CN112830946A - 一种沸点下低温提取柚皮苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沸点下低温提取柚皮苷的方法。具体方案为，柚幼果的切片干品，按料液比12‑20mL/g，恒温40‑85℃水提取，得水提取液。将所得提取液用400目滤布过滤，滤液25℃静置，沉淀析出，滤过，即得柚皮苷产品。优选料液比为18mL/1g，提取温度为83.7℃，共提取2‑3次，每次90min。本发明柚皮苷提取率高，相比于现有技术可以减少果胶等其它杂质的溶出，大大简化了柚皮苷的析晶和进一步纯化工艺，且工艺简单，不涉及有机试剂使用，能耗较低，环保，低成本，周期短，适宜工业化生产。

Description

一种沸点下低温提取柚皮苷的方法

技术领域

本发明涉及植物活性物质的提取技术，具体涉及一种柚皮苷的提取制备方法。

背景技术

柚是芸香科的柑橘类水果，起源于南亚和东南亚。现在中国作为柚类果实的生产大国，柚子种植面积和产量均居世界首位。由于其果汁具有很高的营养价值，因此主要应用于饮料行业。在柚子幼果期要根据植株的挂果能力，用人工的方法疏除多余的柚果，以提高果实品质，使果实在树冠内均匀分布。柚子果实中柚皮苷含量随果实直径的增加而减少，因此疏除的幼果可以作为良好的柚皮苷来源。

柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其杂种的果皮和果肉中。柚皮苷已被证明具有多种生物活性，比如预防癌症、抑制微生物生长和许多酶的活性、抗氧化、降低血液中的胆固醇和甘油三酯的水平和维持正常的毛细血管渗透性等，显示出其潜在的医学应用价值。寻找简洁高效的从柚类果实中提取柚皮苷的方法具有非常重要的意义。

对于柚类果实中柚皮苷最常见的提取方法主要包括：水提取、碱法提取以及乙醇提取，使用煮沸或超声辅助等方式促进柚皮苷溶解。但是这些方法还是具有一些缺点，比如：产率较低、成本较高、而且有机试剂(如乙醇)的回收复杂并带有火灾隐患。专利CN201710260812.3公开了一种采用渗漉提取的方法，可以获得较高的提取效率，但是提取流程复杂，并且使用了多种有机试剂。专利CN201710128917.3公开了一种采用酶加热水法从柚子皮中提取柚皮苷的方法，提取效果较好，但是要使用菠萝蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶等多种酶的酶解体系，成本较高，并且对温度、pH等条件要求苛刻，操作复杂。工艺过程最简单的沸水提取法，由于提取温度较高，会提取出很多柚类果实中的果胶等杂质，使提取液粘稠影响柚皮苷粗提取物的析晶并且使产物纯度降低。本发明通过保持柚皮苷提取率的同时，降低提取温度，达到减少杂质提取的目的。同时可以显著降低柚皮苷提取、冷凝回流和提取液浓缩过程中的能耗，降低成本，适宜工业化生产。

发明内容

为了克服现有技术不足，本发明提供了一种提取制备柚皮苷的方法，具体技术方案为：

柚幼果的切片干品，按料液比12-20mL/g，恒温40-85℃水提取，得水提取液。

将所得提取液用400目滤布过滤，滤液25℃静置，沉淀析出，滤过，即得柚皮苷产品。

最优选的制备参数为：柚幼果切片厚度为3mm的薄片。对于传统的水提取方法最优料液比为18mL/1g柚果，提取温度为83.7℃，共提取2次，每次90min。中梯度逆流水提取方法的最优参数为：共设置10个提取单元，每个提取单元加水量为18mL/1g柚果，提取温度为65.4℃，每个提取单元中柚果提取4次，每次60min。

本发明具有如下优点：(1)柚皮苷提取率较高。使用传统提取及梯度逆流提取，柚皮苷提取率均达到90％以上。(2)相比于常规沸水提取，可以显著降低多糖等杂质溶出，降低所得提取液黏度，有利于提取液的过滤、柚皮苷析晶，缩短工艺时间及成本。(3)所得提取液仅经过静置析晶步骤即可获得较高纯度的柚皮苷粗产物，所得粗产物纯度可达80％以上。(4)本发明降低了柚皮苷的提取温度，尤其是使用梯度逆流提取时可以减少提取溶剂用量；在沸点下低温提取具有显著的优点，可显著降低柚皮苷提取、冷凝回流以及提取液浓缩过程中的能耗，成本低，操作简单，周期短，有利于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1进行不同温度下柚皮苷水提取动力学曲线。

