CN112805037A

CN112805037A - 包含蒽环类的结合蛋白-毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途

Info

Publication number: CN112805037A
Application number: CN201980066701.6A
Authority: CN
Inventors: U·格劳乌德; R·贝利; L·瓦尔德迈尔; F·普雷托
Original assignee: NBE Therapeutics AG
Current assignee: NBE Therapeutics AG
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-05-14
Also published as: EP3636284A1; EP3863681A1; US20210379194A1; EA202190653A1; PH12021550750A1; BR112021006269A2; JP2022512672A; AU2019358518A1; WO2020074724A1; CA3112848A1; KR20210075085A; MX2021003136A

Abstract

本发明涉及包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白‑毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途。

Description

包含蒽环类的结合蛋白-毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途

发明领域

本发明涉及包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途。

背景技术

结合蛋白-毒素缀合物，以抗体药物缀合物(ADC)作为其最突出的代表，对癌症治疗具有极大影响，为迄今无法治疗的肿瘤类型提供新的治疗方法。

另一方面，发现免疫检查点和开发免疫检查点抑制剂使得免疫系统在癌症治疗中的作用以及刺激免疫系统或克服免疫检查点(各肿瘤将其用于针对免疫系统攻击的自我保护)的方法再次成为焦点。

尽管这2种方法讨论很热烈且在癌症治疗方面显示重大进展，但也清楚的是有无法用这些新方法治疗的肿瘤类型。

例如，显示带有特定毒素的ADC针对特定的癌症类型没有活性，尽管其通过其抗体定位癌特异性抗原。还显示存在免疫检查点抑制剂没有功效的肿瘤类型。

因此，本发明的一个目的是提供使迄今无法被现有疗法解决的肿瘤类型可治疗的新方法。

本发明的另一个目的是提供增加对应的单一疗法抗肿瘤活性的联合疗法。

这些和其他目的用本发明独立权利要求所述的方法和手段满足。从属权利要求涉及特定实施方案。

发明概述

本发明提供包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途。本发明及其特征的一般优势会在下文详细讨论。

附图说明

图1.用于产生本发明实验所用的位点特异性缀合的ADC的五甘氨酸修饰的EDA-蒽环类PNU-159682衍生物(G5-EDA-PNU或G5-PNU)的化学结构。G3-PNU和G2-PNU指相同的结构，但其中五甘氨酸分别由三甘氨酸或二甘氨酸取代。

图2.在小鼠EMT-6乳腺癌细胞上稳定表达的人ROR1表达的FACS分析。为体内研究选择的EMT-6-ROR1克隆14通过FACS染色分析ROR1表达，用荧光标记的抗ROR1抗体克隆2A2进行。阴性对照显示用荧光标记同种型匹配的对照抗体的染色相同细胞。

图3.新的抗ROR1 PNU-ADC的剂量调整，基于抗体XBR1-402，在原位同系乳腺癌模型EMT-6-ROR1(克隆14)中以不同剂量水平(0.25,0.5和1mg/kg)单一治疗。(A)如所指明的在不同治疗组中随着时间监测原位移植模型的肿瘤生长。(B)(A)幅中所展示的组的个体小鼠的肿瘤生长曲线。

图4.用EMT-6-ROR1(克隆14)乳腺癌细胞原位移植的同系小鼠的肿瘤体积演变，(A)注射载剂对照(PBS)，或(B)单次施用0.25mg/kg同种型匹配对照PNU-ADC，其含有抗CD30抗体本妥昔单抗，克隆Ac10，或(C)单次施用0.25mg/kg抗ROR1 PNU-ADC，其含有新的抗ROR1抗体XBR1-402，其根据图3被确定为治疗小鼠中原位EMT-6-ROR1乳腺癌的次优剂量。(D)和(E)幅显示所指明的用抗CTLA4免疫检查点抑制剂抗体9D9与0.25mg/kg同种型匹配对照ADCAc10和0.25mg/kg新的抗ROR1 PNU ADC联合治疗。(F)下列组的中位组肿瘤体积演变(应用末次观察推进(LOCF)法)：载剂对照，Ac10-G5-PNU同种型对照和XBR1-402-G5-PNU，(G)下列组的平均组肿瘤体积演变(应用末次观察推进(LOCF)法)：载剂对照，Ac10-G5-PNU同种型对照和抗小鼠CTLA-4抗体9D9，以及XBR1-402-G5-PNU和抗小鼠CTLA-4抗体9D9。

图5.在(A)小鼠CT-26乳腺癌细胞(克隆3)和(B)B16小鼠黑素瘤细胞(池)上稳定表达的人ROR1表达的FACS分析。为体内研究选择的CT-26-ROR1克隆3和B16-ROR1池用荧光标记抗ROR1抗体克隆XBR1-402(右侧峰)通过FACS染色分析ROR1表达。阴性对照显示用荧光标记的同种型匹配的对照抗体的相同细胞染色(左侧峰)。

图6.根据实施例6移植CT-26-ROR1克隆3肿瘤细胞的小鼠中的肿瘤体积演变：(A)第1组的载剂对照(未治疗)，(B)第2组的同种型对照，(C)第3组的抗ROR1 ADC huXBR1-402-17，(D)第4组的同种型对照加免疫检查点抑制剂抗小鼠PD-1抗体，(E)第7组的抗ROR1 ADChuXBR1-402-17加免疫检查点抑制剂抗小鼠PD-1抗体。A-E幅的插图(insert)提供相对于各处理组的小鼠数，其中肿瘤生长受到抑制的小鼠数目。结果提示所评估的免疫检查点抑制剂与含靶向PNU衍生物的ADC之间的协同(coorperation)。

图7.在根据实施例7i.v.施用ROR1过表达的B16池后，在用载剂对照(“载剂”，第1组)、免疫检查点抑制剂抗小鼠CTLA-4抗体(“CTLA-4”，第2组)、抗ROR1 ADC huXBR1-402-17(“ADC”，第3组)以及抗ROR1 ADC huXBR1-402-17加免疫检查点抑制剂抗小鼠CTLA-4抗体(“ADC+CTLA-4”，第4组)处理后的小鼠肺表面集落体积。这些结果提示在免疫原性不良的肿瘤中，所评估免疫检查点抑制剂与含靶向PNU衍生物的ADC之间存在强协同(strongsynergy)。“n.s.”的意思是没有统计学显著差异，“*”指示统计学显著差异。

图8.hROR1(人ROR1)过表达的B16肿瘤冰冻切片的CD4和CD8染色，所述肿瘤来自(A)未治疗的对照小鼠和(B)用根据本发明的ADC治疗(一次，4mg/kg)的3只小鼠。根据图8(A)，B16肿瘤天然包含低水平的CD4+和CD8+细胞，使B16肿瘤的状态保持为冷肿瘤。图8(B)显示用根据本发明的ADC治疗可增加肿瘤内CD4+和CD8+细胞的数目。

图9.在hROR1(人ROR1)过表达的CT-26和B-16肿瘤中的浸润性淋巴细胞上的41BB(CD137)，T细胞活化的标记物，染色分析。根据图9，相较于CT-26肿瘤，能在B-16肿瘤内观察到显著较低数目的活化的T CD4+(A)和CD8+(B)淋巴细胞，使B-16肿瘤的状态保持为冷肿瘤。“*”指示统计学显著差异。

发明详述

详细描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的装置的特定组成部分或所描述的方法的工艺步骤，因为这些装置和方法可能变化。还应理解本文所用术语仅出于描述特定实施方案目的，且不意在限制。必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个(a/an)”和“所述”包括单数和/或复数指示物。此外，应理解在给定参数范围由数值限定的情况中，所述范围视作包括这些限定值。

还应理解，本文所公开的实施方案不意味着作为彼此无关的单独实施方案来理解。一个实施方案讨论的特征意味着也与本文所示其他实施方案相关公开。在一种情况中，如果具体特征不通过一个实施方案而是另一实施方案公开，本领域技术人员会理解，这不必定是指所述特征不用所述其他实施方案公开。本领域技术人员会理解，本申请的主旨是公开所述特征也用于其他实施方案，但仅出于阐明目的且使说明书保持可控的篇幅，这尚未完成。

此外，本文所引用现有技术文献的内容通过引用纳入。具体而言，这涉及公开标准或常规方法的现有技术文献。在此情况中，通过引用纳入的主要目的在于提供足够的使能公开，并避免冗长重复。

根据本发明的一个方面，提供结合蛋白-毒素缀合物，其包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，(用于生产药物)用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病，

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤。

重要的是强调，选择上述语言和在括号内的术语“用于生产药物”，以符合不同国家/地区要求，从而权利要求涵盖给定化合物的医学用途。所述语言应具体涵盖所谓的瑞士型(其中需要修饰语“用于生产药物”)以及根据EPC2000的相应的权利要求语言(其中相同修饰语不再可采纳)。

根据本发明的另一方面，提供治疗或预防表征为冷肿瘤的赘生性疾病的方法，所述方法包括向患者施用包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物。

根据本发明的另一方面，提供

(i)结合蛋白-毒素缀合物，其包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，和

(ii)免疫检查点抑制剂

的组合(用于生产药物)用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病，

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤，

其中所述结合蛋白-毒素缀合物和免疫检查点抑制剂同时或以任何顺序依次施用于所述患者。

根据本发明的另一方面，提供治疗或预防表征为冷肿瘤的赘生性疾病的方法，所述方法包括向患者施用

(ii)免疫检查点抑制剂

根据本发明的另一方面，提供结合蛋白-毒素缀合物，其包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，所述缀合物与免疫检查点抑制剂联用(用于生产药物)，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病，

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤。

根据本发明的另一方面，提供免疫检查点抑制剂与结合蛋白-毒素缀合物联用(用于生产药物)，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤，所述缀合物包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分。

