CN112812126B - 一种双通道荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及双通道荧光探针的制备领域，具体公开了一种双通道荧光探针的制备方法，所述制备方法包括：(1)将四乙基氢氧化铵和KOH的混合碱甲醇溶液与荧光素混合，滴加CHCl3，滴完继续反应，正己烷洗涤，分液除去正己烷相；(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释，加入丙二酸二乙酯，反应，冷却至0～5℃，过滤，滤饼洗涤，干燥；(3)将步骤(2)的所得物、吡啶、三乙胺和二氯甲烷混合，滴加丙烯酰氯，滴完反应，之后加水洗涤，有机相减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化。所述制备方法能够进一步提高该双通道荧光素探针的转化率和产率，并且条件温和、操作简便，成本低廉。
Description
技术领域
本申请涉及双通道荧光探针的制备领域，更具体地，涉及一种双通道荧光探针的制备方法。
背景技术
荧光素探针是一类利用荧光素及其衍生物与目标分子作用后通过荧光光谱(包括荧光强度、荧光激发与发射波长、荧光寿命和荧光偏振/各向异性等)改变来实现对目标分子进行探测的有机荧光功能染料，其具有检出限极低和灵敏度极高等优点，特别适合于对某些低含量物质，特别是生物材料进行相关的特异性检测。
传统的荧光素探针材料功能一般较为单一，仅具备单一的荧光信号变化模式，属于单通道信号输出，其荧光发射信号的变化基于单通道强度的变化，易受到光漂白、光散射以及溶剂极性、探针浓度、激发强度、仪器效率和环境条件变化等条件的影响和限制，进而可能影响探针检测的准确性。为此，本领域技术人员开发了双通道荧光探针，其可以在两个发射通道中发生荧光信号的变化，通过二者的比率关系得出检测结果，由此在一定程度上能够削弱甚至消除上述内外因素的干扰和影响。
半胱氨酸(Cys)是一种生物体内常见的氨基酸，为含硫α-氨基酸之一，存在于谷胱甘肽和许多蛋白质中，其具有多重生理功能，在人体内的浓度过高或过低都会引起一系列病理现象。利用荧光素探针来分析检测Cys具有廉价、方便与快捷等优点，但与此同时也存在荧光强度受介质和探针浓度影响等缺陷。对此，兰州大学的王雅雯(Fluorescein-BasedChromogenic and Ratiometric Fluorescence Probe for Highly Selective Detectionof Cysteine and Its Application in Bioimaging.Anal.Chem.2017,89,3,1937-1944)设计并合成了一种双通道荧光素探针，其具有如下所示的荧光素和香豆素的杂化骨架结构，能够利用该探针的丙烯酸酯位点引发的半胱氨酸Click反应，来实现了对半胱氨酸这一生物活性硫醇的双通道荧光识别。
然而，上述文献中，该双通道荧光素探针的收率不高，仍有进一步提升的空间。因此，本领域技术人员希望能够开发出能够进一步提高上述双通道荧光素探针的转化率和产率的制备方法。
发明内容
[技术问题]
针对现有技术存在的不足，本申请的一个目的在于提供一种双通道荧光探针的制备方法，所述制备方法能够进一步提高该双通道荧光素探针的转化率和产率，并且条件温和、操作简便，成本低廉。
[技术方案]
为了实现上述目的，根据本申请的一个实施方式提供了一种双通道荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为10～15wt％且KOH的浓度为15～20wt％的混合碱甲醇溶液，以每克荧光素对应5～7mL所述混合碱甲醇溶液将二者混合，在60～70℃下滴加重量为荧光素重量的0.38～0.41倍的CHCl3，滴完继续反应4～6小时，之后加入正己烷洗涤，分液除去正己烷相；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至原体积的3～4倍，加入重量为所述荧光素重量的0.53～0.60倍的丙二酸二乙酯，室温下反应6～7小时，之后冷却至0～5℃，过滤，滤饼依次用水和甲醇洗涤，干燥；
(3)将重量比为1:(0.20～0.35):(0.40～0.60):(12～15)的步骤(2)的所得物、吡啶、三乙胺和二氯甲烷混合，在0～5℃下滴加重量为步骤(2)的所得物重量的0.30～0.40倍的丙烯酰氯，滴完升温至35～45℃反应3～4小时，之后加水洗涤，有机相减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化。
在本申请中，首先在荧光素上引入一个醛基，之后利用丙二酸二乙酯合环以形成荧光素与香豆素的杂化骨架结构，最后丙烯酰化以制得双通道荧光探针，即10'-(丙烯酰氧基)-3,3'-二氧代-3H,3'H-螺[异苯并呋喃-1,7'-吡喃并[2,3-c]呫吨]-2'-羧酸乙酯。本申请的制备方法反应平稳，操作简单，产率高，且成本低廉。
