KR20210075085A - 안트라사이클린을 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및 면역-종양학 적용에서 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및 면역종양학적 적용에서 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티(anthracycline toxin moiety)를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및 면역-종양학적 적용에서 이의 용도에 관한 것이다.
결합 단백질-독소 접합체, 가장 전형적으로 항체-약물-접합체(ADC)는 암 치료법에 막대한 영향을 미쳤으며, 지금까지 치료될 수 없었던 종양 유형에 새로운 치료학적 접근법을 제공하였다.
다른 한편으로, 면역관문의 발견, 및 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)의 개발은 암 치료법에서 면역계의 역할, 및 면역계를 자극하거나 또는 각각의 종양이 면역계의 공격에 대해 자신을 보호하는데 사용하는 면역관문을 극복하는 방법에 다시 초점을 맞추었다.
상기 두 접근법 모두 매우 열정적으로 논의되었고, 암 치료에 상당한 진보를 나타내었지만, 이들 신규의 접근법으로 치료될 수 없는 종양 유형이 존재함도 또한 분명해지고 있다.
예를 들어, 특정 독소를 갖는 ADC는 이의 항체에 의해 암 특이 항원을 다루지만, 특정한 암 유형에 대해서는 활성이 없는 것으로 나타났다. 또한, 면역관문 억제제가 효능이 없는 종양 유형이 존재하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 지금까지 기존의 치료법에 의해 다룰 수 없었던 종양 유형을 치료 가능하게 하는 신규의 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 가지 추가의 목적은 상응하는 단독 요법의 항-종양 활성을 증가시키는 병용 요법을 제공하는 것이다.
상기 및 추가의 목적은 본 발명의 독립항에 따른 방법 및 수단으로 충족된다. 종속항은 구체적인 구현예와 관련된다.
본 발명은 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및 면역-종양학적 적용에서 이의 용도를 제공한다. 본 발명 및 이의 특징의 일반적인 장점을 하기에 상세히 논의할 것이다.
도 1. 본 발명의 실험에 사용된 부위-특이적으로 접합된(conjugated) ADC의 생성에 사용된 펜타글리신-변형된 EDA-안트라사이클린 PNU-159682 유도체(G5-EDA-PNU 또는 G5-PNU)의 화학 구조. G3-PNU 및 G2-PNU는 동일한 구조를 지칭하지만, 여기에서 펜타글리신이 각각 트리글리신 또는 디글리신에 의해 교체된다.
도 2. 마우스 EMT-6 유방암 세포상에서 안정하게 발현된 인간 ROR1의 발현에 대한 FACS 분석. 생체내 연구를 위해 선택된 EMT-6-ROR1 클론 14는 형광 표지된 항-ROR1 항체 클론 2A2에 의한 ROR1 발현을 염색하는 FACS에 의해 분석되었다. 음성 대조군은 형광 표지된 아이소타입-합치된 대조군 항체에 의한 동일한 세포의 염색을 나타낸다.
도 3. 동소동계 유방암 모델 EMT-6-ROR1(클론 14)에서 상이한 용량 수준(0.25, 0.5 및 1 ㎎/㎏)의 단일 처리에 의한, 항체 XBR1-402에 기초한 신규의 항-ROR1 PNU-ADC의 용량 적정. (A) 동소 이식된 유방 종양의 종양 성장을 표시된 바와 같이 시간에 걸쳐 상이한 처리 그룹에서 모니터링한다. (B) 패널 (A)에 나타낸 그룹의 개별 마우스에서 종양 성장 곡선.
도 4. (A) 비히클 대조군(PBS) 주사, 또는 (B) 항-CD30 항체 브렌툭시맙, 클론 AclO을 포함하는 아이소타입-합치된 대조군 PNU-ADC 0.25 ㎎/㎏의 단일 투여, 또는 (C) 신규의 항-ROR1 항체 XBR1-402를 포함하는 항-ROR1 PNU-ADC 0.25 ㎎/㎏의 단일 투여(이는 도 3에 따라 마우스에서 동소 EMT-6-ROR1 유방 종양의 치료에 차선의 용량인 것으로 측정되었다)에 의한, EMT-6-ROR1(클론 14) 유방 암 세포를 갖는 동소 이식된 동계 마우스에서 종양 부피 전개. 패널 (D) 및 (E)는 표시된 바와 같은, 항-CTLA4 면역관문 억제제 항체 9D9와, 0.25 ㎎/㎏의 아이소타입-합치된 대조군 ADC AclO 및 0.25 ㎎/㎏의 신규의 항-ROR1 PNU ADC와의 병용 치료를 도시한다. (F) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(LOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 XBR1-402-G5-PNU, (G) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(FOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 항-마우스 CTFA-4 항체 9D9, 및 XBR1-402-G5-PNU 및 항-마우스 CTFA-4 항체 9D9.
도 5. (A) 마우스 CT-26 유방암 세포(클론 3) 및 (B) B16 마우스 흑색종 암세포(풀)상에서 안정하게 발현된 인간 ROR1의 발현에 대한 FACS 분석. 생체내 연구를 위해 선택된 CT-26-ROR1 클론 3 및 B16-ROR1 풀이 형광 표지된 항-ROR1 항체 클론 XBR1-402에 의한 ROR1 발현을 염색하는 FACS에 의해 분석되었다(우측 피크). 음성 대조군은 형광 표지된 아이소타입-합치된 대조군 항체에 의한 동일 세포의 염색을 도시한다(좌측 피크).
도 6. 실시예 6에 따라 CT-26-ROR1 클론 3 종양 세포 이식된 마우스에서 종양 부피 전개: (A) 그룹 1의 비히클 대조군(처리되지 않은), (B) 그룹 2의 아이소타입 대조군, (C) 그룹 3의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17, (D) 그룹 4의 아이소타입 대조군 + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체, (E) 그룹 7의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17 + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체. 패널 A-E의 삽입은 마우스의 수를 제공하며, 여기에서 종양 성장이 각각의 처리 그룹에서 마우스의 수에 비해 방지되었다. 결과는 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 협력을 암시한다.
도 7. 비히클 대조군("비히클", 그룹 1), 면역관문 억제제 항-마우스 CTLA-4 항체("CTLA-4", 그룹 2), 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17("ADC", 그룹 3), 및 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17 + 면역관문 억제제 항-마우스 CTLA-4 항체("ADC + CTLA-4", 그룹 4)에 의한 처리에 따른, 실시예 7에 따라 ROR1-과발현 B16 풀의 i.v. 적용에 따른 마우스에서의 폐 표면 콜로니 부피. 상기 결과는, 불충분하게 면역원성인 종양에서, 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 강한 상승작용을 암시한다. "n.s."은 통계학적 유의수준으로 상이하지 않음을 의미하고, "*"은 통계학적 유의수준으로 상이함을 가리킨다.
도 8. (A) 처리되지 않은 대조군 마우스, 및 (B) 본 발명에 따른 ADC로 처리된(1회, 4 ㎎/㎏) 3마리의 마우스로부터의 hROR1(인간 ROR1)-과발현 B16 종양 극저온-절편의 CD4 및 CD8-염색. 도 8(A)에 따르면, B16 종양은 차가운 종양으로서 B16 종양의 상태와 일치되게, 자연적으로 낮은 수준의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유한다. 도 8(B)는 본 발명에 따른 ADC에 의한 처리가 종양내 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수를 증가시킴을 도시한다.
도 9. hROR1(인간 ROR1)-과발현 CT-26 및 B-16 종양에서 침윤성 림프구상의, T 세포 활성화의 마커, 41BB(CD137) 염색의 분석. 도 9에 따르면, CT-26 종양에 비해 현저하게 더 낮은 수의 활성화된 T CD4+(A) 및 CD8+(B) 림프구가, 차가운 종양으로서 B-16 종양의 상태와 일치되게, B-16 종양내에서 관찰될 수 있다. "*"은 통계학적 유의수준으로 상이함을 가리킨다.
도 2. 마우스 EMT-6 유방암 세포상에서 안정하게 발현된 인간 ROR1의 발현에 대한 FACS 분석. 생체내 연구를 위해 선택된 EMT-6-ROR1 클론 14는 형광 표지된 항-ROR1 항체 클론 2A2에 의한 ROR1 발현을 염색하는 FACS에 의해 분석되었다. 음성 대조군은 형광 표지된 아이소타입-합치된 대조군 항체에 의한 동일한 세포의 염색을 나타낸다.
도 3. 동소동계 유방암 모델 EMT-6-ROR1(클론 14)에서 상이한 용량 수준(0.25, 0.5 및 1 ㎎/㎏)의 단일 처리에 의한, 항체 XBR1-402에 기초한 신규의 항-ROR1 PNU-ADC의 용량 적정. (A) 동소 이식된 유방 종양의 종양 성장을 표시된 바와 같이 시간에 걸쳐 상이한 처리 그룹에서 모니터링한다. (B) 패널 (A)에 나타낸 그룹의 개별 마우스에서 종양 성장 곡선.
도 4. (A) 비히클 대조군(PBS) 주사, 또는 (B) 항-CD30 항체 브렌툭시맙, 클론 AclO을 포함하는 아이소타입-합치된 대조군 PNU-ADC 0.25 ㎎/㎏의 단일 투여, 또는 (C) 신규의 항-ROR1 항체 XBR1-402를 포함하는 항-ROR1 PNU-ADC 0.25 ㎎/㎏의 단일 투여(이는 도 3에 따라 마우스에서 동소 EMT-6-ROR1 유방 종양의 치료에 차선의 용량인 것으로 측정되었다)에 의한, EMT-6-ROR1(클론 14) 유방 암 세포를 갖는 동소 이식된 동계 마우스에서 종양 부피 전개. 패널 (D) 및 (E)는 표시된 바와 같은, 항-CTLA4 면역관문 억제제 항체 9D9와, 0.25 ㎎/㎏의 아이소타입-합치된 대조군 ADC AclO 및 0.25 ㎎/㎏의 신규의 항-ROR1 PNU ADC와의 병용 치료를 도시한다. (F) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(LOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 XBR1-402-G5-PNU, (G) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(FOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 항-마우스 CTFA-4 항체 9D9, 및 XBR1-402-G5-PNU 및 항-마우스 CTFA-4 항체 9D9.
도 5. (A) 마우스 CT-26 유방암 세포(클론 3) 및 (B) B16 마우스 흑색종 암세포(풀)상에서 안정하게 발현된 인간 ROR1의 발현에 대한 FACS 분석. 생체내 연구를 위해 선택된 CT-26-ROR1 클론 3 및 B16-ROR1 풀이 형광 표지된 항-ROR1 항체 클론 XBR1-402에 의한 ROR1 발현을 염색하는 FACS에 의해 분석되었다(우측 피크). 음성 대조군은 형광 표지된 아이소타입-합치된 대조군 항체에 의한 동일 세포의 염색을 도시한다(좌측 피크).
도 6. 실시예 6에 따라 CT-26-ROR1 클론 3 종양 세포 이식된 마우스에서 종양 부피 전개: (A) 그룹 1의 비히클 대조군(처리되지 않은), (B) 그룹 2의 아이소타입 대조군, (C) 그룹 3의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17, (D) 그룹 4의 아이소타입 대조군 + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체, (E) 그룹 7의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17 + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체. 패널 A-E의 삽입은 마우스의 수를 제공하며, 여기에서 종양 성장이 각각의 처리 그룹에서 마우스의 수에 비해 방지되었다. 결과는 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 협력을 암시한다.
도 7. 비히클 대조군("비히클", 그룹 1), 면역관문 억제제 항-마우스 CTLA-4 항체("CTLA-4", 그룹 2), 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17("ADC", 그룹 3), 및 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17 + 면역관문 억제제 항-마우스 CTLA-4 항체("ADC + CTLA-4", 그룹 4)에 의한 처리에 따른, 실시예 7에 따라 ROR1-과발현 B16 풀의 i.v. 적용에 따른 마우스에서의 폐 표면 콜로니 부피. 상기 결과는, 불충분하게 면역원성인 종양에서, 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 강한 상승작용을 암시한다. "n.s."은 통계학적 유의수준으로 상이하지 않음을 의미하고, "*"은 통계학적 유의수준으로 상이함을 가리킨다.
도 8. (A) 처리되지 않은 대조군 마우스, 및 (B) 본 발명에 따른 ADC로 처리된(1회, 4 ㎎/㎏) 3마리의 마우스로부터의 hROR1(인간 ROR1)-과발현 B16 종양 극저온-절편의 CD4 및 CD8-염색. 도 8(A)에 따르면, B16 종양은 차가운 종양으로서 B16 종양의 상태와 일치되게, 자연적으로 낮은 수준의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유한다. 도 8(B)는 본 발명에 따른 ADC에 의한 처리가 종양내 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수를 증가시킴을 도시한다.
도 9. hROR1(인간 ROR1)-과발현 CT-26 및 B-16 종양에서 침윤성 림프구상의, T 세포 활성화의 마커, 41BB(CD137) 염색의 분석. 도 9에 따르면, CT-26 종양에 비해 현저하게 더 낮은 수의 활성화된 T CD4+(A) 및 CD8+(B) 림프구가, 차가운 종양으로서 B-16 종양의 상태와 일치되게, B-16 종양내에서 관찰될 수 있다. "*"은 통계학적 유의수준으로 상이함을 가리킨다.