在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂调节正免疫检查点蛋白。在另一实施方案中，所述免疫检查点抑制剂调节负免疫检查点蛋白。

在一个实施方案中，包含一或多个蒽环类毒素的所述结合蛋白-毒素缀合物在免疫检查点抑制剂前施用。

在一个实施方案中，所述患者

·患有，和/或

·被诊断患有

表征为冷肿瘤的赘生性疾病。

“热肿瘤”定义表征为免疫细胞浸润的癌或赘生性组织。免疫浸润水平反映了免疫系统是否识别并攻击(engage)肿瘤。术语“热肿瘤”在本文中与术语“免疫响应性肿瘤”同义使用。或者，“热肿瘤”可定义为响应免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤。

本文所用的术语“响应治疗”指相对于相当的载剂或同种型对照处理，肿瘤负荷或生长统计学显著减少。

在一个实施方案中，术语“冷肿瘤”定义表征为免疫细胞浸润不良或缺乏癌或赘生性组织。术语“冷肿瘤”在本文中与术语“免疫无响应性肿瘤”同义使用。

肿瘤定性为冷的一个基准是所谓的免疫评分，这是基于2类T细胞在肿瘤样品中的密度。一个示例是2个淋巴细胞群(CD3/CD45RO,CD3/CD8或CD8/CD45RO)的密度，两者都在肿瘤核心(CT)和肿瘤侵袭边缘(IM)。免疫评分提供的分数范围，从免疫评分0(10，2个区域中都发现低密度的2种细胞类型时)，到4(14，2个区域中都发现高密度时的免疫评分)。

在例如Galon等.2014,Pages等.2009,Angell等.2013和Galon等.2013中描述了确定免疫评分的方法，其内容通过引用纳入本文。

迄今，讨论了，低免疫评分的肿瘤(“冷肿瘤”)不太响应免疫检查点抑制剂如抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗体治疗，而高免疫评分的肿瘤响应这类治疗(参见Bu等.2016)。不受理论约束，这一发现背后的原理可以是，如果各肿瘤中没有免疫攻击，通过给定抑制剂来抑制免疫检查点则无法改善。

发明人认识到包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物对肿瘤有特定免疫功效，特别是产生避免肿瘤再攻击的免疫保护。这一令人意外的发现无法从用免疫检查点抑制剂如抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗体获得的研究结果中预料。适用于后者的原理不太可能适用于包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物。

根据本发明的一个实施方案，所述表征为冷肿瘤的赘生性疾病是或已经是免疫检查点抑制剂治疗难治的、对免疫检查点抑制剂治疗有抗性的，或在免疫检查点抑制剂治疗后复发的。

本文所用术语“难治”指肿瘤无法或已经无法在肿瘤收缩或者稳定或收缩的持续时间方面以有利方式合理应答免疫检查点抑制剂治疗。

本文所用术语“有抗性的”指肿瘤无法或已经无法在肿瘤收缩或者稳定或收缩的持续时间方面以有利方式合理应答免疫检查点抑制剂治疗达到超过3个月或更多的时间。

本文所用术语“复发”指肿瘤在免疫检查点抑制剂治疗后恢复，通常是在检测不到肿瘤的一段时间之后。肿瘤可在对象体内相同位置或另一位置恢复。

这样用免疫检查点抑制剂的治疗优选是单一疗法。

这类用免疫检查点抑制剂的治疗优选以各药物标签或SOPC推荐的剂量或方案施用。

根据本发明的一个实施方案，所述表征为冷肿瘤的赘生性疾病选自：

·黑素瘤，

·结直肠癌或肿瘤，

·胰腺癌或肿瘤，

·成胶质细胞瘤，

·卵巢癌或肿瘤，和/或

·前列腺癌或肿瘤。

根据本发明的一个实施方案，所述结合蛋白与选自下组的至少一个靶结合：

·ROR1

·CS1

·HER2

·间皮素(MN)，和/或

·ROR2。

其中，ROR1是优选的靶。

这些靶和针对其的抗体描述于下列出版物：

·US2019112385A1(间皮素)、

·US2019153092A1、WO2019016381(ROR1)、

·WO2019030240A1(CS-1)、

·US2018028682(HER2)和

·WO2019016392A1(ROR2)，

其内容通过引用纳入本文。

优选地，所述靶是人来源的。具体地，在本文提及时，ROR1优选指人ROR1。

本文所用术语“免疫检查点抑制剂”指适合针对免疫检查点蛋白作用的任何结合剂或化合物。具体地，“免疫检查点抑制剂”指适合调节免疫检查点蛋白活性以支持免疫系统活性和尤其T细胞识别癌细胞并对其作用的能力的任何结合剂或化合物。免疫检查点蛋白可以是正免疫检查点蛋白(即其支持T细胞活性和免疫应答)或负免疫检查点蛋白(即其限制T细胞活性和免疫应答)。在正免疫检查点蛋白的情况中，免疫检查点抑制剂指适合促进此免疫检查点蛋白活性的结合剂或化合物。在负免疫检查点蛋白的情况中，免疫检查点抑制剂指适合抑制此免疫检查点蛋白活性的结合剂或化合物。

免疫检查点是调控免疫系统的蛋白(Pardoll D.M.The blockage of immunecheckpoints in cancer immunotherapy”,Nature,2012,卷12,第252-264页)，并且对自身耐受是关键的，这防止免疫系统不加区分地攻击，免疫检查点优选选自如下表公开的组：

例如，T细胞表面表达的PD-1检查点蛋白用于防止这些T细胞攻击体内的其他细胞。当T细胞PD-1结合细胞表面的PD-L1时，T细胞不会引发针对该细胞的免疫应答。某些癌细胞表达高水平的PD-L1，这有助于其避免免疫系统攻击。因此，结合PD-1或PD-L1并因而抑制其彼此结合的抗体用于促进针对癌细胞的免疫应答。CTLA-4是T细胞表达的另一种这样的负免疫检查点蛋白。

根据一组实施方案，所述赘生性疾病表征为冷肿瘤，特征是免疫评分I<1。

免疫评分是基于浸润癌且包围其的免疫细胞评估癌症患者预后的方法。免疫评分在结直肠癌中得到了国际验证。其基于Galon等(2006)的发现，揭示了细胞毒性和记忆T细胞与结直肠癌患者存活之间的正相关。

免疫评分将宿主免疫应答的作用纳入癌症分类并改善预后准确性。其检测2个淋巴细胞群(CD3/CD8、CD3/CD45RO或CD8/CD45RO)在肿瘤中心和边缘的密度。免疫评分提供的分数范围从0(10，2个区域中都发现低密度的2种细胞类型时)到免疫评分4(14，2个区域中都发现高密度)。免疫评分不检测免疫细胞肿瘤边缘的免疫细胞如何排列，或B细胞的量、三级淋巴结构和生发中心。这些都在对结直肠和其他癌的免疫应答中起重要作用。

在一个实施方案中，所述冷肿瘤是免疫评分为10或II的肿瘤，优选是免疫评分为II的肿瘤。

在另一实施方案中，术语“冷肿瘤”定义特征为免疫细胞浸润缺乏或不足的癌或赘生性组织。免疫浸润水平反映免疫系统是否识别肿瘤。

在另一实施方案中，冷肿瘤是当免疫检查点抑制剂在体内作为单一疗法给药时，不响应所述免疫检查点抑制剂的肿瘤。在此实施方案中且相对于免疫活性小鼠模型，冷肿瘤是一旦在小鼠中建立，不显著(相对于载剂对照组)响应免疫检查点抑制剂，所述抑制剂作为单一疗法以至多约10mg/kg，或至多20mg/kg，或至多该小鼠模型的最大耐受剂量(MTD)给药。在另一实施方案中，人中的冷肿瘤不显著响应免疫检查点抑制剂，所述抑制剂根据免疫检查点抑制剂标签给药，如作为单一疗法至多10mg/kg，例如1mg/kg,2mg/kg,3mg/kg或者200或240mg，任选地，每2-3周给药。

在另一实施方案中且相对于人实体瘤，所述冷肿瘤能相对于RECIST(实体瘤响应评估标准)标准定义，其在2000年2月发表(Therasse P.等,New Guidelines to Evaluatethe Response to Treatment in Solid Tumors”,Journal of the National CancerInstitute,卷92,第3期,2000年2月2日)并在2009年更新(Eisenhauer E.A.等,Newresponse evaluation criteria in solid tumours:Revised RECIST guideline(version 1.1)”,European Journal of Cancer,Volume 45,Issue 2,228–247)。在此上下文中，在另一实施方案中，冷肿瘤与用一种或多种免疫检查点抑制剂治疗后少于部分反应(“PR”；即肿瘤是进行性的(“PD”，进行性疾病)或保持稳定(“SD”,稳定疾病))相关，所述抑制剂根据免疫检查点抑制剂标签说明给药。在另一实施方案中，冷肿瘤与用一种或多种免疫检查点抑制剂治疗后少于部分反应(“PR”；即肿瘤是进行性(“PD”，进行性疾病)或保持稳定(“SD”,稳定疾病))相关，所述抑制剂在至少6周，优选至少8周，更优选至少12周期间给药。在另一实施方案中，冷肿瘤是在抗PD-L1疗法后是进行性的乳腺癌肿瘤。