所述步骤(1)属于Reimer-Tiemann反应，即CHCl3在强碱的作用下生成二氯卡宾，其进攻荧光素的酚羟基苯环的邻位，之后水解脱氯以引入醛基。在本申请中舍弃了昂贵的冠醚，采用特定配比的季铵碱和KOH组合以创造适宜的反应条件，从而能够以较高的转化率制得产物。此外，步骤(1)的产物无需纯化处理，可以直接投入下一步的反应中。
优选地，所述步骤(1)中，所用正己烷的总量可以为所述混合碱甲醇溶液体积的1.5～2.5倍，且分2～3次洗涤。通过洗涤，可以有效除去体系中多余的CHCl3等杂质。
在所述步骤(2)中，通过加入丙二酸二乙酯来与步骤(1)所得产物的醛基和相邻酚羟基反应，从而成环形成荧光素与香豆素的杂化骨架结构。在本申请中，充分利用步骤(1)加入的混合碱，并采用甲醇将其直接稀释以创造适宜的碱浓度，而且稀释后的反应物浓度也更利于环化反应的发生。此外，生成的产物不溶于甲醇，冷却析出即可。
优选地，所述步骤(2)中，洗涤滤饼的用水总量为步骤(1)的所得物体积的0.8～1.2倍，且分2～3次洗涤。并且，洗涤滤饼的甲醇总量为步骤(1)的所得物体积的0.3～0.5倍，且分1～2次洗涤。通过洗涤，可以将残留的四乙基氢氧化铵、KOH等碱有效除去。
优选地，所述步骤(2)中，所述干燥在50～60℃下进行2～3小时。通过干燥以除去甲醇，从而避免对下一步反应的影响。
在所述步骤(3)中，采用丙烯酰氯以在步骤(2)所得物剩余的一个酚羟基上引入丙烯酰基，从而最终制得本申请所需的双通道荧光探针。
优选地，所述步骤(3)中，所述洗涤的用水总量为反应体系体积的0.4～0.6倍，且分1～2次洗涤。通过加水洗涤，能够将吡啶、三乙胺以及其它溶于水的杂质清除。
优选地，所述步骤(3)中，所述减压蒸馏在40～55℃下进行。通过减压蒸馏以将二氯甲烷蒸除，便于后续的柱色谱纯化。
优选地，所述步骤(3)中，所述柱色谱纯化的洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝1:1。通过柱色谱纯化，从而能够获得纯度很高的双通道荧光探针。
[有益效果]
综上所述，本申请具有以下有益效果：
根据本申请的双通道荧光探针的制备方法能够进一步提高双通道荧光素探针10'-(丙烯酰氧基)-3,3'-二氧代-3H,3'H-螺[异苯并呋喃-1,7'-吡喃并[2,3-c]呫吨]-2'-羧酸乙酯的转化率和产率，并且条件温和、操作简便，成本低廉，应用前景广阔。
具体实施方式
为了使本领域技术人员能够更清楚地理解本申请，以下结合实施例对本申请作进一步详细说明，但应当理解的是，以下实施例仅为本申请的优选实施方式，而本申请要求保护的范围并不仅局限于此。
物料来源
四乙基氢氧化铵(25wt％甲醇溶液)、荧光素、，购自北京百灵威科技有限公司；
丙二酸二乙酯、丙烯酰氯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
KOH、甲醇、CHCl3、正己烷、吡啶、三乙胺、二氯甲烷，购自国药集团。
<实施例>
实施例1
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为10wt％且KOH的浓度为20wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与60mL所述混合碱甲醇溶液混合，在65℃下滴加4.0g的CHCl3，滴完继续反应5小时，之后加入正己烷洗涤(60mL×2)，分液除去正己烷相，得到64.6mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至200mL，加入5.6g的丙二酸二乙酯，室温下反应7小时，之后冷却至5℃，过滤，滤饼依次用水(30mL×2)和甲醇(25mL)洗涤，在55℃下干燥2小时，得到10.74g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、2.15g的吡啶、4.30g的三乙胺和132.5g(100mL)的二氯甲烷混合，在0℃下滴加3.76g的丙烯酰氯，滴完升温至40℃反应3.5小时，之后加水(25mL×2)洗涤，有机相在55℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得10.64g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.78％，总收率69.12％)。
实施例2