발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 장치의 특정한 성분 부분 또는 기재된 방법의 공정 단계가 변화될 수 있음에 따라 이에 제한되지 않음을 알아야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 기재하기 위한 것이며, 제한을 의도하지 않음을 알아야 한다. 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, "하나의" 및 "이의"란 단수형은 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 단수 및/또는 복수의 지시대상을 포함함을 알아야 한다. 더욱이, 수치에 의해 한계가 정해진 매개변수 범위의 경우에, 그 범위는 상기 한계값을 포함하는 것으로 여겨짐을 알아야 한다.
추가로, 본원에 개시된 구현예는 서로 관련되지 않은 개별적인 구현예로서 이해되는 것이 아님을 알아야 한다. 하나의 구현예에서 논의되는 특징은 본원에 나타낸 다른 구현예들과 또한 관련되어 개시됨을 의미한다. 하나의 경우에, 특정한 특징이 하나의 구현예에 개시되지 않고 다른 구현예에서 개시되는 경우, 당업자는 상기 특징이 상기 다른 구현예에 개시되지 않는다는 것을 반드시 의미하는 것은 아님을 알 것이다. 당업자는 상기 특징을 또한 다른 구현예에 대해서도 개시하는 것이 본원의 요지이지만, 단지 명료성을 위해서 및 명세서를 관리가능한 분량으로 유지하기 위해서 상기 개시를 수행하지 않았음을 이해할 것이다.
더욱 또한, 본원에서 언급된 종래 기술 문서의 내용은 참고로 인용된다. 이는 특히 표준 또는 통상적인 방법을 개시하는 종래 기술 문서를 지칭한다. 이 경우에, 참고에 의한 인용은 주로 충분한 개시를 가능하게 하고 긴 반복을 피하는 것이 목적이다.
본 발명의 하나의 양태에 따라, 차가운 종양(cold tumor)임을 특징으로 하는
·신생물 질병(neoplastic disease)을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료를 위한(약제의 제조를 위한), 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 제공한다.
상기 괄호안의 "약제의 제조를 위한"이란 용어와 함께 상기 언어는, 주어진 화합물의 의학적 용도를 다루는 청구에 관하여 다른 국가/지역적 요구사항을 준수하도록 선택되었음을 강조하는 것이 중요하다. 상기 언어는 특히 소위 스위스 유형 포맷("약제의 제조를 위한"이란 수식어구가 필요한 경우)뿐만 아니라 EPC2000(동일한 수식어구가 더 이상 허용되지 않는 경우)하의 각 청구 언어를 모두 포함할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에게 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 투여함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라,
(i) 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및
(ii) 면역관문 억제제
의 조합물(combination)을, 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료를 위해(약제의 제조를 위해) 제공하며, 여기에서 상기 결합 단백질-독소 접합체 및 상기 면역관문 억제제는 상기 환자에게 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에게
(i) 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및
(ii) 면역관문 억제제
를 투여함을 포함하며, 여기에서 상기 결합 단백질-독소 접합체 및 상기 면역관문 억제제는 상기 환자에게 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한(약제의 제조를 위한) 면역관문 억제제와 함께 사용하기 위해 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한(약제의 제조를 위한), 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체와 함께 사용하기 위한 면역관문 억제제.
하나의 구현예에서, 상기 면역관문 억제제는 양성 면역관문 단백질을 조절한다. 또 다른 구현예에서, 상기 면역관문 억제제는 음성 면역관문 단백질을 조절한다.
하나의 구현예에서, 상기 하나 이상의 안트라사이클린 독소를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 상기 면역관문 억제제 전에 투여한다.
하나의 구현예에서, 상기 환자는 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된다.
"뜨거운 종양(hot tumor)"은 면역세포 침윤을 특징으로 하는 암성 또는 신생물 조직을 정의한다. 면역 침윤의 수준은 면역계가 종양을 인식하고 관여하는지의 여부를 반영한다. "뜨거운 종양"이란 용어는 본원에서 "면역학적으로 반응성인 종양"이란 용어와 동의어로 사용된다. 한편으로, "뜨거운 종양"은 면역관문 억제제에 의한 치료에 반응하는 종양으로서 정의될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료에 반응하다"란 용어는 필적하는 비히클(vehicle) 또는 아이소타입 대조군 치료(isotype control treatment)에 비해 종양 크기 또는 성장의 통계학적 유의수준의 감소를 의미한다.
하나의 구현예에서, "차가운 종양"이란 용어는 면역세포 침윤이 불충분하거나 없음을 특징으로 하는 암성 또는 신생물 조직을 정의한다. "차가운 종양"이란 용어는 본원에서 "면역학적으로 무반응성인 종양"이란 용어와 동의어로 사용된다.
종양을 차가운 것으로서 정성분석하기 위한 하나의 기준은 소위 면역점수(immunoscore)이며, 이는 종양 샘플 중 2가지 유형의 T 세포의 밀도에 기초한다. 하나의 예는 종양의 코어(CT) 및 종양의 침윤 경계면(IM) 모두에서 2개의 림프구 집단(CD3/CD45RO, CD3/CD8 또는 CD8/CD45RO)의 밀도이다. 상기 면역점수는 상기 두 영역 모두에서 상기 두 세포 유형의 밀도가 모두 낮은 경우의 면역점수 0(10)에서부터, 상기 두 영역 모두에서 높은 밀도가 발견되는 경우의 면역점수 4(14)까지의 범위의 점수를 제공한다.
상기 면역점수를 측정하는 방법은 예를 들어 문헌[Galon et al. 2014], [Pages et al. 2009], [Angell et al. 2013], 및 [Galon et al. 2013]에 기재되었으며, 이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
지금까지는, 낮은 면역점수를 갖는 종양("차가운 종양")은 항 PD-1, 항 CTLA-4 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역관문 억제제에 의한 치료에 그다지 반응성이지 않은 반면, 높은 면역점수를 갖는 종양은 상기와 같은 치료에 반응성인 것으로 논의되었다(문헌[Bu et al. 2016] 참조). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 발견의 근거는 각 종양에 면역 관여가 존재하지 않는 경우, 주어진 억제제에 의한 면역관문의 억제는 아무것도 더 좋게 바꿀 수 없다는 것일 수 있다.
본 발명자는 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체가 종양에 특별한 면역학적 효능을 가지며, 특히 종양 재-공격으로부터 면역 보호를 생성시킴을 알았다. 이러한 놀라운 발견은 항-PD-1, 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역관문 억제제에 대해 이루어진 발견으로부터는 예상될 수 없었다. 후자에 적용되는 근거는 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체에는 적용되지 않을 듯하다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병은, 면역관문 억제제 치료에 불응성(refractory), 내성이거나 또는 불응성, 내성이었거나, 또는 면역관문 억제제 치료후 재발성이거나 또는 재발성이었던 종양이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "불응성"이란 용어는 면역관문 억제제에 의한 치료에 대한 반응으로 종양 수축 또는 안정화 또는 수축 기간의 관점에서 유리한 방식으로 합리적으로 반응하지 않거나 반응에 실패한 종양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "내성"이란 용어는 3개월 이상의 기간 동안 면역관문 억제제에 의한 치료에 대한 반응으로 종양 수축 또는 안정화 또는 수축 기간의 관점에서 유리한 방식으로 합리적으로 반응하지 않거나 반응에 실패한 종양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "재발성"이란 용어는 면역관문 억제제에 의한 치료후에, 대개는 종양을 검출할 수 없었던 기간 후에 다시 돌아온 종양을 지칭한다. 상기 종양은 피실험자의 신체 중 동일한 장소 또는 또 다른 장소로 돌아올 수 있다.
면역관문 억제제에 의한 상기와 같은 치료는 바람직하게는 단독요법이었다.
면역관문 억제제에 의한 상기와 같은 치료는 바람직하게는 각각의 약물 표지 또는 SOPC에 권장된 용법 또는 섭생으로 투여되었다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병은
·흑색종,
·결장직장암 또는 종양,
·췌장암 또는 종양,
·교모세포종,
·난소암 또는 종양, 및/또는
·전립선암 또는 종양
으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 결합 단백질은
·ROR1
·CS1
·HER2
·메소텔린(MN), 및/또는
·ROR2
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 표적(target)에 결합한다.
이들 중에서, ROR1이 바람직한 표적이다.
이들 표적, 및 이에 대한 항체는 하기의 간행물에 기재되어 있으며
·US2019112385Α1(메소텔린)
·US2019153092Α1, WO2019016381(ROR1)
·WO2019030240Α1(CS-1),
·US2018028682(HER2) 및
·WO2019016392Α1(ROR2),
이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
바람직하게, 상기 표적은 인간 기원의 것이다. 특히, ROR1은 본원에서 언급되는 경우, 바람직하게는 인간 ROR1을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역관문 억제제"란 용어는 면역관문 단백질에 대해 작용하기에 적합한 임의의 결합제 또는 화합물을 지칭한다. 특히, "면역관문 억제제"는 면역계의 활성, 및 현저하게는 암세포를 인식하고 이에 대해 작용하는 T 세포의 능력을 지지하도록 면역관문 단백질의 활성을 조절하기에 적합한 임의의 결합제 또는 화합물을 지칭한다. 면역관문 단백질은 양성(즉 T 세포 활성 및 면역 반응을 지지한다)이거나 또는 음성(즉 T 세포 활성 및 면역 반응을 제한한다)일 수 있다. 양성 면역관문 단백질의 경우에, 면역관문 억제제는 상기 면역관문 단백질의 활성을 촉진하기에 적합한 결합제 또는 화합물을 의미한다. 음성 면역관문 단백질의 경우에, 면역관문 억제제는 상기 면역관문 단백질의 활성을 억제하기에 적합한 결합제 또는 화합물을 의미한다.
면역관문은 면역계를 조절하고(Pardoll D.M. “The blockage of immune checkpoints in cancer immunotherapy”, Nature, 2012, Volume 12, p. 252-264), 면역계가 세포를 무차별 공격하는 것을 방지하는 자기-관용에 중요한 단백질이며, 바람직하게는 하기의 표에 개시된 바와 같은 그룹 중에서 선택된다:
예를 들어, T 세포의 표면상에서 발현된 PD-1 관문 단백질은 상기 T 세포가 신체의 다른 세포를 공격하는 것을 방지하는 작용을 한다. T 세포 PD-1이 세포 표면상의 PD-L1에 결합하는 경우, 상기 T 세포는 상기 세포에 대한 면역 반응을 촉발하지 않을 것이다. 몇몇 암세포는 높은 수준의 PD-L1을 발현하여, 면역계 공격을 방지한다. 상응하게, PD-1 또는 PD-L1에 결합하고 상응하게 서로 결합하는 것을 억제하는 항체는 암세포에 대한 면역반응을 촉진하는 작용을 한다. CTLA-4는 T 세포상에서 발현되는 또 다른 상기와 같은 음성 면역관문 단백질이다.
하나의 구현예 그룹에 따라, 신생물 질병은 I<1의 면역점수를 가짐을 특징으로 하는 차가운 종양임을 특징으로 한다.
상기 면역점수는, 암에 침윤하여 그를 둘러싸는 면역세포에 기반한, 암 환자의 예후를 평가하는 방법이다. 상기 면역점수는 국제적으로 결장직장암에서 검증되었다. 이는 세포독성 및 기억 T 세포와 결장직장암 환자의 생존과의 양의 연관성을 밝힌 Galon 등(2006)의 발견에 기초한다.
면역점수는 숙주 면역 반응의 효과를 암 분류에 통합시키고 예후 정확도를 개선시킨다. 상기는 종양의 중심 및 주변부에서 2개의 T 림프구 집단(CD3/CD8, CD3/CD45RO 또는 CD8/CD45RO)의 밀도를 측정한다. 상기 면역점수는 상기 두 영역 모두에서 상기 두 세포 유형의 밀도가 모두 낮은 경우의 0(10)에서부터, 상기 두 영역 모두에서 높은 밀도가 발견되는 경우의 면역점수 4(14)까지의 범위의 점수를 제공한다. 상기 면역점수는 종양의 주변부에서 면역세포가 어떻게 구성되는지, 또는 B-세포, 3차 림프 구조 및 배아 중심의 양을 측정하지 않는다. 이들은 모두 결장직장 및 다른 암에 대한 면역 반응에서 중요한 역할을 한다.
하나의 구현예에서, 차가운 종양은 10 또는 II의 면역점수를 갖는 종양이며, 바람직하게는 II의 면역점수를 갖는 종양이다.
또 다른 구현예에서, "차가운 종양"이란 용어는 면역세포 침윤이 없거나 불충분함을 특징으로 하는 암성 또는 신생물 조직을 정의한다. 면역 침윤의 수준은 면역계가 종양을 인식하고 있는지의 여부를 반영한다.
또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 면역관문 억제제를 단독요법으로서 생체내에서 투여하는 경우 상기 면역관문 억제제에 반응하지 않는 종양이다. 이 구현예에서 및 면역능력 마우스 모델에 비해, 차가운 종양은 일단 마우스에서 확립되면, 단독요법으로서 약 10 ㎎/㎏ 이하 또는 20 ㎎/㎏ 이하, 또는 상기 마우스 모델에서 최대로 허용되는 용량(MTD) 이하로 투여된 면역관문 억제제에 그다지 반응하지 않는 종양이다. 인간에서, 차가운 종양은 또 다른 구현예에서, 면역관문 억제제 표지에 따라 투여된 면역관문 억제제에, 예를 들어 단독요법으로서 임의로 2 내지 3주마다 투여시, 10 ㎎/㎏ 이하, 예를 들어 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 또는 200 또는 240 ㎎에 그다지 반응하지 않는 종양이다.