在另一实施方案中，冷肿瘤与一种或多种免疫检查点抑制剂根据免疫检查点抑制剂标签说明给药至少6周后，优选至少8周后，更优选至少12周后的进行性疾病(“PD”)相关。

在另一实施方案中，冷肿瘤是变得不响应一种或多种免疫检查点抑制剂，即先前响应一种或多种免疫检查点抑制剂治疗但变得不响应的肿瘤。

在另一实施方案中，冷肿瘤也可定义为在对一种或多种免疫检查点抑制剂初始响应后复发(即经历对治疗响应减少)的肿瘤，其中后者根据免疫检查点抑制剂标签说明给药。

在另一实施方案中，冷肿瘤是由医师分类为冷肿瘤的肿瘤。具体地，冷肿瘤的非限制性示例包括微卫星不稳定性低的结直肠癌肿瘤(MSI-low；Sinicrope,F.The Role ofMicrosatellite Instability Testing in Management of Colorectal Cancer”,Clinical Advances in Hematology&Oncology卷14,期号7 2016年7月)。已知这类肿瘤不响应免疫检查点抑制剂。这些肿瘤能鉴定为冷肿瘤，而不需首先用一种或多种免疫检查点抑制剂治疗以确定无响应。

如上所讨论，“冷肿瘤”不太响应免疫检查点抑制剂如抗PD-1或抗CTLA-4抗体治疗。此现象背后的原理可以是如果各肿瘤中没有免疫系统攻击，通过给定抑制剂抑制免疫检查点无法使任何方面(anything)变得更好。

具体地，黑素瘤、结直肠癌或肿瘤、胰腺癌或肿瘤、成胶质细胞瘤、卵巢癌或肿瘤和前列腺癌或肿瘤子集已知是冷肿瘤。

发明人显示采用包含(i)结合蛋白-毒素缀合物(包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分)和(ii)免疫检查点抑制剂的治疗能有效治疗这类冷肿瘤。

此发现是预料不到的且无法从免疫检查点抑制剂如抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1治疗或含蒽环类的结合蛋白-毒素缀合物所得的发现中预期。不受理论约束，似乎含蒽环类的结合蛋白-毒素缀合物能够使冷肿瘤对免疫检查点疗法敏感，即将其转化成热肿瘤，从而能用免疫检查点抑制剂有效治疗。

优选地，向患者施用2种不同物质的间隔不长于最长4周。

在一个实施方案中，所述含一或多个蒽环类毒素的结合蛋白-毒素缀合物在免疫检查点抑制剂前施用。

根据一个实施方案，所述至少一种蒽环类毒素部分是PNU-159682，其公开于Quintierei等.2005。

根据一个实施方案，所述至少一种蒽环类毒素部分是蒽环类PNU-159682的衍生物，具有下式(i)

式(i)

所述毒素在其波浪线处经接头与结合蛋白缀合。

PNU-衍生的蒽环类和其在抗体药物缀合物中的应用使能(enablingly)公开于同一申请人的WO2016102679。此出版物的内容通过引用纳入本文。

根据另一组实施方案，所述免疫检查点抑制剂是选自下组的至少一种：

·抗PD-1，

·抗PD-L1，

·抗PD-L2，

·抗CTLA-4，

·抗LAG3，

·抗CD40或抗CD40L，

·抗TIM3，

·抗OX40或抗OX40L(CD134/CD134L),

·抗CDH2，

·抗CD155，

·抗B7-H3，

·抗B7-H4，

·抗ID01，

·抗ID02，

·抗TD02，

·抗TIGIT，

·抗GITR，和/或

·抗半乳糖凝集素-9。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞活化抑制的PD-1/PD-L1通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗PD-1抗体，特别是纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗或替雷利珠单抗，或更优选单克隆抗PD-L1抗体，更优选阿特朱单抗、得瓦鲁单抗、阿维单抗或BMS-936559。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞活化抑制的PD-1/PD-L2通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗PD-1抗体，特别是纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗或替雷利珠单抗，或更优选单克隆抗PD-L2抗体。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞活化抑制的CTLA-4/B7通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗CTLA1-4抗体，更优选易普利姆玛或替西木单抗(tremelimumab)。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与抑制T细胞刺激和TREG活性的LAG3/MHC II类通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗LAG3抗体，特别是LAG525、BMS-986016、TSR-033、MK-4280或REGN3767。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞功能减少的TIM3/半乳糖凝集素-9通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗TIM3抗体或单克隆抗半乳糖凝集素-9抗体。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞活化抑制的TIGIT/CD112通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗TIGIT抗体或单克隆抗CD112抗体。

优选地，检查点抑制剂是拮抗参与T细胞活化抑制的TIGIT/CD155通路的化合物或单克隆抗体，更优选单克隆抗TIGIT抗体或单克隆抗CD155抗体。

优选地，检查点抑制剂是用作GITR激动剂的化合物或单克隆抗体，更优选激动性单克隆抗GITR抗体，特别是GWN323、BMS-986156、MK-4166、MK-1248、TRX518、INCAGN1876、AMG 228或INBRX-110。

优选地，检查点抑制剂是用作OX40激动剂的化合物或单克隆抗体，特别是激动性抗OX40单克隆抗体如MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469或MEDI6383。

优选地，检查点抑制剂是用作CD40激动剂的化合物或单克隆抗体，特别是激动剂抗CD40单克隆抗体如CP-870或CP-893。

在上面所讨论检查点抑制剂中，尤其优选结合或拮抗以下的化合物或单克隆抗体：

·PD-1，

·PD-L1，

·CTLA-4，和/或

·B7，

PD-1和PD-L1是最优选的靶。

根据另一组实施方案，所述缀合物在其波浪线处包括接头结构X–Li–L₂–L₃–Y，其中Li-L₃代表接头，且Li–L₃中的2个是强制性的，其中X和Y进一步各代表一个或多个任选存在的接头。

根据另一组实施方案，所述接头结构包括作为L₂的寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n，偶联所述蒽环类衍生物，直接或通过另一接头Li，且其中n是≥1且≤21的整数，优选2-5。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可以任选地由寡聚-丙氨酸(Ala)_n或混合Gly/Ala肽取代。

根据另一组实施方案，所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n通过命名为Li亚烷基二胺接头(EDA)缀合式(i)的蒽环类衍生物，亚烷基二胺接头通过第一酰胺键缀合蒽环类衍生物，同时其通过第二酰胺键缀合寡聚-甘氨酸肽的羧基末端，亚烷基二胺接头与寡聚-甘氨酸肽的所述缀合物具有下式(ii)

其中波浪线指示连接式(i)的蒽环类衍生物，其中m是≥1且≤11的整数，优选2-5，n是≥1且≤21的整数，优选2-5。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可任选地由寡聚-丙氨酸(Ala)_n取代。

根据另一组实施方案，所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n直接或通过另一接头Li，偶联式(ii)蒽环类衍生物的环A(其中蒽环类核心的环A如Shi等,2009所示)。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可任选地由寡聚-丙氨酸(Ala)_n取代。

根据另一组实施方案，所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n通过命名为Li的亚烷基氨基接头(EA)缀合式(i)的蒽环类衍生物，，亚烷基氨基接头通过酰胺键缀合寡聚-甘氨酸肽的羧基末端，所述亚烷基氨基接头与寡聚-甘氨酸肽的缀合物具有下式(iii)

其中波浪线指示连接式(i)蒽环类衍生物，其中m是≥1且≤11的整数，优选2-5，n是≥1且≤21的整数，优选2-5。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可选由寡聚-丙氨酸(Ala)_n取代。

根据另一组实施方案，所述接头结构L₃包括产生自分选酶识别基序特异性切割的肽基序。

分选酶识别基序用作所谓分选酶介导的抗体缀合(SMAC-技术)的标签，这使能公开于指定给同一申请人的WO2014140317。此出版物的内容通过引用纳入本文。在此技术中，分选酶缀合2个分子，其中一个携带这类识别基序，而另一个携带寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可任选地由寡聚-丙氨酸(Ala)_n取代。

根据另一组实施方案，所述分选酶识别基序包括至少一种下列氨基酸序列：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LAXTG、LPXTA或NPQTN，X是任何能想到的(conceivable)氨基酸序列。

根据另一组实施方案，所得接头具有至少一种下列氨基酸序列：-LPXTG_n-、-LPXAG_n-、-LPXSG_n-、-LAXTG_n-、-LPXTG_n-、-LPXTA_n-或-NPQTG_n-，G_n是寡聚或多聚甘氨酸，n是≥1且≤21的整数，A_n是寡聚或多聚丙氨酸，n是≥1且≤21的整数，X是任何能想到的氨基酸序列。

根据另一组实施方案，所述蒽环类衍生物通过一个或多个接头缀合结合蛋白的羧基末端，或其至少一个结构域或亚基的羧基末端。

根据另一组实施方案，所述结合蛋白通过酰胺键缀合寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n的氨基末端。重要的是理解在一个特定实施方案中(其中使用酿脓链球菌分选酶A，见下)，寡聚-甘氨酸(Gly)_n可选由寡聚-丙氨酸(Ala)_n取代。

所用分选酶优选是分选酶A。在一个实施方案中，其是来自酿脓链球菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的分选酶A。在一个实施方案中，使用经工程化的分选酶A，其仍识别分选酶A识别基序。在一个实施方案中，所述经工程化的分选酶A衍生自酿脓链球菌分选酶A。在一个其他实施方案中，所述经工程化的分选酶A衍生自金黄色葡萄球菌分选酶A。

根据另一组实施方案，所述结合蛋白是选自下组的至少一种：抗体、基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的修饰抗体形式、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段、替代性骨架和/或抗体模拟物。

其中，抗体是最优选类型的结合蛋白。

术语“抗体”、“基于抗体的结合蛋白”、“保留靶结合力的修饰抗体形式”、“保留靶结合力的抗体衍生物或片段”指多肽链，其显示对给定抗原、一个或多个表位的强单价、二价或多价结合。本发明所用抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段能用任何适当技术产生，如杂交瘤技术、核糖体展示、噬菌体展示、基因改组文库、半合成或全合成文库或其组合。本发明的抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段包括完整抗体以及含完整抗体抗原结合部分并保留结合同源抗原能力的抗体片段或抗体结合片段。除非本文另有规定，所有肽序列以N→C顺序引用，包括所有抗体和抗原结合片段序列。