图2为本发明实施例1进行不同温度下水提取后柚样品形态图。

图3为本发明实施例1进行不同温度下水提取后柚样品中果皮径向横截面(a,c,e,g)和切向横截面(b,d,f,h)的扫描电镜图。其中a,b-40℃；c,d-40℃；e,f-40℃；g,h-40℃。

图4为本发明实施例3进行梯度逆流提取流程示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不局限于此。

实施例1

称取4份柚幼果的切片干品，每份100g，加入12倍量水，其中3份置于恒温水浴锅上分别用40℃、60℃、80℃、100℃加热提取，第四份加热至微沸冷凝回流提取，共提取5小时，每隔一段时间吸取1mL提取液，冷却至室温后，使用HPLC测定各时间点提取液中柚皮苷浓度，提取结束后，参照《中国药典》方法测定提取液中总固体量。平行实验3次，取平均值。

以柚皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110722-201815，纯度91.7％)为外标，使用HPLC法测定提取液中柚皮苷浓度，色谱条件为使用C18色谱柱(柱长：250mm，粒径：5μm)，以甲醇为流动相A，pH3.0醋酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0→50min,A:30→60％；检测波长为283nm，柱温为25℃。测定上述提取液中柚皮苷浓度绘制不同温度下柚皮苷提取动力学曲线，如图1。进行一次提取，提取5小时后，40℃、60℃、80℃以及100℃提取液中柚皮苷提取率分别为：47.95％、55.32％、61.34％和59.38％(柚皮苷的提取率表示为水提取液中柚皮苷含量占柚果中柚皮苷含量百分比，柚果中柚皮苷含量参照《中国药典》化橘红中柚皮苷含量测定方法进行测定)。各提取液中总固体量分别为：18.96％、19.61％、21.23％和25.40％(提取液的总固体量表示为提取液蒸干后残留固体质量占柚果质量百分比)。实施例结果中80℃与100℃柚皮苷提取率相近，但100℃提取液中总固体量仍有较大提升，表明过高的提取温度会导致杂质的溶解。

分别将40℃、60℃、80℃和100℃提取后的水液放置，前三者在烧杯壁及底部均有簇状结晶析出，经测定其中柚皮苷纯度分别为87.7％，85.6％和70.3％，100℃提取后的水液直至放置至霉亦无结晶析出。

对40℃、60℃、80℃以及100℃提取后的果实样品拍照，如图2。40℃和60℃提取后的果实切片保持完整的结构，在拉伸时有弹性。80℃提取后，柚片有部分破损，弹性基本消失。100℃水煮后，柚片无法保持完整结构，且稍微碰触就会破损。随水温升高，柚结构逐渐被破坏，可能是由于柚中维持结构的果胶等成分也会在高温下被提取。

对40℃、60℃、80℃以及100℃提取后的果实样品进行扫描电镜观察，如图3。柚幼果样品中，中果皮占80％以上。在提取后的果实样品的中果皮相同部位取样，使用FAA固定液(由90mL 70％乙醇溶液，5mL冰乙酸和5mL 37％甲醛溶液组成)固定12小时后，用流水洗涤12小时。在梯度浓度乙醇溶液中脱水(30％、50％、70％、80％、95％和100％)后进行临界点干燥。然后将样品在液氮中脆断，使横截面分别在果实样品的径向和切向。柚果的中果皮主要由薄壁细胞和从果实中心辐射状分布的维管束细胞(如图3中a和b部分箭头所示)组成。40℃提取后，中果皮细胞排列紧密，细胞在液氮脆断时被撕裂。随提取温度升高，薄壁细胞逐渐皱缩，在细胞间形成通道状的空腔。这些空腔在径向横截面中表现为“沟壑”(图3中c、e及g部分中箭头所示)，在切向横截面中表现为“孔洞”(如图3中的d、f及h部分箭头所示)。100℃提取后，液氮脆断不再撕裂细胞，而是发生在细胞之间，说明薄壁细胞间的连接变得更加松散，这也可以解释高温提取后样品更易碎。中果皮细胞的皱缩可能是由于高温提取过程导致生物膜上的蛋白质变质，胞内物质逸出。因此过高的提取温度可能导致蛋白质、多糖等大分子杂质的释放。此外，细胞间的连接变松散，可能是高温破坏了薄壁细胞由果胶组成的细胞壁胞间层。