또 다른 구현예에서 및 인간 고형 종양에 비해, 차가운 종양은 2000년 2월에 공개되고(Therasse P. et al., "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors", Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 3, February 2, 2000) 2009년에 업데이트된(Eisenhauer E.A. et al., "New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)", European Journal of Cancer, Volume 45, Issue 2, 228 - 247) 바와 같은 RECIST(고형 종양에서 반응 평가 기준) 기준에 대해 정의될 수 있다. 이와 관련하여, 또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 면역관문 억제제 표지 설명에 따라 투여된 하나 이상의 면역관문 억제제 치료후 부분적인 반응 미만의 반응과 연관되거나("PR"; 즉 진행성인 종양("PD", 진행성 질병)) 또는 안정하게 남아있는("SD", 안정한 질병) 종양이다. 또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 적어도 6주, 바람직하게는 적어도 8주, 보다 바람직하게는 적어도 12주에 걸쳐 투여된 하나 이상의 면역관문 억제제 치료후 부분적인 반응 미만의 반응과 연관되거나("PR"; 즉 진행성인 종양("PD", 진행성 질병)) 또는 안정하게 남아있는("SD", 안정한 질병) 종양이다. 또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 항-PD-L1 요법후 진행성인 유방암 종양이다.
또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 면역관문 억제제 표지 설명에 따라 투여된 하나 이상의 면역관문 억제제의 적어도 6주, 바람직하게는 적어도 8주, 보다 바람직하게는 적어도 12주 후에 진행성인 질병("PD")과 연관된 종양이다.
또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 하나 이상의 면역관문 억제제에 무반응성으로 되는 종양, 즉 앞서 하나 이상의 면역관문 억제제 치료에 반응성이었지만 무반응성으로 되는 종양이다.
또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 또한 하나 이상의 면역관문 억제제에 대한 초기 반응 후에 재발하는(즉 치료에 감소된 반응을 겪는) 종양으로서 정의될 수 있으며, 이때 후자는 면역관문 억제제 표지 설명에 따라 투여된다.
또 다른 구현예에서, 차가운 종양은 임상의에 의해 차가운 종양으로서 분류된 종양이다. 차가운 종양의 특정한 비제한적인 예는 현미부수체 불안정성 낮은(Microsatellite Instability low) 결장직장암 종양(MSI-낮은; Sinicrope, F. "The Role of Microsatellite Instability Testing in Management of Colorectal Cancer", Clinical Advances in Hematology & Oncology Volume 14, Issue 7 July 2016)을 포함한다. 상기와 같은 종양은 면역관문 억제제에 비-반응성인 것으로 공지되어 있다. 상기 종양은 하나 이상의 면역관문 억제제에 의한 1차 치료 부재하에서 비-반응을 확고히 하는 차가운 종양으로서 식별될 수 있다.
상기에 논의된 바와 같이, "차가운 종양"은 항 PD-1 또는 항 CTLA-4 항체와 같은 면역관문 억제제에 의한 치료에 그다지 반응성이 아니다. 이러한 현상의 근거는 각각의 종양에 면역계가 관여하지 않으면 주어진 억제제에 의한 면역관문의 억제가 아무것도 더 좋게 바꿀 수 없다는 것일 수 있다.
특히, 흑색종, 결장직장암 또는 종양, 췌장암 또는 종양, 교모세포종, 난소암 또는 종양 및 전립선암 또는 종양의 서브세트(subset)가 차가운 종양인 것으로 공지되어 있다.
발명자는 (i) 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및 (ii) 면역관문 억제제를 포함하는 치료에 의해, 상기와 같은 차가운 종양이 효율적으로 치료될 수 있음을 보인다.
상기 발견은 놀라운 것이며, 항 PD-1, 항 CTLA-4 또는 항-PD-L1 요법과 같은 면역관문 억제제에 의해서도, 또는 안트라사이클린-포함 결합 단백질-독소 접합체에 의해서 이루어진 발견으로부터도 예상될 수 없었다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 안트라사이클린-포함 결합 단백질-독소 접합체는 차가운 종양을 면역관문 요법에 민감하게 만들 수 있는 것으로, 즉 상기 종양을 뜨거운 종양으로 형질전환시킬 수 있는 것으로 보이며, 따라서 상기 종양은 면역관문 억제제로 효율적으로 치료될 수 있다.
바람직하게, 상기 2개의 상이한 작용제를 환자에게 투여하는 간격은 최대 4주 이내이다.
하나의 구현예에서, 상기 하나 이상의 안트라사이클린 독소를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 면역관문 억제제 전에 투여한다.
하나의 구현예에 따라, 상기 적어도 하나의 안트라사이클린 독소 모이어티는 PNU-159682이며, 문헌[Quintierei et al. 2005]에 개시되어 있다.
또 다른 구현예에 따라, 상기 적어도 하나의 안트라사이클린 독소 모이어티는 하기 화학식 i를 갖는 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체이며
[화학식 i]
상기 독소는 링커(linker)를 통해 결합 단백질에 물결 모양으로 접합된다.
PNU-유도된 안트라사이클린 및 항체 약물 접합체에서 이의 용도는 동일 출원인에게 허여된 WO2016102679에 가능하게 개시되어 있다. 상기 공보의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라 면역관문 억제제는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다
·항 PD-1
·항 PD-L1
·항 PD-L2
·항 CTLA-4
·항 LAG3
·항 CD40 또는 항 CD40L
·항 TIM3,
·항 OX40 또는 항 OX40L(CD134/CD134L),
·항 CDH2
·항 CD155
·항 B7-H3
·항 B7-H4
·항 ID01
·항 ID02
·항 TD02
·항 TIGIT
·항 GITR, 및/또는
·항 갈렉틴-9.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 활성화의 억제에 연루된 PD-1/PD-L1 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-PD-1 항체, 특히 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 또는 티슬렐리주맙, 또는 보다 바람직하게는 단클론 항-PD-L1 항체, 보다 바람직하게는 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙 또는 BMS-936559이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 활성화의 억제에 연루된 PD-1/PD-L2 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-PD-1 항체, 특히 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 또는 티슬렐리주맙, 또는 보다 바람직하게는 단클론 항-PD-L2 항체이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 활성화의 억제에 연루된 CTLA-4/B7 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-CTLA1-4 항체, 보다 바람직하게는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 자극 및 TREG 활성의 억제에 연루된 LAG3/MHC II 부류 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-LAG3 항체, 특히 LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK-4280 또는 REGN3767이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 감소된 T 세포 기능에 연루된 TIM3/갈렉틴-9 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-TIM3 항체 또는 단클론 항-갈렉틴-9 항체이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 활성화의 억제에 연루된 TIGIT/CD112 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-TIGIT 항체 또는 단클론 항-CD112 항체이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 T 세포 활성화의 억제에 연루된 TIGIT/CD155 경로를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 단클론 항-TIGIT 항체 또는 단클론 항-CD155 항체이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 GITR에 대해 작용물질로서 작용하는 화합물 또는 단클론 항체, 보다 바람직하게는 작용물질 단클론 항-GITR 항체, 특히 GWN323, BMS-986156, MK-4166, MK-1248, TRX518, INCAGN1876, AMG 228, 또는 INBRX-110이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 OX40에 대해 작용물질로서 작용하는 화합물 또는 단클론 항체, 특히 작용물질 항-OX40 단클론 항체, 예를 들어 MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469, 또는 MEDI6383이다.
바람직하게, 상기 관문 억제제는 CD40에 대해 작용물질로서 작용하는 화합물 또는 단클론 항체, 특히 작용물질 항-CD40 단클론 항체, 예를 들어 CP-870 또는 CP-893이다.
상기 논의된 관문 억제제 중에서,
·PD-1
·PD-L1
·CTLA-4, 및 또는
·B7
과 결합하거나 또는 상기를 길항하는 화합물 또는 단클론 항체가 특히 바람직하며, PD-1 및 PD-L1이 가장 바람직한 표적이다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 접합체는 물결선(wavy line)으로 링커 구조 X - Li - L2 - L3 - Y를 포함하며, 여기에서 Li - L3은 링커를 나타내고, Li - L3 중 2개는 필수적이며 X 및 Y는 추가로 각각 하나 이상의 임의의 링커를 나타낸다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 링커 구조는 L2로서, 상기 안트라사이클린 유도체에 직접 또는 또 다른 링커 Li에 의해 커플링된(coupled) 올리고-글리신 펩티드(Gly)n를 포함하고, 여기에서 n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다. 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제(sortase) A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n 또는 혼합된 Gly/Ala 펩티드에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
또 다른 실현예의 그룹에 따라, 상기 올리고-글리신 펩티드(Gly)n는 알킬렌디아미노 링커(EDA)(Li로서 표시됨)에 의해 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬렌디아미노 링커는 제1 아미드 결합에 의해 상기 안트라사이클린 유도체에 접합되는 반면, 제2 아미드 결합에 의해서는 올리고-글리신 펩티드의 카복시 말단에 접합되고, 상기 알킬렌디아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체는 하기 화학식 ii를 갖는다,
[화학식 ii]
여기에서 물결선은 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 대한 연결을 나타내고, m은 ≥1 내지 ≤11, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이고, n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다. 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 올리고-글리신 펩티드(Gly)n는 직접 또는 또 다른 링커 Li에 의해 화학식 ii의 안트라사이클린 유도체의 고리 A에 커플링된다(이때 상기 안트라사이클린 코어의 고리 A는 문헌[Shi et ah, 2009]에 묘사된 바와 같다). 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
또 다른 실현예의 그룹에 따라, 상기 올리고-글리신 펩티드(Gly)n는 알킬렌아미노 링커(EA)(Li로서 표시됨)에 의해 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬렌아미노 링커는 아미드 결합에 의해 상기 올리고-글리신 펩티드의 카복시 말단에 접합되고, 상기 알킬렌아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체는 하기 화학식 iii를 갖는다,
[화학식 iii]
여기에서 물결선은 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 대한 연결을 나타내고, m은 ≥1 내지 ≤11, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이고, n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다. 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
또 다른 실현예의 그룹에 따라, 링커 구조 L3은 솔타제 효소 인식 모티프(sortase enzyme recognition motif)의 특정한 절단으로부터 생성되는 펩티드 모티프를 포함한다.
상기 솔타제 효소 인식 모티프는 소위 솔타제-효소 매개된 항체 접합(SMAC-기술)(이는 동일 출원인에게 허여된 WO2014140317에 가능하게 개시되어 있다)에 대한 태그로서 작용한다. 상기 공보의 내용은 본원에 참고로 인용된다. 상기 기술에서, 솔타제 효소는 2개의 분자를 접합시키며 이중 하나는 상기와 같은 인식 모티프를 갖고 있는 반면, 다른 하나는 올리고-글리신 펩티드(Gly)n를 갖고 있다. 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 솔타제 효소 인식 모티프는 하기의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하며: LPXTG, LPXAG, LPXSG, LAXTG, LPXTA 또는 NPQTN, 이때 X는 임의의 고려 가능한 아미노산 서열이다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라 상기 생성되는 링커는 하기의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 가지며: -LPXTGn-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, -LAXTGn-, -LPXTGn-, -LPXTAn- 또는 -NPQTGn-, 이때 Gn은 올리고- 또는 폴리글리신이고, 이때 n은 ≥1 내지 ≤21의 정수이며, An은 올리고- 또는 폴리알라닌이고, 이때 n은 ≥1 내지 ≤21의 정수이며, X는 임의의 고려 가능한 아미노산 서열이다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 안트라사이클린 유도체는 하나 이상의 링커에 의해 결합 단백질의 카복시 말단, 또는 적어도 하나의 도메인(domain) 또는 이의 서브유닛(subunit)의 카복시 말단에 접합된다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 상기 결합 단백질은 아미드 결합에 의해 올리고-글리신 펩티드(Gly)n의 아미노 말단에 접합된다. 하나의 특정한 구현예에서(이때 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A가 사용된다, 하기를 참조하시오), 상기 올리고-글리신(Gly)n을 올리고-알라닌(Ala)n에 의해 임의로 교체할 수 있음을 아는 것이 중요하다.
사용되고 있는 솔타제는 바람직하게는 솔타제 A이다. 하나의 구현예에서, 상기는 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 솔타제 A이다. 하나의 구현예에서, 솔타제 A 인식 모티프를 여전히 인식하는 조작된 솔타제 A가 사용되고 있다. 하나의 구현예에서, 상기 조작된 솔타제 A는 스트렙토코커스 피오게네스 솔타제 A로부터 유래된다. 하나의 다른 구현예에서, 상기 조작된 솔타제 A는 스타필로코커스 아우레우스 솔타제 A로부터 유래된다.
또 다른 구현예의 그룹에 따라, 결합 단백질은 항체, 항체-기반 결합 단백질, 표적 결합 능력을 보유하는 변형된 항체 포맷(modified antibody format), 표적 결합 능력을 보유하는 항체 유도체 또는 단편, 대안의 스캐폴드(scaffold) 및/또는 항체 모방물질(mimetic)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다.
상기 중에서, 항체가 가장 바람직한 유형의 결합 단백질이다.