完整抗体一般包括通过二硫键相互连接的至少2条重(H)链(约50-70kD)和2条轻(L)链(约25kD)。编码抗体链的公认免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体的各重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区。在IgG的情况中，重链恒定区包括3个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括1个结构域CL。重和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多个免疫系统细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)。单克隆抗体(mAb)由相同抗体分子组成。

抗体的VH和VL区能进一步细分成超突变区，也称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守框架区(FR)。各VH和VL包括3个CDR和4个FR，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR和FR区的位置以及编号系统如本文所用IMGT系统(Lefranc MP等、2015)所定义。

本发明的抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段还涵盖单链抗体。术语“单链抗体”指含V_H结构域和V_L结构域的多肽，所述结构域以多肽连接，一般经间隔肽连接，且其可在氨基和/或羧基末端包括额外结构域或氨基酸序列。例如，单链抗体可包括系链区段以连接编码多核苷酸。例如，单链可变区片段(scFv)是单链抗体。相较于由单独基因编码Fv片段的V_L和V_H结构域，scFv具有2个通过合成接头连接(如经重组方法)的结构域。这能使其制备为单蛋白链，其中V_L和V_H区配对形成单价分子。

基于抗体的结合蛋白示例是多肽，其中抗体的结合域与其他多肽或多肽结构域如替代性分子骨架、Fc区、其他多肽或抗体的其他功能性或结构域组合，产生带有额外结合特性的分子，如双或多特异性蛋白或抗体。这类多肽能形成在天然产生抗体或抗体片段中通常不出现的结合或功能结构域排列。

抗体结合片段示例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，含2个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区由二硫键连接；(iii)Fd片段，由V_H和C_H1结构域组成；(iv)Fv片段，由完整抗体单臂的V_L和V_H结构域组成；(v)二硫键稳定化的Fv(dsFv)，具有结构保守框架区之间改造的链间二硫键；(vi)单域抗体(dAb)，由V_H或V_L结构域组成，如Ward等,Nature 341:544-546,1989)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)，作为线性或环状肽。

本发明的抗原结合片段还涵盖有骆驼科骨架的单域抗原结合单位。骆驼科动物包括骆驼、美洲驼和羊驼。骆驼生成没有轻链的功能抗体。重链可变(V_H)结构域自动折叠且作为抗原结合单位独立发挥作用。其结合表面仅涉及3个CDR，相比之下，经典抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)有6个CDR。骆驼抗体能够达到与常规抗体相当的结合亲和性。

术语“人抗体”指抗体、基于抗体的结合蛋白或抗原结合片段，其包含衍生自人免疫球蛋白的序列，从而几乎所有CDR区具有人来源，且几乎所有FR区对应人免疫球蛋白序列的那些。

术语“替代性骨架”和“抗体模拟物”指不属于免疫球蛋白家族的蛋白，和甚至非蛋白如适体或合成聚合物。一些类型具有抗体样β-折叠结构。“抗体模拟物”或“替代性骨架”相对抗体的潜在优势是溶解度更佳、组织渗透更高、针对热和酶的稳定性更高、以及生产成本较低。

一些抗体模拟物能以大库形式提供，其提供针对各可想象靶的特异性结合候选物。正如抗体，靶特异性抗体模拟物能用高通量筛选(HTS)技术以及惯用的展示技术如噬菌体展示、细菌展示、酵母或哺乳动物展示来开发。当前开发的抗体模拟物涵盖例如锚重复蛋白(称为DARPins)、C型凝集素、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的A结构域蛋白、转铁蛋白、脂质运载蛋白、纤连蛋白III型第十结构域、Kunitz结构域蛋白酶抑制剂、泛素源性粘合剂(称为affilins)、γ晶体蛋白源性粘合剂、半胱氨酸结或打结素、基于硫氧还蛋白A骨架的粘合剂、核酸适体、通过分子印迹聚合物生成的人工抗体、来自细菌基因组的肽库、SH-3结构域、stradobodies,通过二硫键和Ca2+稳定的膜受体"A结构域"、基于CTLA4的化合物、Fyn SH3和适体(结合特异性靶分子的寡核酸或肽分子)。

本发明的抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段可结合癌细胞上或肿瘤癌细胞环境内的任意适当靶。在一个实施方案中，所述本发明抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段与癌细胞表面上的靶结合。在一个优选实施方案中，此靶在癌细胞上专一表达或相对于健康组织在癌细胞上过表达。申请者提示以下的任何靶是适当靶：与本发明抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段在癌细胞上结合，且导致本发明抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段以及蒽环类毒素部分内化到细胞中，引起该细胞的免疫原性细胞死亡和/或免疫细胞(如T细胞)浸润到肿瘤内。技术人员能够通过文献和实验中的检测来鉴定这类靶。

在一个实施方案中，所述适当靶包括ROR1、CS-1、HER2、间皮素和ROR2。在一个实施方案中，所述本发明抗体、基于抗体的结合蛋白和抗原结合片段与ROR1结合。

根据本发明的另一实施方案，所述结合蛋白-毒素缀合物所含结合蛋白是以下抗体

a)包括下列SEQ ID NO对所示重链/轻链可变结构域序列对包含的一组重链/轻链互补决定区(CDR):

1和2，3和4，5和6/或20和21

b)包括一组重链/轻链互补决定区(CDR)，含有下列SEQ ID NO，采用顺序(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)

·22、23、24、25、26和27、

·28、29、30、31、32和33、

·34、35、36、37、38和39、和/或

·40、41、42、43、44和45.

c)包括b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，附带条件是所述CDR的至少之一相对于相应的(respective)SEQ ID NO具有至多3个氨基酸取代，和/或

d)包括b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)，附带条件是所述CDR的至少之一相对于相应的SEQ ID NO具有≥66％的序列相同性，

其中CDR嵌入合适的蛋白框架，从而能够以足够的结合亲和性与ROR1结合。

本文所用术语“CDR”或“互补决定区”意在指重链和轻链多肽可变区内发现的非连续抗原组合位点。这些特定区域描述于Kabat等(1977),Kabat等(1991),Chothia等(1987)和MacCallum等,(1996)，其中定义包括氨基酸残基彼此比较时的重叠或亚组。然而，应用任一定义来指抗体或移植抗体或其变体的CDR，意在包括于本文所定义和所用术语范围内。涵盖上面各引用文献所定义CDR的氨基酸残基如下表所列，作为对照。应注意此编号方式可不同于CDR，后者实际在附上的序列表中公开，因为CDR定义因情况而异。

	Kabat	Chothia	MacCallum
				VH CDR1	31-35	26-32	30-35
VH CDR2	50-65	53-55	47-58
				VH CDR3	95-102	96-101	93-101
VL CDR1	24-34	26-32	30-36
				VL CDR2	50-56	50-52	46-55
VL CDR3	89-97	91-96	89-96

CDR定义

本文所用术语“框架”关于抗体可变区使用时，是指抗体可变区之内CDR区外的所有氨基酸残基。因此，可变区框架长度为约100-120氨基酸，但意在仅指CDR外的那些氨基酸。

本文所用术语“能够以充分的结合亲合性结合靶X”应理解为指各结合域与KD为10-4或更小的靶结合。KD是蛋白粘合剂与其抗原之间的平衡解离常数，koff/kon比例。KD及亲和性呈逆相关。KD值涉及蛋白粘合剂浓度(特定实验所需的蛋白粘合剂量)，因而KD值越低(浓度越低)，结合域的亲和性越高。下表显示单克隆抗体的典型KD范围

K<sub>D</sub>值	摩尔范围
		10<sup>-4</sup>-10<sup>-6</sup>	微摩尔(μM)
10<sup>-7</sup>-10<sup>-9</sup>	纳摩尔(nM)
		10<sup>-10</sup>-10<sup>-12</sup>	皮摩尔(pM)
10<sup>-13</sup>-10<sup>-15</sup>	飞摩尔(fM)

K_D和摩尔值

优选地，蛋白粘合剂具有至多2个氨基酸取代，更优选至多1个氨基酸取代。

优选地，至少一种CDR相对于相应的SEQ ID NO的序列相同性≥67％；≥68％；≥69％；≥70％；≥71％；≥72％；≥73％；≥74％；≥75％；≥76％；≥77％；≥78％；≥79％；≥80％；≥81％；≥82％；≥83％；≥84％；≥85％；≥86％；≥87％；≥88％；≥89％；≥90％；≥91％；≥92％；≥93％；≥94％；≥95％；≥96％；≥97％；≥98％；≥99％，且最优选100％。

本文所用“序列相同性百分比”如下测定：通过在比较窗口中比较2条最优比对的序列，其中比较窗口内的多核苷酸序列部分相较于参考序列(如多肽)可包括添加或缺失(即缺口)，参考序列不包括添加或缺失，以用于2条序列的最优比对。百分比如下计算：确定2条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，结果乘以100以产生序列相同性百分比。

在2条或更多核酸或多肽序列背景中的术语“相同”或“相同性”百分比涉及序列相同的2条或更多序列或子序列。当在比较窗口中对比和为了最大对应性比对时，或指定区用一种下列序列比较算法或通过手动对齐和目测来测量，如果2条序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即相比指定区域或未指定时相比参考序列的完整序列，有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性)，则2条序列“基本相同”。公开内容提供多肽或多核苷酸，分别与本文所例示多肽或多核苷酸基本相同。可选地，相同性在至少约15,25或50核苷酸长度的区域中存在，或更优选在100-500或者1000或更大核苷酸长度区域中，或在全长参考序列中。关于氨基酸序列，一致或基本一致能在至少5,10,15或20氨基酸长度的区域中存在，可选至少约25,30,35,40,50,75或100氨基酸长度，可选至少约150,200或250氨基酸长度，或全长参考序列。关于较短氨基酸序列如20个或更少氨基酸的氨基酸序列，当1个或2个氨基酸残基根据本文所定义保守取代被保守置换时，存在基本一致。