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为15wt％且KOH的浓度为15wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与70mL所述混合碱甲醇溶液混合，在60℃下滴加3.9g的CHCl3，滴完继续反应6小时，之后加入正己烷洗涤(80mL×2)，分液除去正己烷相，得到75.2mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至250mL，加入5.3g的丙二酸二乙酯，室温下反应7小时，之后冷却至0℃，过滤，滤饼依次用水(40mL×2)和甲醇(15mL×2)洗涤，在55℃下干燥3小时，得到10.20g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、3.06g的吡啶、6.12g的三乙胺和145.75g(110mL)的二氯甲烷混合，在3℃下滴加4.08g的丙烯酰氯，滴完升温至35℃反应4小时，之后加水(30mL×2)洗涤，有机相在45℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得10.41g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.89％，总收率67.71％)。
实施例3
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为10wt％且KOH的浓度为15wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与50mL所述混合碱甲醇溶液混合，在70℃下滴加3.8g的CHCl3，滴完继续反应4小时，之后加入正己烷洗涤(50mL×2)，分液除去正己烷相，得到53.1mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至200mL，加入6.0g的丙二酸二乙酯，室温下反应6小时，之后冷却至0℃，过滤，滤饼依次用水(20mL×3)和甲醇(25mL)洗涤，在50℃下干燥2小时，得到10.14g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、3.55g的吡啶、5.07g的三乙胺和132.5g(100mL)的二氯甲烷混合，在5℃下滴加3.55g的丙烯酰氯，滴完升温至45℃反应3小时，之后加水(50mL)洗涤，有机相在50℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得10.28g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.92％，总收率66.90％)。
实施例4
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为15wt％且KOH的浓度为20wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与50mL所述混合碱甲醇溶液混合，在65℃下滴加4.1g的CHCl3，滴完继续反应4小时，之后加入正己烷洗涤(30mL×3)，分液除去正己烷相，得到52.8mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至200mL，加入5.3g的丙二酸二乙酯，室温下反应7小时，之后冷却至5℃，过滤，滤饼依次用水(20mL×3)和甲醇(20mL)洗涤，在50℃下干燥3小时，得到10.94g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、2.73g的吡啶、5.47g的三乙胺和159.0g(120mL)的二氯甲烷混合，在0℃下滴加3.28g的丙烯酰氯，滴完升温至35℃反应3小时，之后加水(25mL×2)洗涤，有机相在40℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得11.04g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.84％，总收率71.74％)。
实施例5
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为15wt％且KOH的浓度为17wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与70mL所述混合碱甲醇溶液混合，在65℃下滴加4.0g的CHCl3，滴完继续反应6小时，之后加入正己烷洗涤(40mL×3)，分液除去正己烷相，得到74.6mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至240mL，加入5.8g的丙二酸二乙酯，室温下反应6小时，之后冷却至0℃，过滤，滤饼依次用水(40mL×2)和甲醇(20mL×2)洗涤，在60℃下干燥2小时，得到10.43g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、3.65g的吡啶、6.26g的三乙胺和132.5g(100mL)的二氯甲烷混合，在0℃下滴加3.13g的丙烯酰氯，滴完升温至45℃反应4小时，之后加水(25mL×2)洗涤，有机相在55℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得10.43g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.88％，总收率67.81％)。