"항체", "항체-기반 결합 단백질", "표적 결합 능력을 보유하는 변형된 항체 포맷", "표적 결합 능력을 보유하는 항체 유도체 또는 단편"이란 용어는 주어진 항원, 에피토프(epitope) 또는 에피토프들에 대해 강한 1가, 2가 또는 다가 결합을 나타내는 폴리펩티드 쇄(들)를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항체-결합 단편을 임의의 적합한 기술, 예를 들어 하이드리도마 기술, 리보솜 디스플레이, 파지 디스플레이, 유전자 셔플링 라이브러리(gene shuffling library), 반-합성 또는 완전합성 라이브러리 또는 이들의 조합을 사용하여 생성시킬 수 있다. 본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항체-결합 단편은 온전한 항체 및 온전한 항체의 항원-결합 성질을 함유하고 동족 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편 또는 항체-결합 단편을 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 모든 항체 및 항원-결합 단편 서열을 포함한 모든 펩티드 서열은 N→C 순서로 지칭된다.
온전한 항체는 전형적으로 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄(약 50-70 kD) 및 2개의 경(L)쇄(약 25 kD)를 포함한다. 항체 쇄를 암호화하는 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론, 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라, 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로서 분류되며, 이들은 차례로 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 항체의 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG의 경우에, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 및 전형적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에의 상기 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 단클론 항체(mAb)는 동일한 항체 분자들로 이루어진다.
항체의 VH 및 VL 영역을 고가변성 영역(또한 상보성-결정 영역(CDR)이라 칭한다)으로 추가로 세분할 수 있으며, 이들 영역은 보다 보존된 골격 영역(framework region; FR)들과 산재된다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노-말단에서 카복실-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 및 FR 영역의 위치 및 넘버링 시스템, 예를 들어 본원에 사용되는 바와 같은 IMGT 시스템(Feffanc MP et al., 2015)이 정의되었다.
본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편은 또한 단쇄 항체를 포함한다. "단쇄 항체"란 용어는 일반적으로 이격자 펩티드를 통해 연결된, 폴리펩티드 연결 중에 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 아미노- 및/또는 카복실-말단에 추가적인 도메인 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단쇄 항체는 암호화 폴리뉴클레오티드에의 연결을 위해 테더 분절(tether segment)을 포함할 수 있다. 일례로서, 단쇄 가변 영역 단편(scFv)은 단쇄 항체이다. 별도의 유전자를 암호화하는 Fv 단편의 VL 및 VH 도메인에 비해, scFv는 합성 링커에 의해 결합된(예를 들어 재조합 방법을 통해) 2개의 도메인을 갖는다. 이는 이들 도메인이, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 한다.
항체-기반 결합 단백질의 예는 항체의 결합 도메인이 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인, 예를 들어 대안의 분자 스캐폴드, Fc-영역, 추가적인 결합 성질을 갖는 분자를 생성시키는 다른 폴리펩티드 또는 항체의 다른 기능성 또는 결합 도메인과 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 이중- 또는 다중특이성 단백질 또는 항체이다. 상기와 같은 폴리펩티드는 천연 항체 또는 항체 단편에서 통상적으로 발견되지 않는 결합 또는 기능성 도메인의 배열을 생성시킬 수 있다.
항원-결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 Cm 도메인으로 이루어지는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 온전한 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) 구조적으로 보존된 골격 영역간에 조작된 쇄간 디설파이드 결합을 갖는 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv); (vi) VH 또는 VL 도메인으로 이루어지는 단일 도메인 항체(dAb)(예를 들어 문헌[Ward et al., Nature 341:544-546, 1989]을 참조하시오); 및 (vii) 선형 또는 환상 펩티드로서 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 단편은 또한 카멜리드 스캐폴드(camelid scaffold)를 갖는 단일 도메인 항원-결합 단위를 포함한다. 카멜리드과의 동물은 낙타, 라마 및 알파카를 포함한다. 카멜리드는 경쇄가 없는 기능성 항체를 생산한다. 중쇄 가변(VH) 도메인은 자율적으로 폴딩(folding)하고 항원-결합 유닛으로서 독립적으로 기능한다. 이의 결합 표면은 전형적인 항원-결합 분자(Fab) 또는 단쇄 가변 단편(scFv) 중의 6개 CDR에 비해 단지 3개의 CDR만을 수반한다. 카멜리드 항체는 통상적인 항체에 필적하는 결합 친화성을 획득할 수 있다.
"인간 항체"란 용어는 실질적으로 모든 CDR 영역이 인간 기원이고 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 영역에 상응하도록 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 항체, 항체-기반 결합 단백질 또는 항원-결합 단편을 지칭한다.
"대안의 스캐폴드" 및 "항체 모방물질"이란 용어는 면역글로불린 패밀리(family)에 속하지 않는 단백질, 및 심지어 비-단백질, 예를 들어 앱타머(aptamer), 또는 합성 중합체를 지칭한다. 일부 유형은 항체-유사 베타-시트 구조를 갖는다. 항체에 비해 "항체 모방물질" 또는 "대안의 스캐폴드"의 잠재적인 장점은 보다 양호한 용해도, 보다 높은 조직 침투, 열 및 효소에 대한 보다 높은 안정성, 및 비교적 낮은 생산 비용이다.
일부 항체 모방물질을 큰 라이브러리로 제공할 수 있으며, 이는 모든 가능한 표적에 대해 특정한 결합 후보를 제공한다. 항체와 마찬가지로, 표적 특이 항체 모방물질을 대량 신속처리 선별(HTS) 기술뿐만 아니라 파지 디스플레이, 세균 디스플레이, 효모 또는 포유동물 디스플레이와 같은 확립된 디스플레이 기술을 사용하여 개발할 수 있다. 현재 개발된 항체 모방물질은 예를 들어 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein)(DARPin이라 칭한다), C-형 렉틴, 에스 아우레우스의 A-도메인 단백질, 트랜스페린, 리포칼린, 피브로넥틴의 10번째 유형 III 도메인, 쿠니츠 도메인 프로테아제 억제제, 유비퀴틴 유래된 결합제(아필린이라 칭함), 감마 크리스탈린 유래된 결합제, 시스테인 매듭 또는 노틴, 티오레독신 A 스캐폴드 기반 결합제, 핵산 앱타머, 중합체의 분자 각인에 의해 생성된 인공 항체, 세균 게놈으로부터의 펩티드 라이브러리, SH-3 도메인, 스트라도바디, 디설파이드 결합 및 Ca2+에 의해 안정화된 막 수용체의 "A 도메인", CTLA4-기반 화합물, Fyn SH3 및 앱타머(특정한 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩티드 분자)를 포함한다.
본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편은 암세포상의 또는 종양의 암세포 환경내의 임의의 적합한 표적에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편은 암세포 표면상의 표적에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 상기 표적은 암세포상에서 독점적으로 발현되거나 또는 건강한 조직에 비해 암세포상에서 과발현된다. 출원인은 본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편이 암세포상에서 결합하고 상기 본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편이 상기 세포내에, 안트라사이클린 독소 모이어티와 함께 내면화되게 하여, 상기 세포의 면역원성 세포사 및/또는 면역 세포(예를 들어 T 세포)의 종양내로의 침윤을 생성시키는 임의의 표적이 적합한 표적임을 제시한다. 당업자는 문헌 조사 및 실험을 통해 상기와 같은 표적을 식별할 수 있다.
하나의 구현예에서, 적합한 표적은 ROR1, CS-1, HER2, 메소텔린 및 ROR2를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체-기반 결합 단백질 및 항원-결합 단편은 ROR1에 결합한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질-독소 접합체 중에 포함된 결합 단백질은
a) 하기의 서열번호 쌍: 1 및 2; 3 및 4, 5 및 6 및/또는 20 및 21에 제시된 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열 쌍 중에 포함된 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함하고
b) 하기의 서열번호를 (HCDR1; HCDR2; HCDR3; LCDR1; LCDR2 및 LCDR3)의 순서로 포함하는 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함하며:
·22, 23, 24, 25, 26, 및 27,
·28, 29, 30, 31, 32, 및 33,
·34, 35, 36, 37, 38, 및 39, 및/또는
·40, 41, 42, 43, 44, 및 45
c) b)의 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하나, 단 상기 CDR 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대하여 3개 이하의 아미노산 치환을 갖고, 및/또는
d) b) 또는 c)의 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하나, 단 상기 CDR 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대해 ≥66%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는,
항체이며, 여기에서 상기 CDR은 충분한 결합 친화성으로 ROR1에 결합할 수 있도록 적합한 단백질 골격(protein framework) 내에 포매(embedding)된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"이란 용어는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역내에서 발견된 비-인접 항원 결합 부위를 의미하고자 한다. 이러한 특정 영역은 하기의 문헌에 기재되었으며, 이들 문헌에서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다: Rabat et al. (1977), Rabat et al. (1991), Chothia et al. (1987) 및 MacCallum et al., (1996). 그럼에도 불구하고, 항체 또는 접목된 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범위내에 있고자 한다. 상기에 인용된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기를 비교로서 하기의 표에 제시한다. 상기 넘버링은 포함된 서열 목록에 실제로 개시된 CDR과 상이할 수 있는데, 그 이유는 CDR 정의가 경우에 따라 다르기 때문이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "골격"이란 용어는 항체 가변 영역과 관련하여 사용될 때 항체의 가변 영역내 CDR 영역 밖의 모든 아미노산 잔기를 의미하기 위해 나타낸다. 따라서, 가변 영역 골격은 길이가 약 100-120 아미노산이나, 단지 CDR 밖의 아미노산만을 언급하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "충분한 결합 친화성으로 표적 X에 결합할 수 있는"이란 용어는 각각의 결합 도메인이 10-4 이하의 KD로 표적에 결합함을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. KD는 평형 해리 상수로, 단백질 결합제와 이의 항원간의 koff/kon의 비이다. KD와 친화성은 역으로 관련된다. 상기 KD 값은 단백질 결합제의 농도(특정 실험에 필요한 단백질 결합제의 양)에 관한 것이며, 따라서 KD 값이 낮을수록(보다 낮은 농도) 결합 도메인의 친화성은 높다. 하기의 표는 단클론 항체의 전형적인 KD 범위를 나타낸다.
바람직하게, 단백질 결합제는 2 이하의 아미노산 치환, 및 보다 바람직하게는 1 이하의 아미노산 치환을 갖는다.
바람직하게, 상기 CDR 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대해 ≥ 67 %; ≥ 68 %; ≥ 69 %; ≥ 70 %; ≥ 71 %; ≥ 72 %; ≥ 73 %; ≥ 74 %; ≥ 75 %; ≥ 76 %; ≥ 77 %; ≥ 78 %; ≥ 79 %; ≥ 80 %; ≥ 81 %; ≥ 82 %; ≥ 83 %; ≥ 84 %; ≥ 85 %; ≥ 86 %; ≥ 87 %; ≥ 88 %; ≥ 89 %; ≥ 90 %; ≥ 91 %; ≥ 92 %; ≥ 93 %; ≥ 94 %; ≥ 95 %; ≥ 96 %; ≥ 97 %; ≥ 98 %; ≥ 99 %, 및 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교창에 걸쳐 비교함으로써 측정되며, 여기에서 상기 비교창(comparison window) 중의 폴리뉴클레오티드 서열 부분은 상기 2개 서열의 최적의 정렬을 위해, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열(예를 들어 폴리펩티드)과 비교시 부가 또는 결실(즉 끊김)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 2개의 서열 모두에 존재하여 합치된 위치의 수를 생성시키는 위치의 수를 측정하고, 상기 합치된 위치의 수를 상기 비교창 중의 총 위치수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 생성시킴으로써 계산된다.
"일치하는" 또는 "일치성(동일성)" 퍼센트란 용어는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열이 비교창에 걸쳐, 또는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정시 지정된 영역에 대해 최대의 상응성으로 비교 및 정렬될 때 동일한(즉 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우, 참조 서열의 전체 서열에 걸쳐, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 경우 이들 두 서열은 "실질적으로 일치한다". 본 개시내용은 본원에 예시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 각각 실질적으로 일치하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 임의로, 상기 동일성은 적어도 약 15, 25 또는 50 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000 이상의 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재한다. 아미노산 서열에 관하여, 동일성 또는 실질적인 동일성은 적어도 5, 10, 15 또는 20 아미노산 길이, 임의로 적어도 약 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100 아미노산 길이, 임의로 적어도 약 150, 200 또는 250 아미노산 길이인 영역에 걸쳐, 또는 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다. 보다 짧은 아미노산 서열, 예를 들어 20 이하 아미노산의 아미노산 서열에 관하여, 하나 또는 2개 아미노산 잔기가 본원에 정의된 보존적 치환에 따라 보존적으로 치환되는 경우 실질적인 동일성이 존재한다.
바람직하게, CDR 중 적어도 하나에
·친화성 성숙화
·면역원성의 감소
를 포함한 CDR 서열 변형이 가해졌다.
