 105 110

Arg Pro Leu Ser Gln Ile Asn Val Val Val Pro Gly Leu Arg Leu Thr

115 120 125

Phe Asp Leu Pro Gly Leu Pro Tyr Val Glu Pro Cys Phe Ala Ala Thr

130 135 140

Arg His Trp Thr His Thr Pro Arg Val Thr Gln Thr Glu Gly Asn Gly

145 150 155 160

Ser Asn Glu Gly Val Asp Ala Glu Val Leu Glu Asn Ser Ser Leu Val

165 170 175

Pro Gln Glu Lys Asn Asp Met Pro Leu Val Gly Val Val Tyr Glu Val

180 185 190

Thr Val Ala Asp Tyr Ala Lys Ile Ile Ala Thr Glu Gly Gly Gly Arg

195 200 205

Gly Tyr Arg Asp Val Val Val Asp Cys Tyr Pro Phe Pro Lys Ser Tyr

210 215 220

Ser Pro Thr Asp Pro Val Pro Glu Cys Pro Glu Thr Lys Pro Phe Lys

225 230 235 240

Ser His Thr Leu Leu Ser Pro Ala Asp Asp Ala Val Ser Gly Leu Leu

245 250 255

Ala Ala Gly Lys Ser Tyr Arg Pro Val Arg Pro Asn Pro Gly Tyr Ala

260 265 270

Gln Pro Ser Ala

275

Claims

1.乙酰转移酶GliK，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的乙酰转移酶GliK的乙酰转移酶基因GliK。

3.根据权利要求2所述的乙酰转移酶基因GliK，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的乙酰转移酶基因GliK的重组表达质粒。

5.一种含有权利要求4所述的重组表达质粒的重组基因工程菌株。

6.权利要求1所述的乙酰转移酶GliK在催化胶霉毒素得到乙酰胶霉毒素中的应用。