实施例6
采用以下根据本申请的制备方法来制备双通道荧光探针：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为13wt％且KOH的浓度为20wt％的混合碱甲醇溶液，将10g的荧光素与60mL所述混合碱甲醇溶液混合，在70℃下滴加3.8g的CHCl3，滴完继续反应5小时，之后加入正己烷洗涤(50mL×2)，分液除去正己烷相，得到65.3mL的产物；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至220mL，加入0.54g的丙二酸二乙酯，室温下反应6.5小时，之后冷却至3℃，过滤，滤饼依次用水(35mL×2)和甲醇(30mL)洗涤，在50℃下干燥2.5小时，得到10.70g的产物；
(3)将步骤(2)的所得物、2.14g的吡啶、4.28g的三乙胺和159.0g(120mL)的二氯甲烷混合，在2℃下滴加4.28g的丙烯酰氯，滴完升温至45℃反应4小时，之后加水(30mL×2)洗涤，有机相在50℃下减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，由此获得10.75g的最终产物双通道荧光探针(纯度99.90％，总收率69.92％)。
通过上述实施例1至6可以看出，本申请通过优化各个步骤的反应和后处理条件，从而以较高的收率获得了最终产物双通道荧光探针。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种双通道荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制四乙基氢氧化铵的浓度为10～15wt％且KOH的浓度为15～20wt％的混合碱甲醇溶液，以每克荧光素对应5～7mL所述混合碱甲醇溶液将二者混合，在60～70℃下滴加重量为荧光素重量的0.38～0.41倍的CHCl3，滴完继续反应4～6小时，之后加入正己烷洗涤，分液除去正己烷相；
(2)用甲醇将步骤(1)的所得物稀释至原体积的3～4倍，加入重量为所述荧光素重量的0.53～0.60倍的丙二酸二乙酯，室温下反应6～7小时，之后冷却至0～5℃，过滤，滤饼依次用水和甲醇洗涤，干燥；
(3)将重量比为1:(0.20～0.35):(0.40～0.60):(12～15)的步骤(2)的所得物、吡啶、三乙胺和二氯甲烷混合，在0～5℃下滴加重量为步骤(2)的所得物重量的0.30～0.40倍的丙烯酰氯，滴完升温至35～45℃反应3～4小时，之后加水洗涤，有机相减压蒸馏，残留物采用柱色谱纯化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所用正己烷的总量为所述混合碱甲醇溶液体积的1.5～2.5倍，且分2～3次洗涤。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，洗涤滤饼的用水总量为步骤(1)的所得物体积的0.8～1.2倍，且分2～3次洗涤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，洗涤滤饼的甲醇总量为步骤(1)的所得物体积的0.3～0.5倍，且分1～2次洗涤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述干燥在50～60℃下进行2～3小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述洗涤的用水总量为反应体系体积的0.4～0.6倍，且分1～2次洗涤。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述减压蒸馏在40～55℃下进行。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述柱色谱纯化的洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝1:1。
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Denomination of invention: A preparation method for dual channel fluorescent probes Effective date of registration: 20230904 Granted publication date: 20220405 Pledgee: Zhengqi Finance Leasing (Tianjin) Co.,Ltd. Pledgor: TIANJIN QUANHECHENG TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023990000440 |
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