친화성 성숙화는 주어진 항체의 친화성을 시험관내에서 증가시키는 과정이다. 자연적인 대응물처럼, 시험관내 친화성 성숙화는 돌연변이 및 선택의 원칙에 기반한다. 상기는 항체, 항체 단편 또는 항체 모방물질과 같은 다른 펩티드 분자의 최적화에 성공적으로 사용되었다. CDR 내부의 무작위 돌연변이를 방사선, 화학적 돌연변이유발원 또는 오류빈발 PCR을 사용하여 도입시킨다. 또한, 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의해 유전적 다양성을 증가시킬 수 있다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 사용하는 2 또는 3 라운드의 돌연변이 및 선택은 대개 낮은 나노몰 범위의 친화성을 갖는 항체 단편을 생성시킨다. 원리에 대해서 문헌[Eylenstein et al.(2016)](내용이 본 원에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
조작된 항체는 임의의 필수적인 골격 역-돌연변이와 함께 서열-유래된 V 영역내에 접목된 쥐-서열 유래된 CDR 영역을 함유한다. 따라서, 상기 CDR 자체가, 인간화된 항체를 환자에게 투여할 때 면역원성 반응을 야기할 수 있다. CDR에 의해 야기된 면역원성의 감소 방법은 문헌[Harding et al.(2010)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질-독소 접합체 중에 포함된 결합 단백질은
a) 하기의 서열번호 쌍: 1 및 2; 3 및 4, 5 및 6 및/또는 20 및 21에 제시된 중쇄/경쇄 가변 도메인(HCVD/LCVD) 쌍
b) a)의 중쇄/경쇄 가변 도메인(HCVD/LCVD) 쌍, 단
·상기 HCVD는 각각의 서열번호에 대해 ≥80%의 서열 동일성을 갖고, 및/또는
·상기 LCVD는 각각의 서열번호에 대해 ≥80%의 서열 동일성을 가지며,
c) a) 또는 b)의 중쇄/경쇄 가변 도메인(VD) 쌍을 포함하나, 단 상기 HCVD 또는 LCVD 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대하여 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는
항체이며, 여기에서 상기 단백질 결합제는 여전히 충분한 결합 친화성으로 ROR1에 결합할 수 있다.
"가변 도메인"은 항체 또는 이의 중쇄 또는 경쇄와 관련하여 사용될 때 분자상에 항원 결합을 부여하고 불변 영역은 아닌 항체의 부분을 의미하고자 한다. 상기 용어는 전체 가변 영역의 모든 결합 기능 중 일부를 보유하는 기능성 단편을 포함하고자 한다. 가변 영역 결합 단편은 예를 들어 기능성 단편, 예를 들어 Fab, F(ab)2, Fv, 단쇄 Fv(scfv) 등을 포함한다. 상기와 같은 기능성 단편은 당업자에게 주지되어 있다. 상응하게, 헤테로머 가변 영역의 기능성 단편의 기재에서 상기 용어의 사용은 당업자에게 주지된 정의에 상응하고자 한다. 상기와 같은 용어는 예를 들어 문헌[Huston et al., (1993)] 또는 문헌[Pluckthun and Skerra (1990)]에 기재되어 있다.
바람직하게, 상기 HCVD 및/또는 LCVD는 각각의 서열번호에 대해 ≥ 81 %; ≥ 82 %; ≥ 83 %; ≥ 84 %; ≥ 85 %; ≥ 86 %; ≥ 87 %; ≥ 88 %; ≥ 89 %; ≥ 90 %; ≥ 91 %; ≥ 92 %; ≥ 93 %; ≥ 94 %; ≥ 95 %; ≥ 96 %; ≥ 97 %; ≥ 98 %; ≥ 99 %; 또는 가장 바람직하게 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질은 보존적 아미노산 치환인 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "보존적 아미노산 치환"은 항체 기능에 대해 비-보존적 치환보다 더 적은 영향을 미친다. 아미노산 분류에 다수의 방법이 존재하지만, 아미노산은 종종 이의 구조 및 R 기의 일반적인 화학적 특징에 기초하여 6개의 주요 그룹으로 분류된다.
일부 구현예에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 예를 들어, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에서 정의되었다. 상기 패밀리는
·염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘)
·산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산)
·하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인)
·비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판)
·베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및
·방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)
를 갖는 아미노산을 포함한다.
다른 보존된 아미노산 치환이 또한 아미노산 측쇄 패밀리에 걸쳐, 예를 들어 펩티드의 전하를 변경시키기 위해서 아스파트산 대신 아스파라진을 치환하는 경우 발생할 수 있다. 보존적 변화는 화학적으로 상동성인 비-천연 아미노산(즉 류신 대신에 합성 비-천연 소수성 아미노산, 트립토판 대신에 합성 비-천연 방향족 아미노산)의 치환을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질은 상기 기재에 따른 항체의 ROR1에 대한 표적 결합 친화성에 비해 적어도 50%의 ROR1에 대한 표적 결합 친화성을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이 "결합 친화성"이란 용어는 결합 상호작용의 강도를 의미하고자 하며, 따라서 실제 결합 친화성뿐만 아니라 겉보기 결합 친화성을 모두 포함한다. 상기 실제 결합 친화성은 해리율에 대한 결합율의 비이다. 따라서, 결합 친화성의 부여 또는 최적화는 상기 성분 중 어느 하나 또는 둘 다를 목적하는 수준의 결합 친화성이 성취되도록 변경시킴을 포함한다. 상기 겉보기 친화성은 예를 들어 상호작용의 결합활성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2가 헤테로머 가변 영역 결합 단편은 이의 원자가에 기인한 변경된 또는 최적화된 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
결합제의 친화성을 측정하기에 적합한 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해서이다. 상기 방법은 표면 플라스몬파가 금속/액체 계면에서 여기될 때 발생하는 현상에 기반한다. 빛이 샘플과 접촉하지 않은 표면의 면을 향하고 이로부터 반사되며, SPR이 특정 조합의 각도와 파장에서 반사광 강도를 감소시킨다. 생물분자 결합 사건은 표면층에서 굴절률의 변화를 야기하며, 이것이 SPR 신호의 변화로서 검출된다. 상기 결합 사건은 수용체-리간드 쌍간의 결합 또는 해리일 수 있다. 상기 굴절률의 변화는 본질적으로 순간적으로 측정될 수 있으므로 친화성 상수의 개별 성분을 결정할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 결합율(kon) 및 해리율(koff)의 정확한 측정을 가능하게 한다.
kon 및 koff 값의 측정은 이들이 치료학적으로 보다 유효한 변경된 가변 영역 또는 최적화된 가변 영역을 식별할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 예를 들어, 변경된 가변 영역 또는 이의 헤테로머 결합 단편은 예를 들어 유사한 결합 친화성을 나타내는 가변 영역 및 헤테로머 결합 단편에 비해 보다 높은 kon 값을 갖기 때문에 보다 유효할 수 있다. 보다 높은 kon 값을 갖는 분자는 보다 빠른 속도로 이의 표적에 특이적으로 결합하여 상기 표적을 억제할 수 있기 때문에 증가된 효능이 부여된다. 유사하게, 본 발명의 분자는 유사한 결합 친화성을 갖는 분자에 비해 보다 낮은 koff 값을 나타내기 때문에 보다 유효할 수 있다. 보다 낮은 koff 속도를 갖는 분자에 의해 증가된 효능이 관찰될 수 있는데, 그 이유는 상기 분자가 일단 결합되면 이의 표적으로부터 보다 느리게 해리되기 때문이다. 상기 결합율 및 해리율의 측정에 대해 기재된 방법을 본 발명의 변경된 가변 영역 및 최적화된 가변 영역과 관련하여 기재하지만, 상기 방법을 치료 또는 진단에 더 유효한 결합제를 식별하기 위해 본질적으로 임의의 단백질 결합제 또는 이의 단편에 적용할 수 있다.
결합제의 친화성을 측정하기 위한 또 다른 적합한 방법은 표면을 통해 FACS/스캐차드 분석에 의해서이다.
표면 플라스몬 공명을 사용하는 결합 및 해리율을 포함한 친화성의 측정 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Jonsson and Malmquist, (1992)] 및 문헌[Wu et al. (1998)]에 기재되어 있다. 더욱이, 결합 상호작용의 측정에 대해 당해 분야에 주지된 한 가지 장치는 BIAcore 2000 장비이며, 이를 Pharmacia Biosensor(Uppsala, Sweden)를 통해 상업적으로 입수할 수 있다.
바람직하게 상기 표적 결합 친화성은 참조 결합제의 친화성에 비해 ≥ 51%, ≥ 52%, ≥ 53%, ≥ 54%, ≥ 55%, ≥ 56%, ≥ 57%, ≥ 58%, ≥ 59%, ≥ 60%, ≥ 61%, ≥ 62%, ≥ 63%, ≥ 64%, ≥ 65%, ≥ 66%, ≥ 67%, ≥ 68%, ≥ 69%, ≥ 70%, ≥ 71%, ≥ 72%, ≥ 73%, ≥ 74%, ≥ 75%, ≥ 76%, ≥ 77%, ≥ 78%, ≥ 79%, ≥ 80%, ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84%, ≥ 85%, ≥ 86%, ≥ 87%, ≥ 88%, ≥ 89%, ≥ 90%, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, 및 가장 바람직하게 ≥ 99%이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질은 상기 기재에 따른 항체와 ROR1 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 결합 단백질은 상기 기재에 따른 항체와 본질적으로 동일한, 또는 동일한, ROR1상의 영역에 결합한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "결합에 대해 경쟁하다"란 용어는 상기와 같은 서열에 의해 한정된 항체 중 하나와 관련하여 사용되며, 이는 실제 단백질 결합제가 상기 서열 한정된 단백질 결합제와 동일한 표적 또는 표적 에피토프 또는 도메인 또는 서브도메인에 결합하는 활성으로서, 후자의 변이체임을 의미한다. 결합 효율(예를 들어 동역학 또는 열역학)은 후자의 효율과 같거나 또는 이보다 크거나 또는 이보다 작을 수 있다. 예를 들어, 기질에의 결합에 대한 평형 결합 상수가 2개의 항체에 대해 상이할 수 있다.
상기와 같은 결합에 대한 경쟁을 경쟁 결합 분석으로 적합하게 측정할 수 있다. 상기와 같은 분석은 문헌[Finco et al. 2011]에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 인용되고, 특허 청구항의 이해를 위한 이의 의미는 문헌[Deng et al 2018]에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
상기 특징을 시험하기 위해서, 적합한 에피토프 맵핑 기술을, 특히
·X-선 공-결정학 및 극저온 전자 현미경검사(cryo-EM)
·배열-기반 올리고-펩티드 스캐닝
·부위-지향된 돌연변이유발 맵핑
·대량신속처리 샷건 돌연변이유발 에피토프 맵핑
·수소-중수소 교환, 및/또는
·가교결합-커플링된 질량 분광분석
을 포함하여 입수할 수 있다.
이들 방법은 특히 문헌[Banik et al (2010)], 및 문헌[DeLisser (1999)]에 개시되고 논의되며, 이의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
실시예
본 발명을 도면 및 상기 설명에 상세히 예시하고 기재하였지만, 상기와 같은 예시 및 설명은 제한적이지 않고 예시적이거나 예시적인 것으로 간주되어야 하며; 본 발명은 개시된 구현예로 제한되지 않는다. 개시된 구현예에 대한 다른 변형은 도면, 개시내용, 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시함에 있어서 당업자에 의해 이해되고 수행될 수 있다. 청구범위에서, "포함하는"이란 단어는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정관사 "하나의"는 복수를 배제하지 않는다. 몇몇 수단이 서로 상이한 종속항에 인용되어 있다는 단순한 사실은 이들 수단의 조합이 이점을 얻기 위해 사용될 수 없음을 가리키는 것은 아니다. 청구범위에서 임의의 참조 기호는 그 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 나타내며; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'→3'으로 나타낸다.
실시예 1. 정제된, 재조합 항-인간 ROR1 및 아이소타입 대조군 항체의 생성
발현 벡터: 항체 가변 영역 암호화 영역을 리더 서열로서 MNFGLRLIFLVLTLKGVQC를 사용하여 전체 유전자 합성(GenScript)에 의해 생성시키고, 적용가능한 경우, 발현 벡터 pCB14 중의 인간 IgH-γ1 및 IgL-κ 또는 IgL-λ 불변 영역과 조립하였다. 에피솜 포유동물 발현 벡터 pCEP4(Invitrogen)의 유도체인 상기 벡터는 EBV 복제 기원을 가지며, EBV 핵 항원(EBNA-1)을 암호화하여 염색체-외 복제를 허용하고, 원래의 하이그로마이신 B 내성 유전자 대신에 퓨로마이신 선택 마커를 함유한다.
발현 및 정제: pCB14-기반 발현 벡터를 PLUSTM 시약(Thermo Fisher Scientific, Reinach, Switzerland, 15388100)과 함께 리포펙타민® LTX 시약을 사용하여 HEK293T 세포내에 형질감염시키고; 1-일 배양(37℃, 5% CO2, 생육 배지: 10%(v/v) 송아지 태아 혈청(FCS), 100 IU/㎖의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept, Allschwil, Switzerland)과 함께 L-글루타민을 갖는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 고 글루코스(4.5g/L))에 이어서, 세포를 선택 조건(2 pg/㎖의 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, Buchs SG, Switzerland, P8833-25 ㎎ 모액 2 ㎎/㎖)) 하에서 확대시켰다. 세포를 분할하고 추가로 확대시키고(37℃, 5% CO2); 일단 융합에 도달되면, 조직 배양 디쉬를 37℃에서 2h 동안 20 pg/㎖ 폴리-L-리신(Sigma-Aldrich, P1524)으로 코팅하고 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 트립신처리하고 폴리-L-리신-코팅된 플레이트상에 1:3 분할하였다. 다시 융합에 도달된 후에, 세포를 PBS로 세척한 다음 1 pg/㎖ 퓨로마이신(Sigma, P8833), 100 IU/㎖의 Pen-Strep-Fungizone(Bioconcept), 161 ㎍/㎖의 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich, A8199) 및 10 pg/㎖의 환원된 L-글루타치온(Sigma-Aldrich, G6529)이 보충된 생산 배지(DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03)로 배지 교체하였다. 상등액을 2주마다 수확하고, 여과하여(0.22 pm) 세포를 제거하고, 정제시까지 4℃에서 보관하였다.