优选地，至少一种CDR接受CDR序列修饰，包括

·亲和性成熟，

·免疫原性降低。

亲和性成熟是给定抗体亲和性体外增加的过程。如同天然对应物，体外亲和性是基于成熟和选择原则。其成功用于优化抗体、抗体片段或其他肽分子如抗体模拟物。CDR内的随机突变用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入。另外，遗传多样性能通过链置换增加。2或3轮采用展示方法如噬菌体展示的突变和选择，通常产生低纳摩尔范围亲和性的抗体片段。原理参见Eylenstein等.(2016)，其内容通过引用纳入本文。

工程抗体包含鼠-序列衍生CDR区，与任何必需的框架回复突变一起移植到序列衍生V区。因此，当人源化抗体给予患者时，CDR本身能导致免疫原性反应。降低CDR所导致免疫原性的方法公开于Harding等.(2010)，其内容通过引用纳入本文。

根据本发明的另一个实施方案，所述结合蛋白-毒素缀合物所含结合蛋白是以下抗体

a)下列SEQ ID NO对所示重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对:

1和2，3和4，5和6，和/或20和21

b)a)的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对，附带条件是

·HCVD与相应的SEQ ID NO的序列相同性≥80％,和/或

·LCVD与相应的SEQ ID NO的序列相同性≥80％,

c)a)或b)的重链/轻链可变结构域(VD)对，附带条件是HCVD或LCVD至少之一相对于相应的SEQ ID NO具有至多10个氨基酸取代，

所述蛋白粘合剂仍能够以足够的亲和性结合ROR1。

“可变结构域”关于抗体或其重或轻链使用时，意在指向分子赋予抗原结合而不是恒定区的抗体部分。该术语意在包括其功能片段，所述片段维持全可变区所有结合功能中的一部分。例如，可变区结合片段包括功能片段如Fab、F(ab)₂、Fv、单链Fv(scfv)等。这类功能片段为本领域技术人员熟知。因此，使用这些术语描述异聚可变区的功能片段，意在对应本领域技术人员熟知的定义。这类术语描述于例如Huston等,(1993)或Plückthun和Skerra(1990)。

优选地，HCVD和/或LCVD相对于相应的SEQ ID NO的序列相同性≥81％；≥82％；≥83％；≥84％；≥85％；≥86％；≥87％；≥88％；≥89％；≥90％；≥91％；≥92％；≥93％；≥94％；≥95％；≥96％；≥97％；≥98％；≥99％；或最优选100％。

根据本发明的另一个实施方案，所述结合蛋白包括的至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。

本文所用“保守氨基酸取代”对抗体功能的影响小于非保守氨基酸取。尽管有许多分类氨基酸的方法，其通常基于结构和R基团一般化学特征而归入6个主要组。

在一些实施方案中，“保守氨基酸取代”中，氨基酸残基用带相似侧链的氨基酸残基取代。例如，具有相似侧链的氨基酸残基家族如本领域所定义。这些家族包括以下氨基酸

·碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，

·酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)，

·不带电极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，

·非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，

·β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和.

·芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

其他保守氨基酸取代也能跨氨基酸侧链家族发生，例如当天冬酰胺取代天冬氨酸以修饰肽电荷。保守性变化还能包括取代化学上同源非天然氨基酸(即合成非天然疏水氨基酸取代亮氨酸，合成非天然芳香族氨基酸取代色氨酸)。

根据本发明的另一个实施方案，所述结合蛋白相较于上面描述的抗体，有至少50％的ROR1靶结合亲和性。

本文所用术语“结合亲和性”意在指结合相互作用的强度，因而包括实际结合亲和性以及表观结合亲和性。实际结合亲和性是结合速率相比接力速率之比。因此，赋予或优化结合亲和性包括改变这些组分之一或两者以达到所需水平的结合亲和性。例如，表观亲和性可包括相互作用的亲和力。例如，二价异聚可变区结合片段由于其化合价可展现改变或优化的结合亲和性。

用于测量结合剂亲和性的合适方法是通过表面等离子体共振(SPR)。此方法是基于在表面等离子体波于金属/液体界面激发时发生的现象。光直射和反射自不接触样品的表面侧边，SPR导致反射光密度在特定组合的角度和波长处减少。生物分子结合事件引起表面层的折射率变化，其作为SPR信号变化检测。结合事件可以是受体-配体对之间的结合或解离。折射率变化能本质上同时测量，因而允许检测亲和常数的个体组分。更特定地，所述方法能够精确测量结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。

测量k_on和k_off值可能有利，因为其能鉴定治疗上更有效的经改变可变区或经优化可变区。例如，经改变可变区或其异聚结合片段可能更有效，因为其例如相较展现类似结合亲和性的可变区或异聚结合片段，具有更高的k_on值。功效增加，因为k_on值更高的分子可以更快速度特异性结合和抑制其靶。类似地，本发明分子可能更有效，因为其相较具有类似结合亲和性的分子，显示k_off值更低。在k_off速率较低的分子中能观察到功效增加，因为一旦结合，分子从其靶解离更慢。尽管参考本发明的经改变可变区和优化可变区，包括其杂聚可变区结合片段，但上面就测量结合及解离速率所述的方法也适用于本质上任意蛋白粘合剂或片段，以出于治疗或诊断目的鉴定更有效粘合剂。

另一测量粘合剂亲和性的合适方法是在表面通过FACS/斯卡查德分析。

本领域熟知用表面等离子体共振测量亲和性的方法，包括结合和解离速率，且能描述于例如Jonsson和Malmquist(1992)以及Wu等(1998)。此外，本领域熟知用于测量结合相互作用的装置是BIAcore 2000仪器，其市售可得自法玛西亚生物传感器(PharmaciaBiosensor，瑞典乌普萨拉)。

所述靶结合亲和性相较参考结合剂优选是≥51％、≥52％、≥53％、≥54％、≥55％、≥56％、≥57％、≥58％、≥59％、≥60％、≥61％、≥62％、≥63％、≥64％、≥65％、≥66％、≥67％、≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％，最优选≥99％。

根据本发明的另一个实施方案，所述结合蛋白与上述抗体竞争结合ROR1。

根据本发明的另一个实施方案，所述结合蛋白在ROR1上结合的区域与上述抗体基本相同或相同。

本文所用术语“竞争结合”参照上面序列所定义抗体之一使用，意味着实际蛋白粘合剂具有与所述序列所定义蛋白粘合剂结合相同靶或者靶表位或结构域或亚结构域的活性，且是后者的变体。结合效率(如动力学或热力学)可与后者相同或者大于或小于其。例如，结合底物的平衡结合常数可就2种抗体而言不同。

这种结合竞争能用竞争性结合试验适当测量。这类试验公开于Finco等.2011，其内容通过引用纳入本文，并且其用于解释专利权利要求的含义公开于Deng等2018，其内容通过引用纳入本文。

为测试此特征，可获得合适的表位作图技术，包括

·X射线共结晶和低温电子显微镜(cryo-EM)

·基于阵列的寡肽扫描

·定点诱变作图

·高通量鸟枪突变表位作图

·氢氘交换，和/或

·交联偶联的质谱

这些方法公开并讨论于Banik等(2010)和DeLisser(1999)，其内容通过引用纳入本文。

实施例

本发明通过附图和上面说明来详细阐明和描述，这类阐明和描述被视作说明性或示范性，而不是限制性；本发明不限于公开的实施方案。所公开实施方案的其他变化能由本领域技术人员在实践要求权利的发明时，通过学习附图、公开内容和所附权利要求而理解并实施。在权利要求中，单词“包含”不排除其他元素或步骤，不定冠词“一种”或“一个”不排除复数。单纯的事实是某些量度以相互不同的独立权利要求形式引用，不表示这些量度的组合无法有益使用。权利要求中的任何参考标志不应视作限制范围。

本文公开的所有氨基酸序列从N末端到C末端显示；本文公开的所有核酸序列以5'→3'显示。

实施例1.产生纯化、重组的抗人ROR1和同种型对照抗体

表达载体：抗体可变区编码区通过总基因合成(金斯瑞(GenScript))生成，使用MNFGLRLIFLVLTLKGVQC作为前导序列，并且适当时用人IgH-γ1和IgL-κ或IgL-λ恒定区在表达载体pCB14中组装。此载体是游离型哺乳动物表达载体pCEP4(英杰(Invitrogen))的衍生物，携带EBV复制起点，编码EBV核抗原(EBNA-1)以允许染色体外复制，且包含嘌呤霉素选择标记取代初始潮霉素B抗性基因。