实施例2

使用星点设计-响应面法优化柚果传统提取条件。每组实验使用约50g柚果，量取合适体积水，加入圆底烧瓶中，控制合适的温度进行提取。提取后，提取液使用400目滤布滤过，并冷却至室温，使用HPLC分析提取液，并计算提取液中柚皮苷占总固体比例(NG/TS,％,表示为一定体积提取液中柚皮苷质量占提取液中总固体质量百分比)。

选取3个自变量为每次提取的温度(A,40-100℃)，料液比(B,12-18mL/g)和提取时间(C,30-90min)，共提取两次。以柚皮苷提取率作为因变量(Y,％)。为将实验数据进行二阶多项式拟合，共进行20组实验。传统提取响应面法实验设计及响应如表1。

表1传统提取实验中央复合设计及实验响应

方差分析显示，二次模型显著(p＜0.0001)且失拟项不显著(p＝0.3577＞0.05)，说明该模型可以充分显示柚皮苷提取率与提取条件的关系。最终的二阶多项式方程如下：

其中，Y为柚皮苷提取率(％)；A,B,C分别为温度(℃)、料液比(mL/g)和提取时间(min)的实际值。(R²＝0.9736,R²-adj＝0.9499,andR²-pred＝0.8606)

使用Design expert对达到柚皮苷最大提取率的最佳条件进行预测。预测的最佳提取温度为83.73℃，料液比为18mL/g，提取时间为90min，共提取2次。平行进行3组验证实验，传统提取最佳条件下，柚皮苷平均提取率为93.35％，NG/TS为17.98％均高于其余各组实验。以上各组在放置72小时内，均可析出柚皮苷结晶，收集混合测定，纯度为68.4％、67.2％和72.1％。

实施例3

使用星点设计-响应面法优化柚果梯度逆流提取条件。每组实验使用约150g柚果，设置10个提取单元，每个提取单元约15g柚果，加入合适体积水，控制合适的温度，每个提取单元中柚果提取4次，提取过程流程如图4。提取后，提取液使用400目滤布滤过，并冷却至室温，使用HPLC分析提取液，并计算NG/TS。

选取3个自变量为每个提取单元每次提取的温度(A,40-80℃)，料液比(B,12-18mL/g)和提取时间(C,30-60min)。以柚皮苷提取率(Y₁,％)和NG/TS(Y₂,％)作为因变量。为将实验数据进行二阶多项式拟合，共进行20组实验。梯度逆流提取响应面法实验设计及响应如表2。

表2梯度逆流提取实验中央复合设计及实验响应

由于提取条件对柚皮苷提取率(Y₁)和NG/TS(Y₂)的影响不同，所以将两个因变量的模型分别拟合。方差分析显示两个二次模型均显著(p均小于0.0001)且失拟项不显著(p(Y₁)＝0.2230,p(Y₂)＝0.1629＞0.05)，提示两个二次模型可以充分显示柚皮苷提取率和NG/TS与提取条件的关系。最终的二阶多项式方程如下：

其中，Y₁为柚皮苷提取率(％)；Y₂为NG/TS(％)；A,B,C分别为温度(℃)、料液比(mL/g)和提取时间(min)的实际值(Y₁：R²＝0.9953,R²-adj＝0.9910,R²-pred＝0.9719；Y₂：R²＝0.9882,R²-adj＝0.9776,andR²-pred＝0.9293)。

将柚皮苷提取率和NG/TS设定为相同权重，预测柚皮苷梯度逆流提取的最佳条件为：共设置10个提取单元，每个提取单元加水量为18mL/1g柚果，提取温度为65.4℃。每个提取单元中柚果提取4次，每次60min。平行进行3组验证实验，梯度逆流提取最佳条件下，柚皮苷平均提取率为94.53％，平均柚皮苷占总固体量比例为30.34％。以上各组在低温放置24小时内，均可析出柚皮苷结晶，经收集分，纯度为90.4％、89.2％、91.5％。

Claims (4)

1.一种沸点下低温提取柚皮苷的方法，其特征在于：柚幼果的切片干品，按料液比12-20mL/g，恒温40-85℃水提取。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述料液比为18mL/1g，恒温83.7℃水提取2-3次，每次90min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水提取的具体方式为中梯度逆流提取，恒温65.4℃，共设置10个提取单元，每个提取单元的料液比为18mL/1g，每个提取单元提取4次，每次60min。

4.一种柚皮苷的制备方法，其特征在于：权利要求1或2或3方法所得水提液，用400目滤布过滤，滤液25℃静置，沉淀析出，滤过，即得。

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