정제를 위해서, 여과된 상등액을 PBS-평형화된 단백질 A HiTrap 컬럼(GE Healthcare, Frankfurt am Main, Germany, 17-0405-01) 또는 JSR AmsphereTM 단백질 A 컬럼(JSR Life Sciences, Leuven, Belgium, JWT203CE) 상에 로딩하고 PBS로 세척하고; AEKTA pure(GE Healthcare) 상에서 0.1M 글리신(pH 2.5)을 사용하여 용출을 수행하였다. 분획들을 1M 트리스-HCl 완충제(pH 8.0)로 즉시 중화시키고, SDS-PAGE에 의해 단백질 순도 및 완전성에 대해 분석하였다. 단백질-함유 분획들을 혼합하고 Amicon 여과 유닛(Millipore, Schaffhausen, Switzerland, UFC901008)을 사용하여 완충제 교환을 수행하여 PBS 중의 1:100의 희석에 도달하고, 이어서 저 체류 필터(0.20 pm, Carl Roth, Karlsruhe, Germany, PA49.1)를 사용하여 멸균 여과하였다.
항체를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고 재조합 항체를 당해 분야에 공지된 바와 같이, CHO 세포 상등액으로부터 표준 단백질 A 정제에 의해 정제하였다. 재조합 항체의 순도 및 완전성을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
| 항체 | 포맷 | 항체 서열번호 HC/LC |
C-말단 태그
(HC: 중쇄, LC: 경쇄) |
| XBR1-402 (mAb202) | IgG | HC: 서열번호 1 LC: 서열번호 2 |
HC: LPETG-Strep LC: G4LPETG-Strep |
| Ac10 (mAb046) | IgG | HC: 서열번호 3 LC: 서열번호 4 |
HC: LPETG-Strep LC: G4SLPETG-Strep |
| 2A2 (mAb066) | IgG | HC: 서열번호 5 LC: 서열번호 6 |
HC: LPETG-Strep LC: G4SLPETG-Strep |
| huXBR1-402-17 (mAb357) | IgG | HC: 서열번호 20 LC: 서열번호 21 |
HC: 없음 LC: G4SLPETG-TwinStrep |
| Ac10 (mAb340) | IgG | HC: 서열번호 3 LC: 서열번호 4 |
HC: 없음 LC: G4SLPETG-TwinStrep |
실시예 2. SMAC-technologyTM를 사용하는 ADC 형성을 위한 mAb와 글리신-변형된 독소와의 접합
솔타제 A. 스타필로코커스 아우레우스의 솔타제 A에 기반한 재조합 및 친화성 정제된 솔타제 A 효소를 WO2014140317A1에 기재된 기법에 따라 이 콜라이에서 생성시켰다.
글리신-변형된 독소의 생성. SMAC-technologyTM 접합된 ADC를 생성시키기 위해서, 펜타글리신-EDA-PNU 유도체(G5-EDA-PNU)를 Concortis에 의해 제조하였다(도 1에 묘사됨). 펜타글리신-변형된 독소의 정체 및 순도를 각각 질량-분광분석 및 HPLC에 의해 확인하였다. G5-EDA-PNU는 HPLC 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, >95% 순도를 나타내었다.
솔타제-매개된 항체 접합. 상기 언급한 독소를, LPETG-태그된 mAb[10 μM]를 글리신 변형된 독소[200 μM] 및 3 μM 솔타제 A와 25℃에서 3.5h 동안, 나열된 접합 완충제 중에서 배양함으로써 표 2에 따른 항체에 접합시켰다. 상기를 rProtein A GraviTrap 컬럼(BioRad)에 통과시킴으로써 반응을 정지시켰다. 결합된 접합체를 5 컬럼 부피의 용출 완충제(0.1 M 글리신 pH 2.5, 50 nM NaCl)로 용출시키며, 이때 1 컬럼 부피 분획은 산을 중화시키기 위해 25% v/v 1M HEPES pH 8을 함유하는 튜브에 수집하였다. 단백질 함유 분획을 모으고 ZebaSpin 탈염 컬럼(desalting column)을 사용하여 표 2의 제형 완충제에서 제형화시켰다.
ADC 분석. 약물-항체 비(DAR)를, 0.05 내지 0.1% TFA/H2O 및 0.04 내지 0.1% TFA/CH3CN의 25-분 선형 구배로 1 ㎖/분/80 ℃의 5 ㎛ 컬럼 실행에 의해 Polymer Labs PLRP 2.1 ㎜ x 5 ㎝ 상에서 수행된 역상 크로마토그래피에 의해 평가하였다. 샘플을 먼저 37℃에서 15분간 pH 8.0의 DTT와 배양하여 환원시켰다. 역상 크로마토그래피에 의해 측정된 DAR을 하기 표 2에 요약한다.
| ADC | mAb (ref.) | 독소 | 접합 완충제 | 제형 완충제 | DAR |
| XBR1-402-G5-PNU | XBR1-402 (mAb202) | G5-PNU | 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM CaCl2 | PBS | ND |
| Ac10-G5-PNU | Ac10 (mAb046) | G5-PNU | 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 | PBS | 3.7 |
| Ac10-G3-PNU | Ac10 (mAb340) | G3-PNU | 250mM HEPES, pH 7.5, 5mM CaCl2, 50% 글리세롤 | PBS | 1.9 |
| huXBR1-402-17-G3-PNU | huXBR1-402-17 | G3-PNU | 250mM HEPES, pH 7.5, 5mM CaCl2, 50% 글리세롤 | 15mM 히스티딘, pH 6.5, 175mM 슈크로스, 0.02% Tween20 | 1.9 |
| huXBR1-402-17-G2-PNU | huXBR1-402-17 | G2-PNU | 250mM HEPES, pH 7.5, 5mM CaCl2, 50% 글리세롤 | 15mM 히스티딘 pH 6.5, 175mM 슈크로스, 0.02% Tween20 | 2.0 |
상기 분석으로부터, SMAC-technologyTM 접합이 높은 효율로 진행되었음을 결론내릴 수 있다.
실시예 3. 인간 ROR1을 안정하게 발현하는 EMT-6 세포의 생성
쥐 EMT-6 유방암 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10%(v/v) 송아지 태아 혈청(FCS), 100 IU/㎖의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept, Allscwil, Switzerland)과 함께 L-글루타민을 갖는 DMEM 완전배지(둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 고 글루코스(4.5 g/L))에서 배양하였다. 세포를 하기와 같이 전위에 의해 ROR1을 과발현하도록 조작하였다: 세포를 원심분리시키고(6분, 290 x g, 4℃) RPMI-1640 배지(5x106 세포/㎖)에 재현탁하였다. 이어서 400 ㎕의 세포 현탁액을 13.3 ㎍의 수송가능한 벡터 pPB-PGK-Puro-ROR1(퓨로마이신-내성 유전자와 함께 완전길이 ROR1(NP_005003.2)의 공-발현 유도) 및 6.6 ㎍의 트랜스포사제-함유 벡터 pCDNA3.1_hy_mPB를 함유하는 400 ㎕의 RPMI에 가하였다. DNA/EMT-6 세포 혼합물을 일렉트로포레이션 큐벳(0.4 ㎝-끊김, 165-2088, BioRad, Cressier, Switzerland)으로 옮기고 전기용량 증량기를 갖는 Biorad Gene Pulser II를 사용하여 300 V 및 950 pF에서 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, 세포를 실온에서 5-10분간 배양하였다. 배양에 이어서, 세포를 에펜도르프 581 또는 원심분리기에서 290 x g에서 6분간 원심분리시키고, 1회 세척하고, 후속적으로 5% CO2 분위기의 가습 배양기에서 37℃에서 배양에 앞서 DMEM 완전배지에 재현탁시켰다. 일렉트로포레이션 후 하루째에, 3 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, P8833)을 가함으로써 인간 ROR1을 안정하게 발현하는 세포 풀(cell pool)을 선택하였다.
ROR1을 발현하는 단세포 클론은 항생제-선택된 EMT-6-ROR1 세포로부터 유래되었다. 간단히, 트립신처리에 이어서, 106 세포를 FACS 튜브에서 원심분리시키고; 수득된 펠릿을 완충제(2%(v/v) FCS가 있는 PBS)에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 30분간(4℃, 최종 농도 2 pg/㎖) 항-ROR1 항체 2A2와 배양한 다음, 원심분리시키고 세척하였다. 이어서 세포를 이전과 같이 재현탁하고 암실(30분, 4℃)에서 1:250 희석으로 항-인간 IgG 항체(Fc 감마-특이성) PE(eBioscience, Vienna Austria, 12-4998-82)와 배양하고, 완충제 중에서 1회 세척하고, FACSAriall 장비(BD Biosciences, San Jose, USA)를 사용하여 FACS에 의해 항원-발현 세포를 단세포 분류할 때까지 빙상에서 유지시켰다.
실시예 4. EMT-6-ROR1 동계 유방종양 모델에서 항-ROR1 ADC의 생체내 평가
100 ㎕ PBS 중의 1x106 EMT-6-ROR1 클론 14 종양 세포를 각각의 BAFB/c 마우스의 유방 지방패드에 동소 이식하였다. 대략 30-80 ㎣(캘리퍼스에 의해)의 평균 종양 부피에 도달하면, 0일째에(D0) 마우스를 각각 종양 크기에 따라 8마리 동물의 그룹으로 블록-무작위분류(block-randomized)하였다. 이어서 마우스를 차선의 용량을 측정하기 위해 상이한 용량(0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏ 및 1 ㎎/㎏)으로 1회 처리하였으며, 여기에서 ADC는 오직 부분적인 항-종양 반응만을 생성시킨다. 이어서, 표 3에 따라 아이소타입-합치된 대조군 ADC를 포함한 저 용량 ADC 처리, 및 10 ㎎/㎏ 항-CTLA4 면역관문 억제제 mAh 9D9에 의한 병용 처리의 존재 또는 부재하에 동일한 모델을 설정하였다. 마우스를 적어도 40일까지 모니터링하였으며, 과도한 종양 크기 또는 고통의 징후의 경우에 안락사시켰다. 면역관문 억제제 9D9는 마우스 CTLA-4의 억제제이며 PBS 중에서 제형화되었고 BioXcell(West Lebanon, New Hampshire, U.S.)로부터 구입하였다.
| 그룹 | 처리 농도 | 적용 | |||
| 부피 | 경로 | 무작위분류후 계획 | |||
| 1 | 비히클 대조군 | - | 5 ㎖/㎏ | i.v. | 1회 D0 |
| 2 | Ac10-G5-PNU (아이소타입 대조군) | 0.25 ㎎/㎏ | 5 ㎖/㎏ | i.v. | 1회 D0 |
| 4 | XBR1-402-G5-PNU | 0.25 ㎎/㎏ | 5 ㎖/㎏ | i.v. | 1회 D0 |
| 6 | α-mCTLA-4 항체 (9D9) + Ac10-G5-PNU (아이소타입 대조군) |
10 ㎎/㎏ + 0.25 ㎎/㎏ |
5 ㎖/㎏ | i.p. + i.v. |
D2 및 3-4일 간격 2회 추가 처리 + 1회 D0 |
| 11 | α-mCTLA-4 항체 (9D9)+ XBR1-402-G5-PNU |
10 ㎎/㎏ + 0.25 ㎎/㎏ |
5 ㎖/㎏ + 5 ㎖/㎏ |
i.p. + i.v. |
D2 및 3-4일 간격 2회 추가 처리 + 1회 D0 |
종양 부피를 종양 크기의 매주-2회 캘리퍼스 측정에 기초하여 측정하였다. 그룹 중간 종양 부피의 계산을 위해서 문제의 날에 살아있는 동물의 값을 고려하였다. 또한, 종양 크기로 인해 안락사시킨 동물의 종양 부피는 상기 부피가 상기 그룹 평균/중간 종양 부피를 증가시킨 한, 이전 관찰치 적용 분석법(LOCF)을 사용하여 차기에 이월하였다.
도 4는 개별 마우스에 대한 종양 부피 전개뿐만 아니라, 중간 종양 부피 전개를 나타낸다. (A) 비히클 대조군, (B) Ac10-G5-PNU 아이소타입 대조군, (C) XBR1-402-G5-PNU, (D) Ac10-G5-PNU 아이소타입 대조군 + 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9, (E) XBR1-402-G5-PNU + 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9로 처리된 개별 마우스에 대한 종양 부피 전개. (F) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(LOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 XBR1-402-G5-PNU, (G) 하기의 그룹들에 대한 중간 그룹 종양 부피 전개(이전 관찰치 적용 분석법(LOCF) 적용): 비히클 대조군, Acl0-G5-PNU 아이소타입 대조군 및 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9, 및 XBR1-402-G5-PNU 및 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9.