表达和纯化：基于pCB14的表达载体转染入HEK293T细胞，使用

LTX试剂，带有PLUS^TM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，瑞士赖纳赫，15388100)；然后是孵育1天(37℃，5％CO₂，生长培养基:杜氏改良Eagle培养基(DMEM)高葡萄糖(4.5g/L)，具有L-谷氨酰胺，带10％(v/v)胎牛血清(FCS)，100IU/mL青霉素-链霉素-两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺(全部都是Bioconcept,瑞士阿尔施维尔))，细胞在选择条件下扩增(2μg/mL嘌呤霉素(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich),Buchs SG,瑞士,2mg/mL的P8833-25mg储液))。细胞分裂并进一步扩增(37℃,5％CO₂)；一旦达到汇合，组织培养皿在37℃包被有20μg/ml多聚L-赖氨酸(西格玛奥德里奇,P1524)2小时并用PBS洗2次。随后，细胞用胰蛋白酶处理并在多聚L-赖氨酸-包被板上1:3分裂。再次达到汇合后，细胞用PBS洗涤，然后培养基替换为生成培养基(DMEM/F-12,Gibco/赛默飞世尔科技,31330-03)，补充有1μg/mL嘌呤霉素(西格玛(Sigma),P8833),100IU/mL青霉素-链霉素-两性霉素B(Bioconcept),161μg/mL N-乙酰-L-半胱氨酸(西格玛奥德里奇,A8199)和10μg/mL L-还原型谷胱甘肽(西格玛奥德里奇,G6529)。上清每二周一次收集并过滤(0.22μm)以移出细胞，4℃保存直至纯化。

对于纯化，过滤的上清加载到PBS-平衡蛋白A HiTrap柱(通用电气医疗集团(GEHealthcare),德国法兰克福,17-0405-01)或JSR Amsphere^TM蛋白A柱(JSR生命科学公司(JSR Life Sciences),比利时勒芬,JWT203CE)，用PBS洗涤；洗脱用0.1M甘氨酸(pH 2.5)在AEKTA纯(通用电气医疗集团)上进行。各部分立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和，通过SDS-PAGE分析蛋白纯度和完整度。将含蛋白的部分混合并用Amicon过滤单元(密理博(Millipore),瑞士沙夫豪森,UFC901008)进行缓冲液交换以达到PBS中的1:100稀释度，随之用低保留率滤器(0.20μm,Carl Roth,德国卡尔斯鲁厄,PA49.1)过滤灭菌。

抗体在CHO细胞中通过本领域已知方法瞬时表达，重组抗体通过标准蛋白A纯化从CHO细胞上清中纯化，如本领域已知。重组抗体的纯度和完整度通过SDS-PAGE分析。

表1.用于实施例的抗hROR1和同种型对照抗体

实施例2.mAb用SMAC-技术^TM缀合甘氨酸修饰毒素以形成ADCC

分选酶A.按照WO2014140317A1所述技术，在大肠杆菌中生成基于金黄色葡萄球菌的重组及亲和性纯化分选酶A。

产生甘氨酸修饰毒素.为了产生SMAC-技术^TM缀合的ADC，五甘氨酸-EDA-PNU衍生物(G5-EDA-PNU)由康诺泰(Concortis)生产(如图1所示)。五甘氨酸修饰毒素的特性和纯度分别通过质谱及HPLC确认。G5-EDA-PNU显示>95％纯度，如HPLC层析所确定。

分选酶介导的抗体缀合.上述毒素按照表2缀合抗体：带LPETG标签的mAb[10μM]与甘氨酸修饰毒素[200μM]和3μM分选酶A在所列缀合缓冲液中25℃孵育3.5h。反应通过使其经过蛋白A GraviTrap柱(伯乐(BioRad))来终止。结合的缀合物用5个柱体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸pH 2.5,50nM NaCl)洗脱，1个柱体积的部分收集到含25％v/v1M HEPES pH 8的管内以中和酸。收集含蛋白的部分并配制到表2的制剂缓冲液中，使用ZebaSpin脱盐柱。

ADC分析法.药物抗体比(DAR)通过反相层析评价，在Polymer Labs PLRP 2.1mmx5cm,5μm柱上以1mL/min/80℃运行，25分钟线性梯度为0.05-0.1％TFA/H₂O和0.04-0.1％TFA/CH₃CN。样品首先通过用DTT在pH 8.0,37℃孵育15分钟来还原。由反相层析测定的DAR概括于下表2。

表2：此研究中产生的ADC分析总结。DAR,药物与抗体之比。ND,未确定。

从这些分析能推断，SMAC-技术^TM缀合以高效推进。

实施例3.产生稳定表达人ROR1的EMT-6细胞

鼠EMT-6乳腺癌细胞在DMEM完全培养基(杜氏改良Eagle培养基(DMEM)高葡萄糖(4.5g/L)，具有L-谷氨酰胺，带10％(v/v)胎牛血清(FCS),100IU/mL青霉素-链霉素-两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺(全部都是Bioconcept,瑞士阿尔施维尔))中于37℃和5％CO₂培养。细胞通过转座如下改造成过表达ROR1：细胞离心(6min,290x g,4℃)并重悬于RPMI-1640培养基(5x10⁶细胞/mL)。400μL细胞悬液随后加入400μL RPMI，后者含有13.3μg可转座载体pPB-PGK-Puro-ROR1(指导共表达全长ROR1(NP_005003.2)以及嘌呤霉素抗性基因)和6.6μg含转座酶载体pCDNA3.1_hy_mPB。DNA/EMT-6细胞混合物移至电穿孔杯(0.4cm-间距,165-2088,伯乐,瑞士克雷谢)并用伯乐电穿孔系统(Biorad Gene Pulser II)进行电穿孔，电容扩展器处于300V和950μF。然后，细胞在室温孵育5-10分钟。孵育后，细胞在Eppendorf5810R离心机中290x g离心6分钟，洗一次，随后重悬于DMEM完全培养基，接着在加湿培养箱中于37℃,5％CO₂孵育。电穿孔后一天，通过加入3μg/mL嘌呤霉素(西格玛奥德里奇,P8833)，选择稳定表达人ROR1的细胞池。

表达ROR1的单细胞克隆衍生自抗生素选择的EMT-6-ROR1细胞。简言之，胰蛋白酶处理后，10⁶细胞在FACS管内离心；所得团块重悬于缓冲液(带2％(v/v)FCS的PBS)。细胞随之用抗ROR1抗体2A2孵育30分钟(4℃,终浓度2μg/mL)，然后是离心和洗涤。接着，细胞如前所述重悬且用抗人IgG抗体(Fcγ-特异性)PE(eBioscience,奥地利维也纳,12-4998-82)以1:250稀释度避光处孵育(30min,4℃)，缓冲液中洗一次，冰上保存，直至通过FACS进行单细胞分选表达抗原的细胞，采用FACSAriaII仪器(BD生物科学(BD Biocsiences),美国圣何塞)。

实施例4.在EMT-6-ROR1同系乳腺肿瘤模型中体内评估抗ROR1 ADC

溶于100μl PBS的1x10⁶ EMT-6-ROR1克隆14肿瘤细胞原位植入各BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫。达到约30-80mm³(通过卡尺)的平均肿瘤体积后，在第0天(D0)，小鼠各根据肿瘤尺寸集区随机分成8只动物一组。小鼠随后用不同剂量(0.25mg/kg,0.5mg/kg和1mg/kg)治疗一次(图3)，以确定次优剂量，其中ADC仅导致部分抗肿瘤反应。其后，就低剂量ADC治疗建立同一模型，包括同种型匹配对照ADC以及与或未与10mg/kg抗CTLA4免疫检查点抑制剂mAb9D9联合治疗，如表3所述。监测小鼠直到至少40天，在过度肿瘤负荷或痛苦征兆的情况下处以安乐死。免疫检查点抑制剂9D9是小鼠CTLA-4的抑制剂且在PBS中配制，购自BioXcell,美国新罕布什尔州西黎巴嫩。

表3：用于体内评估基于PNU毒素的ADC的实验组，联合检查点抑制剂

肿瘤体积在每周二次卡尺测量肿瘤尺寸的基础上确定。为计算组的平均肿瘤体积，考虑在讨论日仍存活的动物的值。另外，由于其肿瘤负荷而处以安乐死的动物的肿瘤体积用末次观察推进(LOCF)法测试，只要这增加组的平均/中值肿瘤体积。

图4呈现个体小鼠的肿瘤体积演变以及平均肿瘤体积演变。肿瘤体积演变用于如下治疗的个体小鼠：(A)载剂对照，(B)Ac10-G5-PNU同种型对照，(C)XBR1-402-G5-PNU，(D)Ac10-G5-PNU同种型对照加抗小鼠CTLA-4抗体9D9，(E)XBR1-402-G5-PNU加抗小鼠CTLA-4抗体9D9。(F)用于下列组的平均组肿瘤体积演变(应用末次观察推进(LOCF)法)：载剂对照，Ac10-G5-PNU同种型对照和XBR1-402-G5-PNU。(G)用于下列组的平均组肿瘤体积演变：载剂对照，Ac10-G5-PNU同种型对照和抗小鼠CTLA-4抗体9D9，XBR1-402-G5-PNU和抗小鼠CTLA-4抗体9D9。

如图中结果所示，XBR1-402-G5-PNU与抗小鼠CTLA-4抗体9D9的组合提供相对于单独用0.25mg/kg ADC的个体治疗，增强的抗肿瘤反应。此外，图D显示相对于载剂(图A)和同种型对照(图B)，抗小鼠CTLA-4抗体9D9表现出一些抗肿瘤功效，支持了EMT-6-ROR1肿瘤模型能鉴定为热肿瘤模型。

另外，组11的所有存活小鼠(但不在其他组？–可能随后重要显示？)受到保护免于1x10⁶ EMT-6-ROR1克隆14肿瘤细胞再攻击(第102天)时的肿瘤生长，所述细胞植入先前未注射(未显示)的乳腺脂肪垫，表明仅ADC与检查点抑制剂组合可产生保护性抗肿瘤免疫反应。