도면의 결과에 의해 도시된 바와 같이, XBR1-402-G5-PNU 및 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9의 조합은 ADC 0.25 ㎎/㎏ 단독 개별 처리에 비해 향상된 항-종양 반응을 제공한다. 더욱이, 패널 D는 비히클(패널 A) 및 아이소타입 대조군(패널 B)에 비해, 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9가 약간의 항-종양 효능을 나타냄을 보이며, 이는 EMT-6-ROR1 종양 모델을 뜨거운 종양 모델로서 특성화할 수 있음을 지지한다.
추가로, 그룹 11에서 생존한 모든 마우스(그러나 다른 그룹에서는 아닌? - 입증?이 중요할 수도 있다)는 선행 주사(도시 안 됨) 없이 유방 지방패드에 이식된, 1x106 EMT-6-ROR1 클론 14 종양 세포에 의해 재-공격시(102일째) 종양 성장으로부터 보호되었으며, 이는 ADC와 관문 억제제와의 병용에서만 보호성 항-종양 면역반응이 생성되었음을 가리킨다.
실시예 5. 인간 ROR1을 안정하게 발현하는 CT-26 및 B16-F10 세포의 생성
쥐 CT-26 결장암종 세포 및 B16-F10("B16") 흑색종 세포(둘 다 ATCC로부터)를 37℃ 및 5% CO2에서 10%(v/v) 송아지 태아 혈청(FCS), 100 IU/㎖의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept, Allschwill, Switzerland)을 갖는 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 하기와 같이 전위에 의해 ROR1을 과발현하도록 조작하였다: 세포를 에펜도르프 581 또는 원심분리기에서 원심분리시키고(6분, 290 x g, 4℃) RPMI 배지에 재현탁하였다(5x106 세포/㎖). 이어서 400 ㎕의 세포 현탁액을 13.3 pg의 수송가능한 벡터 pPB-PGK-Puro-ROR1(퓨로마이신-내성 유전자와 함께 완전길이 ROR1(NP_005003.2)의 공-발현 유도) 및 6.6 pg의 트랜스포사제-함유 벡터 pcDNA3.1_hy_mPB를 함유하는 400 ㎕의 RPMI에 가하였다. DNA/CT-26 또는 B16 세포 혼합물을 일렉트로포레이션 큐벳(0.4 ㎝-끊김, 165-2088, BioRad, Cressier, Switzerland)으로 옮기고 전기용량 증량기를 갖는 Biorad Gene Pulser II를 사용하여 300 V 및 950 pF에서 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, 세포를 실온에서 5-10분간 배양하였다. 배양에 이어서, 세포를 290xg에서 6분간 원심분리시키고, 1회 세척하고, 후속적으로 5% CO2 분위기의 가습 배양기에서 37℃에서 배양에 앞서 RPMI 완전배지에 재현탁시켰다. 일렉트로포레이션 후 하루째에, 3 pg/㎖ 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, P8833)을 가함으로써 인간 ROR1을 안정하게 발현하는 세포 풀을 선택하였다.
ROR1을 발현하는 CT-26의 단세포 클론은 항생제-선택된 세포로부터 유래되었다. 간단히, 트립신처리에 이어서, 106 세포를 FACS 튜브에서 원심분리시키고; 수득된 펠릿을 완충제(2%(v/v) FCS가 있는 PBS)에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 30분간(4℃, 최종 농도 2 pg/㎖) 항-ROR1 항체 XBR1-402와 배양한 다음, 원심분리시키고 세척하였다. 이어서 세포를 이전과 같이 재현탁하고 암실(30분, 4℃)에서 1:250 희석으로 항-인간 IgG 항체(Fc 감마-특이성) PE(eBioscience, Vienna, Austria, 12-4998-82)와 배양하고, 완충제 중에서 1회 세척하고, FACSAria II 장비(BD Biosciences, San Jose, USA)를 사용하여 FACS에 의해 항원-발현 세포를 단세포 분류할 때까지 빙상에서 유지시켰다. 도 5(A)는 상기 조작된 CT-26 클론 3의 FACS 염색 결과를 도시한다. 하기 실험에 사용된 B16 풀상의 ROR1의 발현을 또한 FACS에 의해 측정하였다(도 5(B)).
실시예 6. 항-ROR1 ADC 및 면역관문 억제제와의 조합으로 처리된 hROR1-과발현 CT26 결장암종 마우스 모델
CT26은 마우스 모델에서 더운 내지 뜨거운 종양을 확립시키며, 이는 상기가 충분히 높게 투여될 때 면역관문 억제제에 반응함을 의미한다(Mosely, S. et al., 2017). 실험 그룹은 표 4에 따라, 각각 8마리의 6-8주된 암컷 BALB/c 마우스를 함유하였다. 100 pl PBS 중의 1x106 CT-26-ROR1 클론 3 종양 세포(실시예 5로부터)를 각 마우스의 옆구리에 단측 이식하였다. 대략 30-100 ㎣(캘리퍼스에 의해)의 평균 종양 부피에 도달하면, 0일째에(D0) 마우스를 종양 크기에 따라 무작위분류하였다. 이어서 마우스를 표 4에 따라 처리하고 42일 동안 또는 종양이 1500 ㎣(캘리퍼스에 의해)에 도달할 때까지 주당 3회 모니터링하였다. RPMI-14(BioXcell, West Lebanon, New Hampshire, U.S.)는 마우스 PD-1의 억제제이며 PBS 중에서 제형화되었다. 상기 면역관문 억제제를 앞서 Oncotest(데이터 도시 안 됨)에 의해 측정된 바와 같이, 단독요법으로서 이의 유효 용량 미만으로 투여하였다.
| 그룹(그룹 크기) | 처리 농도 | 적용 | ||
| 경로 | 무작위분류후 계획 | |||
| 1 | 비히클 대조군 | - | i.v. i.p. |
1회 D0 D0, D4, D8 |
| 2 | Ac10-G3-PNU (아이소타입) | 4 ㎎/㎏ | i.v. | 1회 D0 |
| 3 | huXBR1-402-17-G3-PNU | 4 ㎎/㎏ | i.v. | 1회 D0 |
| 4 | Ac10-G3-PNU + α-mPD-1 항체 (RPM1-14) |
4 ㎎/㎏ + 5 ㎎/㎏ |
i.v. + i.p. |
1회 D0 + D0, D4, D8 |
| 5 | huXBR1-402-17-G3-PNU+ α-mPD-1 항체 (RPM1-14) |
4 ㎎/㎏ + 5 ㎎/㎏ |
i.v. + i.p. |
1회 D0 + D0, D4, D8 |
도 6은 각 그룹에서 개별 마우스에 대한 종양 부피 전개를 나타낸다: (A) 그룹 1의 비히클 대조군(처리되지 않은), (B) 그룹 2의 아이소타입 대조군, (C) 그룹 3의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17-G3-PNU, (D) 그룹 4의 아이소타입 대조군 + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체, (E) 그룹 7의 항-ROR1 ADC huXBR1-402-17-G3-PNU + 면역관문 억제제 항-마우스 PD-1 항체. 표적화된-ADC가 패널 C에 도시된 바와 같이, 단독요법으로서 완전 반응에 필요한 것보다 현저하게 더 낮은 용량으로 투여되었음이 강조된다. 결과는 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 강한 상승작용을 암시한다.
실시예 7. 항-ROR1 ADC 및 면역관문 억제제와의 조합으로 처리된 hROR1-과발현 B16 흑색종 마우스 모델
B16은 마우스 모델에서 불충분하게 면역원성인(차가운) 종양을 확립시키며(Celik, C. et al. 1983), 이는 상기가 합리적인 범위내로, 즉 약 50 내지 100 pg/마우스 이하로 투여될 때 면역관문 억제제에 반응하지 않음을 의미한다(Grosso, J. et al., 2013). 실험 그룹은 표 7에 따라, 각각 10마리의 8-9주된 암컷 BL6/6NRj를 함유하였다. 100 ㎕의 행크스 균형 염 용액(HBSS, Thermo Fischer) 중의 2x105 B16-ROR1 종양 세포(실시예 5로부터)를 0일째(D0)에 각 마우스내에 i.v. 주사하였다. 마우스를 간단한 무작위 할당에 의해 그룹으로 무작위분류하고 12-19주에 걸쳐 주당 5일 모니터링하면서 표 5에 따라 처리하였다.
| 그룹(그룹 크기) | 처리 농도 | 적용 | ||
| 경로 | 무작위분류후 계획 | |||
| 1 | 비히클 대조군 | - | i.v. i.p. |
1회 D1 D1, D5, D9 |
| 2 | huXBR1-402-17-G2-PNU | 4 ㎎/㎏ | i.v. | 1회 D1 |
| 3 | α-mCTLA-4 항체 (9D9) | 10 ㎎/㎏ | i.p. | D1, D5, D9 |
| 4 | huXBR1-402-17-G2-PNU+ αmCTLA-4 항체 (9D9) |
4 ㎎/㎏ + 10 ㎎/㎏ |
i.v. i.p. |
1회 D1 + D1, D5, D9 |
최종 모니터일에, 마우스를 CO2에 의해 안락사시킨 다음, 전체-폐를 수집하여 부앙액(Bouin's solution)(Labforce Bio-Optica)에 고정시켰다. 각각의 폐 표면(B16-ROR1 콜로니를 나타냄)상의 실험에 의해 유도된 전이(Saxena M. et al, 2013)를 육안으로 카운트하고 각각을 맹검 조건하에 3개의 빈(bin)(직경 <1 ㎜, 1-2 ㎜, >2 ㎜) 중 하나에 대한 배정에 대해 평가하였다. 이어서 각 폐상의 콜로니의 부피를 하기 식에 따라 측정하였다(각각의 콜로니를 구에 가까운 것으로서 간주하여):
콜로니 부피(㎣) = 수(직경<1 ㎜를 갖는 스폿(spot)) x 0.004 ㎣ + 수(직경 1-2 ㎜를 갖는 스폿) x 0.21 ㎣ + 수(직경>2 ㎜를 갖는 스폿) x 0.485 ㎣
통계 분석을 GraphPad Prism 및 평균의 독립표본 T-검정으로 수행하였다. <0.05의 p-값은 통계학적 유의수준(*)으로서 간주되고, >0.5의 p-값은 통계학적 유의수준이 아닌 것(n.s.)으로서 간주되었다.
도 7은 표 5의 상이한 처리 그룹의 콜로니 부피를 나타낸다. 상기 결과는 면역관문 억제제의 효과가 그다지 현저하지 않은 불충분하게 면역원성인("차가운") 종양에서, 평가된 면역관문 억제제와 표적화된 PNU 유도체-포함 ADC간의 강한 상승작용을 암시한다.
실시예 8. 항-ROR1 ADC로 처리된 hROR1-과발현 B16 흑색종 마우스 모델
실험 그룹은 표 6에 따라, 8-9주된 암컷 BL6/NRj를 함유하였다. 100 ㎕의 행크스 균형 염 용액(HBSS, Thermo Fischer) 중의 106 B16-ROR1 종양 세포(실시예 5로부터)를 각 마우스의 옆구리에 단측 이식하였다. 대략 250 ㎣(캘리퍼스에 의해)의 평균 종양 부피에 도달하면, 0일째에(D0) 마우스를 표 6에 따라, 종양 크기에 따라 그룹으로 무작위분류하였다. 이어서 마우스를 표 6에 따라 처리하고 투여후 24-시간째에 안락사시킨 다음 종양을 추출하였다.
| 그룹(그룹 크기) | 처리 농도 | 그룹 중 마우스 | 투여 경로 | 처리 스케줄 | |
| 1 | 처리되지 않은 대조군 | - | 1 | - | - |
| 2 | huXBR1-402-17-G2-PNU | 4 ㎎/㎏ | 3 | i.v. | D0 |
종양을 최적 절삭 온도 화합물(oct, Fischer Scientific으로부터)에서 급속-동결시켰다. 극저온-절편을 상업적인 1차 항-마우스 CD4 및 항-마우스 CD8 항체(각각 GK1.5 BioLegend 100402, 및 53-6.7 BioLegend 100702)를 사용하여 염색하였다. 검출을 항-래트 항체(AlexaFluor488, Invitrogen A21208)를 사용하여 수행하였다.
도 8은 (A) 처리되지 않은 대조군 마우스, 및 (B) 표 6에 따른 ADC(1회, 4 ㎎/㎏)로 처리된 3마리의 마우스로부터의 hROR1(인간 ROR1)-과발현 B16 종양 극저온-절편의 전형적인 CD4 및 CD8-염색 상을 도시한다. 도 8(A)에 따르면, B16 종양은 차가운 종양으로서 B16 종양의 상태를 유지하면서 자연적으로 낮은 수준의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유한다. 도 8(B)는 본 발명에 따른 ADC 처리가 종양내 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수를 증가시킴을 도시한다.