实施例5.产生稳定表达人ROR1的CT-26和B16-F10细胞

鼠CT-26结肠癌细胞和B16-F10(“B16”)黑素瘤细胞(都来自ATCC)在RPMI培养基中37℃，5％CO₂培养，所述培养基带有10％(v/v)胎牛血清(FCS),100IU/mL青霉素-链霉素-两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺(全部都是Bioconcept,瑞士阿尔施维尔)。细胞通过转座如下改造成过表达ROR1：细胞在Eppendorf 5810R离心机中离心(6min,290xg,4℃)并重悬于RPMI培养基(5x10⁶细胞/mL)。400μL细胞悬液随后加入400μL RPMI，后者含有13.3μg可转座载体pPB-PGK-Puro-ROR1(指导共表达全长ROR1(NP_005003.2)以及嘌呤霉素抗性基因)和6.6μg含转座酶载体pCDNA3.1_hy_mPB。DNA/CT-26或B16细胞混合物移至电穿孔杯(0.4cm-间距,165-2088,伯乐,瑞士克雷谢)并用伯乐电穿孔系统(Biorad Gene Pulser II)进行电穿孔，电容扩展器处于300V和950μF。然后，细胞在室温孵育5-10分钟。孵育后，细胞在290x g离心6分钟，洗一次，随后重悬于RPMI完全培养基，接着在加湿培养箱中于37℃,5％CO₂孵育。电穿孔后一天，通过加入3μg/mL嘌呤霉素(西格玛奥德里奇,P8833)，选择稳定表达人ROR1的细胞池。

表达ROR1的CT-26单细胞克隆衍生自抗生素选择的细胞。简言之，胰蛋白酶处理后，10⁶细胞在FACS管内离心；所得团块重悬于缓冲液(带2％(v/v)FCS的PBS)。细胞随之用抗ROR1抗体XBR1-402孵育30分钟(4℃,终浓度2μg/mL)，然后是离心和洗涤。接着，细胞如前所述重悬且用抗人IgG抗体(Fcγ-特异性)PE(eBioscience,奥地利维也纳,12-4998-82)以1:250稀释度避光处孵育(30min,4℃)，缓冲液中洗一次，冰上保存，直至通过FACS进行单细胞分选表达抗原的细胞，采用FACSAriaII仪器(BD生物科学,美国圣何塞)。图5(A)显示经改造CT-26克隆3的染色结果。下面实验所用B16池中的ROR1表达也通过FACS确定(图5(B))。

实施例6.用抗ROR1 ADC以及联合免疫检查点抑制剂治疗的过表达hROR1的CT26结肠癌小鼠模型

CT26在小鼠模型中建立了温到热肿瘤，意味着这些给药足够高时响应免疫检查点抑制剂(Mosely,S.等,2017)。根据表4，实验组各包含8只6-8周龄雌性BALB/c小鼠。溶于100μl PBS的1x10⁶ CT-26-ROR1克隆3肿瘤细胞(来自实施例5)植入各小鼠单边侧腹。达到约30-100mm³(通过卡尺)的平均肿瘤体积后，在第0天(D0)，小鼠根据肿瘤尺寸随机分组。小鼠随后根据表4治疗且每周监测3次，持续42天或直至肿瘤达到1500mm³(通过卡尺)。RPM1-14(BioXcell,美国新罕布什尔州西黎巴嫩)是小鼠PD-1的抑制剂且在PBS中配制。此免疫检查点抑制剂作为单一疗法以低于其有效剂量给药，如前面通过Oncotest所测定(数据未显示)。

表4：用于体内评估抗ROR1 ADC与免疫检查点抑制剂的实验组

图6呈现各组中个体小鼠的肿瘤体积演变：(A)1组的载剂对照(未治疗)，(B)2组的同种型对照，(C)3组的抗ROR1 ADC huXBR1-402-17-G3-PNU，(D)4组的同种型对照加免疫检查点抑制剂抗小鼠PD-1，(E)7组的抗ROR1 ADC huXBR1-402-17-G3-PNU加免疫检查点抑制剂抗小鼠PD-1抗体。强调靶向-ADC以显著低于作为单一疗法完全反应所需的剂量给药，如图C所示。结果表明在所评估免疫检查点抑制剂与含靶向PNU衍生物的ADC之间存在强协同。

实施例7.过表达hROR1的B16黑素瘤小鼠模型，用抗ROR1 ADC以及联合免疫检查点抑制剂治疗

B16在小鼠模型中建立了弱免疫原性(冷)肿瘤(Celik,C.等.1983)，意味着这些在合理范围内即至多约50-100pg/小鼠给药时不响应免疫检查点抑制剂(Grosso,J.等,2013)。根据表7，实验组各包含10只8-9周龄雌性BL6/6NRj。溶于100μl Hanks平衡盐溶液(HBSS,赛默飞世尔(Thermo Fischer))的2x10⁵ B16-ROR1肿瘤细胞(来自实施例5)在第0天(D0)i.v.注入各小鼠。小鼠通过简单随机分配分入各组并根据表5治疗，在12-19天中一周监测5天。

表5：用于体内评估抗ROR1 ADC与免疫检查点抑制剂的实验组

在监测的最后一天，小鼠通过CO₂处以安乐死，然后是全肺收集和固定于布安液(Labforce Bio-Optica)。各肺表面(代表B16-ROR1菌落)上实验诱导的转移(Saxena M.等,2013)进行目测计数，各自评估以在盲选条件下分配到3个箱子之一(直径<1mm,1-2mm,>2mm)。各肺上菌落的体积随后根据下式确定(各菌落近似为球体)：

集落体积(mm³)＝计数(直径<1mm的斑点)x 0.004mm³+计数(直径1-2mm的斑点)x0.21mm³+计数(直径>2mm的斑点)x 0.485mm³

统计分析用GraphPad Prism和均值的未配对T检验进行。P值<0.05视作统计上显著(*)，P值≥0.5视作统计上不显著(n.s.)。

图7呈现表5中不同治疗组的菌落体积。这些结果表明在没有显著免疫检查点抑制剂影响的弱免疫原性(“冷”)肿瘤中，所评估免疫检查点抑制剂与含靶向PNU衍生物的ADC之间存在强协同。

实施例8.过表达hROR1的B16黑素瘤小鼠模型，用抗ROR1 ADC治疗

根据表6，实验组包含8-9周龄雌性BL6/6NRj。将100μl Hanks平衡盐溶液(HBSS,赛默飞世尔)中的10⁶B16-ROR1肿瘤细胞(来自实施例5)植入各小鼠单边侧腹。达到约250mm³(通过卡尺)的平均肿瘤体积后，在第0天(D0)，小鼠根据表6的肿瘤尺寸随机分组。小鼠随后根据表6治疗且在给药后24小时处以安乐死，然后是肿瘤提取。

表6：用于体内评估抗ROR1 ADC的实验组

肿瘤在最佳切割温度化合物(oct，来自飞世尔科技公司(Fischer Scientific))中速冻。冷冻切片用商业抗小鼠CD4和抗小鼠CD8一抗(分别为GK1.5 BioLegend 100402和53-6.7BioLegend 100702)染色。检测用抗大鼠抗体(AlexaFluor488,英杰A21208)进行。

图8显示过表达hROR1(人ROR1)的B16肿瘤冷冻切片的CD4和CD8染色各图像，所述切片来自(A)未治疗对照小鼠和(B)3只用ADC(一次，4mg/kg)根据表6治疗的小鼠。根据图8(A)，B16肿瘤天然包含低水平的CD4+和CD8+细胞，与B16肿瘤作为冷肿瘤的状态一致。图8(B)显示根据本发明的ADC治疗可增加肿瘤内的CD4+和CD8+细胞数。

另外，过表达hROR1(人ROR1)的CT-26和B-16肿瘤进行机械和酶消化，接受用于活细胞和免疫细胞标志物的FACS染色以确认T细胞群。使用表7报告的FACS染色方案，联合LIVE/DEAD^TMFixable Near-IR死细胞染色试剂盒以用于633或635nm激发染色试剂(赛默飞世尔)。

表7：用于免疫细胞群染色的FACS染色抗体

图9显示2个肿瘤模型(未治疗)中CD4(图A)和CD8(图B)阳性T细胞群的激活状态，确认了过表达hROR1(人ROR1)的B16肿瘤模型的冷性质。

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序列

下列序列形成本申请公开内容的一部分。本申请也提供WIPO ST 25相容性电子序列表。为免生疑问，如果下表与电子序列表的序列之间存在差异，此表中的序列应视作正确的。

序列表

<110> 恩比伊治疗股份公司

<120> 包含蒽环类的结合蛋白-毒素缀合物，和其在免疫肿瘤学应用中的用途

<130> ND40832

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> XBR1-402 HC amino acid sequence

<400> 1

Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

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385 390 395 400

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420 425 430

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435 440 445

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> XBR1-402 LC amino acid sequence

<400> 2

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val

85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Cys Ser

210

<210> 3

<211> 447

<212> PRT

<213> Ac10 HC amino acid sequence

<400> 3

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> Ac10 LC amino acid sequence

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 448

<212> PRT

<213> 2A2 HC amino acid sequence

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 2A2 LC amino acid sequence

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 1, with Xbeing any amino acid

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 7

Leu Pro Xaa Thr Gly

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 2, with Xbeing any amino acid

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 8

Leu Pro Xaa Ala Gly

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> recognition sequence for Staphylococcus aureus sortase A orengineered sortase A 4S-9 from Staphylococcus aureu

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 9

Leu Pro Xaa Ser Gly

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> recognition sequence for engineered sortase A 2A-9 fromStaphylococcus aureus, with X being any amino acid

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 10

Leu Ala Xaa Thr Gly

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Streptococcus pyogenes sortase A recognition sequence, with X beingany amino acid

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 11

Leu Pro Xaa Thr Ala

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus sortase recognition sequence

<400> 12

Asn Pro Gln Thr Asn

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase A recognitionsequence 1, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 13

Leu Pro Xaa Thr Gly

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase A recognitionsequence 2, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 14