추가로, hROR1(인간 ROR1)-과발현 CT-26 및 B-16 종양을 기계적으로 및 효소적으로 절단하고, 생육성 세포 및 면역세포 마커에 대한 FACS 염색을 수행하여 T-세포 집단을 확인하였다. 표 7에 보고된 FACS 염색 계획이 633 또는 635 ㎚ 여기 염색 시약(ThermoFischer)에 대해서 LIVE/DEADTM 고정성 근적외선 죽은 세포 염색 키트와 함께 사용되었다.
| 항체 | 표지 | 표적 | 클론 | Cat. # | 회사 |
| 항-마우스 CD45 | PE-CF592 | CD45 | 30-F11 | 562420 | BD Biosciences |
| 항-마우스 CD3ε | PE/Cy7 | CD3 | 145-2C11 | 100319 | Biolegend |
| 항-마우스 CD4 | PE | CD4 | RM4-4 | 116005 | Biolegend |
| 항-마우스 CD8a | Alexa Fluor 488 | CD8 | 53-6.7 | 100726 | Biolegend |
| 항-마우스 CD137 | APC | 4-1BB | 17B5 | 106109 | Biolegend |
| 항-마우스 Ki-67 | PerCP/Cy5.5 | Ki67 | 16A8 | 652423 | ThermoFisher |
도 9는 2개의 종양 모델(처리되지 않음)에서 CD4(패널 A) 및 CD8(패널 B) 양성 T-세포 집단의 활성화 상태를 도시하며, 이는 hROR1(인간 ROR1)-과발현 B-16 종양 모델의 차가운 성질을 입증한다.
참고문헌
서열
하기의 서열은 본원의 개시내용의 일부를 형성한다. WIPO ST 25 호환성 전자 서열 목록을 또한 본원과 함께 제공한다. 의심을 피하기 위해서, 하기의 표 및 전자 서열 목록에서 서열간에 불일치가 존재하는 경우 본 표의 서열이 정확한 것으로 여겨질 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> NBE Therapeutics
<120> Binding protein-toxin conjugates comprising anthracyclines, and
use thereof in immune-oncological applications
<130> ND40832
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> XBR1-402 HC amino acid sequence
<400> 1
Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 212
<212> PRT
<213> XBR1-402 LC amino acid sequence
<400> 2
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20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 2A2 LC amino acid sequence
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 1, with X being any amino acid
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 7
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 2, with X being any amino acid
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 8
Leu Pro Xaa Ala Gly
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> recognition sequence for Staphylococcus aureus sortase A or engineered sortase A 4S-9 from Staphylococcus aureu
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 9
Leu Pro Xaa Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> recognition sequence for engineered sortase A 2A-9 from Staphylococcus aureus, with X being any amino acid
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 10
Leu Ala Xaa Thr Gly
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes sortase A recognition sequence, with X being any amino acid
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 11
Leu Pro Xaa Thr Ala
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus sortase recognition sequence
<400> 12
Asn Pro Gln Thr Asn
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 1, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 13
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase A recognition sequence 2, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 14
Leu Pro Xaa Ala Gly
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from recognition sequence for Staphylococcus aureus sortase A or engineered sortase A 4S-9 from Staphylococcus aureus, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 15
Leu Pro Xaa Ser Gly
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from recognition sequence for engineered sortase A 2A-9 from Staphylococcus aureus, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 16
Leu Ala Xaa Thr Gly
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from Streptococcus pyogenes sortase A recognition sequence, with X being any amino acid and n ? 1 and ? 21
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any amino acid
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is G or A
<400> 17
Leu Pro Xaa Thr Xaa
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Linker derived from Staphylococcus aureus sortase recognition sequence, with n ? 1 and ? 21
<400> 18
Asn Pro Gln Thr Gly
1 5
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> leader sequence
<400> 19
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 20
<211> 447
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 HC amino acid sequence
<400> 20
Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 21
<211> 212
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 LC amino acid sequence
<400> 21
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser
210
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> XBR1-402 HCDR1
<400> 22
Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> XBR1-402 HCDR2
<400> 23
Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> XBR1-402 HCDR3
<400> 24
Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> XBR1-402 LCDR1
<400> 25
Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> XBR1-402 LCDR2
<400> 26
Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> XBR1-402 LCDR3
<400> 27
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Ac10 HCDR1
<400> 28
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr
1 5
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> Ac10 HCDR2
<400> 29
Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Ac10 HCDR3
<400> 30
Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Ac10 LCDR1
<400> 31
Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Ac10 LCDR2
<400> 32
Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Ac10 LCDR3
<400> 33
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 2A2 HCDR1
<400> 34
Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 2A2 HCDR2
<400> 35
Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 2A2 HCDR3
<400> 36
Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 2A2 LCDR1
<400> 37
Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 2A2 LCDR2
<400> 38
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 2A2 LCDR3
<400> 39
Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 HCDR1
<400> 40
Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 HCDR2
<400> 41
Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
1 5 10 15
Ala
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 HCDR3
<400> 42
Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu
1 5 10
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 LCDR1
<400> 43
Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His
1 5
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 LCDR2
<400> 44
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> huXBR1-402-17 LCDR3
<400> 45
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr
1 5
Claims (29)
- 차가운 종양(cold tumor)임을 특징으로 하는
·신생물 질병(neoplastic disease)을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한, 결합 단백질에 접합된(conjugated), 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티(anthracycline toxin moiety)를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체. - 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병의 치료 또는 예방 방법으로서, 환자에게 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체를 투여함을 포함하는 방법.
- 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한,
(i) 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및
(ii) 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)
의 조합물(combination)로서, 상기 결합 단백질-독소 접합체 및 상기 면역관문 억제제가 환자에게 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는 조합물. - 차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병의 치료 또는 예방 방법으로서, 환자에게
(i) 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체, 및
(ii) 면역관문 억제제
를 투여함을 포함하며,
결합 단백질-독소 접합체 및 면역관문 억제제가 환자에게 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는 방법. - 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한(약제의 제조를 위한) 면역관문 억제제와 함께 사용하기 위한, 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체. - 차가운 종양임을 특징으로 하는
·신생물 질병을 앓고 있고,
·신생물 질병이 발병할 위험이 있고, 및/또는
·신생물 질병으로 진단된,
환자의 치료에 사용하기 위한(약제의 제조를 위한), 결합 단백질에 접합된, 하나 이상의 안트라사이클린 독소 모이어티를 포함하는 결합 단백질-독소 접합체와 함께 사용하기 위한 면역관문 억제제(ICI). - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병이, 면역관문 억제제 치료에 불응성(refractory), 내성이거나 또는 불응성, 내성이었거나, 또는 면역관문 억제제 치료후 재발성이거나 또는 재발성이었던 종양인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병이
·흑색종,
·결장직장암 또는 종양,
·췌장암 또는 종양,
·교모세포종,
·난소암 또는 종양, 및/또는
·전립선암 또는 종양
으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이
·ROR1
·CS1
·HER2
·메소텔린(MN), 및/또는
·ROR2
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 표적(target)에 결합하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
차가운 종양임을 특징으로 하는 신생물 질병이 <1의 면역점수(immunoscore)를 가짐을 특징으로 하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 안트라사이클린 독소 모이어티가 하기 화학식 i를 갖는 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI:
화학식 i
상기 독소는 링커(linker)를 통해 결합 단백질에 물결선(wavy line)으로 접합된다. - 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
면역관문 억제제가 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI:
·항 PD-1
·항 PD-L1
·항 PD-L2
·항 CTLA-4
·항 LAG3
·항 CD40 또는 항 CD40L
·항 TIM3,
·항 OX40 또는 항 OX40L(CD134/CD134L),
·항 CDH2
·항 CD155
·항 B7-H3
·항 B7-H4
·항 ID01
·항 ID02
·항 TD02
·항 TIGIT
·항 GITR, 및/또는
·항 갈렉틴-9. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
접합체가 물결선으로 링커 구조 X - Li - L2 - L3 - Y를 포함하며, 여기에서 Li - L3이 링커를 나타내고, Li - L3 중 2개는 필수적이며 X 및 Y가 추가로 각각 하나 이상의 임의의 링커를 나타내는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제13항에 있어서,
링커 구조가 L2로서, 상기 안트라사이클린 유도체에 직접 또는 또 다른 링커 Li에 의해 커플링된(coupled) 올리고-글리신 펩티드(Gly)n를 포함하고, 여기에서 n이 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제14항에 있어서,
올리고-글리신 펩티드(Gly)n가 알킬렌디아미노 링커(EDA)(Li로서 표시됨)에 의해 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬렌디아미노 링커가 제1 아미드 결합에 의해 안트라사이클린 유도체에 접합되는 반면, 제2 아미드 결합에 의해서는 올리고-글리신 펩티드의 카복시 말단에 접합되고, 상기 알킬렌디아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체가 하기 화학식 ii를 갖는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI:
화학식 ii
여기에서 물결선은 화학식 i의 안트라사이클린 유도체에 대한 연결을 나타내고, m은 ≥1 내지 ≤11의 정수이고, n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
올리고-글리신 펩티드(Gly)n가 직접 또는 또 다른 링커 Li에 의해 화학식 ii의 안트라사이클린 유도체의 고리 A에 커플링되는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제14항에 있어서,
올리고-글리신 펩티드(Gly)n가 알킬렌아미노 링커(EA)(Li로서 표시됨)에 의해 화학식 ii의 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬렌아미노 링커가 아미드 결합에 의해 상기 올리고-글리신 펩티드의 카복시 말단에 접합되고, 상기 알킬렌아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체가 하기 화학식 iii를 갖는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI:
화학식 iii
여기에서 물결선은 화학식 ii의 안트라사이클린 유도체에 대한 연결을 나타내고, m은 ≥1 내지 ≤11의 정수이고, n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다. - 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
링커 구조 L3가 솔타제 효소 인식 모티프(sortase enzyme recognition motif)의 특정한 절단으로부터 생성되는 펩티드 모티프를 포함하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제18항에 있어서,
솔타제 효소 인식 모티프가 하기의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하며: LPXTG, LPXAG, LPXSG, LAXTG, LPXTA 또는 NPQTN, 이때 X는 임의의 고려 가능한 아미노산 서열인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
생성되는 링커가 하기의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 가지며: LPXTGn-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, -LAXTG,,-, -LPXTG,,-, -LPXTA,,- 또는 -NPQTG,,-, 이때 G,,는 올리고- 또는 폴리글리신이고, 이때 n은 ≥1 내지 ≤21의 정수이며, An은 올리고- 또는 폴리알라닌이고, 이때 n은 ≥1 내지 ≤21, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이며, X는 임의의 고려 가능한 아미노산 서열인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
안트라사이클린 유도체가 하나 이상의 링커에 의해 결합 단백질의 카복시 말단, 또는 적어도 하나의 도메인(domain) 또는 이의 서브유닛(subunit)의 카복시 말단에 접합되는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이 아미드 결합에 의해 올리고-글리신 펩티드(Gly)n의 아미노 말단에 접합되는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이 항체, 항체-기반 결합 단백질, 표적 결합 능력을 보유하는 변형된 항체 포맷(modified antibody format), 표적 결합 능력을 보유하는 항체 유도체 또는 단편, 대안의 스캐폴드(scaffold) 및/또는 항체 모방물질(mimetic)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제23항에 있어서,
결합 단백질이
a) 하기의 서열번호 쌍: 1 및 2; 3 및 4, 5 및 6 및/또는 20 및 21에 제시된 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열 쌍 중에 포함된 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함하고
b) 하기의 서열번호를 (HCDR1; HCDR2; HCDR3; LCDR1; LCDR2 및 LCDR3)의 순서로 포함하는 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함하며:
·22, 23, 24, 25, 26, 및 27,
·28, 29, 30, 31, 32, 및 33,
·34, 35, 36, 37, 38, 및 39, 및/또는
·40, 41, 42, 43, 44, 및 45
c) b)의 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 단 CDR 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대하여 3개 이하의 아미노산 치환을 갖고, 및/또는
d) b) 또는 c)의 중쇄/경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 단 CDR 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대해 ≥66%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는
항체이며,
여기에서 CDR이 충분한 결합 친화성으로 ROR1에 결합할 수 있도록 적합한 단백질 골격(protein framework) 내에 포매(embedding)되는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제23항 또는 제24항에 있어서,
결합 단백질이
a) 하기의 서열번호 쌍: 1 및 2; 3 및 4, 5 및 6 및/또는 20 및 21에 제시된 중쇄/경쇄 가변 도메인(HCVD/LCVD) 쌍
b) a)의 중쇄/경쇄 가변 도메인(HCVD/LCVD) 쌍, 단
·HCVD는 각각의 서열번호에 대해 ≥80%의 서열 동일성을 갖고, 및/또는
·LCVD는 각각의 서열번호에 대해 ≥80%의 서열 동일성을 가지며,
c) a) 또는 b)의 중쇄/경쇄 가변 도메인(VD) 쌍을 포함하며, 단 HCVD 또는 LCVD 중 적어도 하나는 각각의 서열번호에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는
항체이며,
상기 단백질 결합제가 여전히 충분한 결합 친화성으로 ROR1에 결합할 수 있는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제24항 또는 제25항에 있어서,
결합 단백질이 보존적 아미노산 치환인 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이 제24항 또는 제25항에 따른 항체의 ROR1에 대한 표적 결합 친화성에 비해 적어도 50%의 ROR1에 대한 표적 결합 친화성을 갖는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이 제24항 또는 제25항에 따른 항체와 ROR1 결합에 대해 경쟁하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
결합 단백질이 제24항 또는 제25항에 따른 항체와 본질적으로 동일한, 또는 동일한, ROR1 상의 영역에 결합하는 접합체, 방법, 조합물 또는 ICI.
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