Leu Pro Xaa Ala Gly

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from recognition sequence for Staphylococcus aureussortase A or engineered sortase A 4S-9 from Staphylococcus aureus, with Xbeing any amino acid and n ? 1 and ? 21

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 15

Leu Pro Xaa Ser Gly

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from recognition sequence for engineered sortase A2A-9 from Staphylococcus aureus, with X being any amino acid and n ? 1 and ?21

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<400> 16

Leu Ala Xaa Thr Gly

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from Streptococcus pyogenes sortase A recognitionsequence, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any amino acid

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa is G or A

<400> 17

Leu Pro Xaa Thr Xaa

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase recognitionsequence, with n ? 1 and ? 21

<400> 18

Asn Pro Gln Thr Gly

1 5

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> leader sequence

<400> 19

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 20

<211> 447

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 HC amino acid sequence

<400> 20

Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 21

<211> 212

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 LC amino acid sequence

<400> 21

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Cys Ser

210

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> XBR1-402 HCDR1

<400> 22

Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> XBR1-402 HCDR2

<400> 23

Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

1 5 10 15

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> XBR1-402 HCDR3

<400> 24

Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> XBR1-402 LCDR1

<400> 25

Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> XBR1-402 LCDR2

<400> 26

Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> XBR1-402 LCDR3

<400> 27

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Ac10 HCDR1

<400> 28

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr

1 5

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> Ac10 HCDR2

<400> 29

Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Ac10 HCDR3

<400> 30

Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> Ac10 LCDR1

<400> 31

Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> Ac10 LCDR2

<400> 32

Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Ac10 LCDR3

<400> 33

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 2A2 HCDR1

<400> 34

Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 2A2 HCDR2

<400> 35

Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 2A2 HCDR3

<400> 36

Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 2A2 LCDR1

<400> 37

Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 2A2 LCDR2

<400> 38

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5 10

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 2A2 LCDR3

<400> 39

Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 HCDR1

<400> 40

Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 HCDR2

<400> 41

Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp

1 5 10 15

Ala

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 HCDR3

<400> 42

Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu

1 5 10

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 LCDR1

<400> 43

Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His

1 5

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 LCDR2

<400> 44

Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> huXBR1-402-17 LCDR3

<400> 45

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr

1 5

Claims

1.一种结合蛋白-毒素缀合物，包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病，

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤。

2.一种治疗或预防表征为冷肿瘤的赘生性疾病的方法，所述方法包括向患者施用包含一或多个蒽环类毒素部分的结合蛋白-毒素缀合物。

3.(i)结合蛋白-毒素缀合物，包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，和

(ii)免疫检查点抑制剂的组合，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤，

4.一种治疗或预防表征为冷肿瘤的赘生性疾病的方法，所述方法包括向患者施用

(i)结合蛋白-毒素缀合物，包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，和

(ii)免疫检查点抑制剂，

5.一种结合蛋白-毒素缀合物，包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分，所述缀合物与免疫检查点抑制剂联用(用于生产药物)，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤。

6.一种免疫检查点抑制剂(ICI)，其与结合蛋白-毒素缀合物联用(用于生产药物)，用于治疗患者，所述患者

·患有赘生性疾病，

·处于发展赘生性疾病的风险，和/或

·被诊断患有赘生性疾病

所述赘生性疾病表征为冷肿瘤，

所述缀合物包含与结合蛋白缀合的一或多个蒽环类毒素部分。

7.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述表征为冷肿瘤的赘生性疾病是或已经是免疫检查点抑制剂治疗难治的、对免疫检查点抑制剂治疗有抗性的或在免疫检查点抑制剂治疗后复发的肿瘤。

8.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述表征为冷肿瘤的赘生性疾病选自下组：

·黑素瘤，

·结直肠癌或肿瘤，

·胰腺癌或肿瘤，

·成胶质细胞瘤，

·卵巢癌或肿瘤，和/或

·前列腺癌或肿瘤。

9.如权利要求1-8中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白与选自下组的至少一个靶结合：

·ROR1

·CS1

·HER2

·间皮素(MN)，和/或

·ROR2。

10.如权利要求1-9中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述表征为冷肿瘤的赘生性疾病特征在于免疫评分<1。

11.如权利要求1-10中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中至少一个蒽环类毒素部分是蒽环类PNU-159682的衍生物，具有下式(i)

所述毒素在其波浪线处经接头与结合蛋白缀合。

12.如权利要求3-11中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述免疫检查点抑制剂是选自下组的至少一种：

·抗PD-1，

·抗PD-L1，

·抗PD-L2，

·抗CTLA-4，

·抗LAG3，

·抗CD40或抗CD40L，

·抗TIM3，

·抗0X40或抗OX40L(CD134/CD134L)，

·抗CDH2，

·抗CD155，

·抗B7-H3，

·抗B7-H4，

·抗ID01，

·抗ID02，

·抗TD02，

·抗TIGIT，

·抗GITR，和/或

·抗半乳糖凝集素-9。

13.如权利要求1-12中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述缀合物在其波浪线处包含接头结构X–Li–L₂–L₃–Y，其中Li-L₃代表接头，且Li–L₃中的2个是强制性的，且其中X和Y进一步各代表一个或多个任选存在的接头。

14.如权利要求13所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述接头结构包含作为L₂的寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n，所述L₂直接或通过另一接头Li与所述蒽环类衍生物偶联，且其中n是≥1且≤21的整数，优选2-5。

15.如权利要求14所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n通过命名为Li的亚烷基二胺接头(EDA)与式(i)的蒽环类衍生物缀合，所述亚烷基二胺接头通过第一酰胺键与所述蒽环类衍生物缀合，而通过第二酰胺键与寡聚-甘氨酸肽的羧基末端缀合，所述亚烷基二胺接头与寡聚-甘氨酸肽的缀合物具有下式(ii)

其中波浪线指示与式(i)的蒽环类衍生物的连接，其中m是≥1且≤11的整数，优选2-5，n是≥1且≤21的整数，优选2-5。

16.如权利要求14或15所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n直接或通过另一接头Li与式(ii)蒽环类衍生物的环A偶联。

17.如权利要求14所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n通过命名为Li的亚烷基氨基接头(EA)与式(ii)的蒽环类衍生物缀合，所述亚烷基氨基接头通过酰胺键与寡聚-甘氨酸肽的羧基末端缀合，所述亚烷基氨基接头与寡聚-甘氨酸肽的缀合物具有下式(iii)

其中波浪线指示与式(ii)的蒽环类衍生物的连接，其中m是≥1且≤11的整数，n是≥1且≤21的整数，优选2-5。

18.如权利要求13-18中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述接头结构L₃包含产生自分选酶识别基序的特异性切割的肽基序。

19.如权利要求18所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述分选酶识别基序包含以下氨基酸序列的至少之一：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LAXTG、LPXTA或NPQTN，X是任何能想到的氨基酸序列。

20.如权利要求18或19所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述得到的接头具有以下氨基酸序列的至少之一：-LPXTG_n-、-LPXAG_n-、-LPXSG_n-、-LAXTG_,,-、-LPXTG_,,-、-LPXTA_,,-或-NPQTG_,,-，G_,,是寡聚或多聚甘氨酸，n是≥1且≤21的整数，A_n是寡聚或多聚丙氨酸，n是≥1且≤21的整数，优选2-5，X是任何能想到的氨基酸序列。

21.如权利要求11-20中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述蒽环类衍生物通过一个或多个接头与结合蛋白的羧基末端，或其至少一个结构域或亚基的羧基末端缀合。

22.如权利要求14-21中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白通过酰胺键与寡聚-甘氨酸肽(Gly)_n的氨基末端缀合。

23.如权利要求1-22中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白是选自下组的至少一种：抗体、基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，替代性骨架和/或抗体模拟物。

24.如权利要求23所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白是抗体，其

a)包含下列成对的SEQ ID NO:1和2，3和4，5和6，和/或20和21所示的重链/轻链可变结构域序列对包含的一组重链/轻链互补决定区(CDR)，

b)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含按顺序(HCDR1；HCDR2；HCDR3；LCDR1；LCDR2和LCDR3)下列SEQ ID NO，

·22、23、24、25、26和27，

·28、29、30、31、32和33，

·34、35、36、37、38和39，和/或

·40、41、42、43、44和45。

c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，附带条件是所述CDR的至少之一相对于相应的SEQ ID NO具有至多3个氨基酸取代，

和/或

d)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)，附带条件是所述CDR的至少之一相对于相应的SEQ ID NO具有≥66％的序列相同性，

其中所述CDR嵌入合适的蛋白框架，从而能够以足够的结合亲和性结合ROR1。

25.如权利要求23或24所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白是抗体，其包含

a)下列成对的SEQ ID NO:1和2，3和4，5和6，和/或20和21所示重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对

b)a)的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对，附带条件是

·HCVD与相应的SEQ ID NO的序列相同性≥80％,和/或

·LCVD与相应的SEQ ID NO的序列相同性≥80％,

c)a)或b)的重链/轻链可变结构域(VD)对，附带条件是HCVD或LCVD的至少之一相对于相应的SEQ ID NO具有至多10个氨基酸取代，

所述蛋白结合物仍能够以足够的亲和性结合ROR1。

26.如权利要求24-25中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白包含的至少一个氨基酸取代是保守性氨基酸取代。

27.如权利要求1-26中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白相较于根据权利要求24-25中任一项的抗体，有至少50％的ROR1靶结合亲和性。

28.如权利要求1-27中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白与根据权利要求24-25中任一项的抗体竞争结合ROR1。

29.如权利要求1-28中任一项所述的缀合物、方法、组合或ICI，其中所述结合蛋白与根据权利要求24-25中任一项的抗体结合ROR1上基本相同或相同的区域。