BR112021006269A2 - conjugados de proteína-toxina de ligação compreendendo antraciclinas e uso dos mesmos em aplicações imuno-oncológicas - Google Patents

Abstract

CONJUGADOS DE PROTEÍNA-TOXINA DE LIGAÇÃO COMPREENDENDO ANTRACICLINAS E USO DOS MESMOS EM APLICAÇÕES IMUNO-ONCOLÓGICAS. A presente invenção refere-se a conjugados de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina e o uso dos mesmos em aplicações imuno-oncológicas.

Description

CONJUGADOS DE PROTEÍNA-TOXINA DE LIGAÇÃO COMPREENDENDO ANTRACICLINAS E USO DOS MESMOS EM APLICAÇÕES IMUNO-ONCOLÓGICAS Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a conjugados de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina e o uso dos mesmos em aplicações imuno-oncológicas.

Antecedentes

[002] Os conjugados de proteína-toxina de ligação, com conjugados anticorpo- fármaco (ADC) como seus representantes mais proeminentes, tiveram um tremendo impacto na terapia de câncer, fornecendo novas abordagens terapêuticas para tipos de tumor, que até agora não podiam ser tratados.

[003] Por outro lado, a descoberta de pontos de controle imunológicos e o desenvolvimento de inibidores de ponto de controle imunológico, colocou novamente em foco o papel do sistema imunológico na terapia de câncer e formas de estimular o sistema imunológico ou de superar os pontos de controle imunológico que os respectivos tumores usam para autoproteção contra-ataques do sistema imunológico.

[004] Embora ambas as abordagens tenham sido discutidas com muito entusiasmo e tenham demonstrado progressos significativos no tratamento do câncer, também ficou claro que existem tipos de tumor que não podem ser tratados com essas novas abordagens.

[005] Foi demonstrado, por exemplo, que ADCs com toxinas particulares não são ativos contra tipos específicos de câncer, embora enfrente, por seu anticorpo, um antígeno específico do câncer. Também foi demonstrado que existem tipos de tumor onde os inibidores de ponto de controle imunológico não têm eficácia.

[006] É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer novas abordagens que tornam os tipos de tumor tratáveis que até agora não poderiam ser enfrentados pelas terapias existentes.

[007] É mais um objetivo da presente invenção para fornecer terapias combinadas que aumentam a atividade antitumoral das monoterapias correspondentes.

[008] Esses e outros objetivos são atendidos com métodos e meios de acordo com as reivindicações independentes da presente invenção. As reivindicações dependentes estão relacionadas a concretizações específicas.

Breve descrição da invenção

[009] A presente invenção fornece conjugados de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina e o uso dos mesmos em aplicações imuno-oncológicas. A invenção e as vantagens gerais de suas características serão discutidas em detalhes abaixo.

Descrição das figuras

[010] Figura 1. Estruturas químicas de derivado de PNU-159682 EDA-antraciclina modificado pentaglicina (G5-EDA-PNU ou G5-PNU) usado para a geração de ADCs conjugados especificamente ao local usados nos experimentos nesta invenção. G3-PNU e G2-PNU referem-se às mesmas estruturas, mas em que a pentaglicina é substituída por uma triglicina ou uma diglicina, respectivamente.

[011] Figura 2. Análise FACS para expressão de ROR1 humano expresso estavelmente em células cancerosas de mama EMT-6 de camundongo. O EMT-6-ROR1 clone 14 selecionado para estudos in vivo foi analisado por coloração FACS para expressão ROR1 com o clone 2A2 de anticorpo anti-ROR1 marcado com fluorescência. O controle negativo mostra uma coloração das mesmas células com um anticorpo de controle de isótipo compatível marcado com fluorescência.

[012] Figura 3. Titulação de dose de novo anti-ROR1 PNU-ADC, com base no anticorpo XBR1-402, com um único tratamento em diferentes níveis de dose (0,25; 0,5 e 1 mg/kg) em modelo de câncer de mama singênico ortotópico EMT-6-ROR1 (clone 14). (A) O crescimento de tumor dos tumores de mama transplantados ortotopicamente é monitorado nos diferentes grupos de tratamento ao longo do tempo, como indicado.

(B) curvas de crescimento de tumor em camundongos individuais dos grupos exibidos no painel (A).

[013] Figura 4. Evolução do volume de tumor em camundongos singênicos transplantados ortotopicamente com células cancerosas de mama EMT-6-ROR1 (clone 14), seja (A) com injeção de controle de veículo (PBS) ou com (B) administração única de 0,25 mg/kg com um PNU-ADC de controle de isótipo compatível compreendendo o anticorpo anti-CD30 brentuximabe, clone Ac10 ou (C) administração única de 0,25 mg/kg com anti-ROR1 PNU-ADC compreendendo novo anticorpo anti-ROR1 XBR1-402, que de acordo com a Fig. 3 foi determinado como sendo uma dose subótima para tratamento de tumores de mama EMT-6-ROR1 ortotópico em camundongos. Os painéis (D) e (E) mostram tratamentos de combinação com anticorpo inibidor de ponto de controle imunológico anti-CTLA4 9D9 com 0,25 mg/kg de ADC de controle de isótipo compatível Ac10 e 0,25 mg/kg do novo anti-ROR1 PNU ADC, como indicado. (F) Evolução do volume de tumor do grupo mediano (com aplicação da metodologia Last- Observation-Carried-Forward (LOCF)) para os seguintes grupos: controle de veículo, controle de isótipo Ac10-G5-PNU e XBR1-402-G5-PNU, (G) Evolução do volume de tumor do grupo mediano (com aplicação da metodologia Last-Observation-Carried-Forward (LOCF)) para os seguintes grupos: controle de veículo, controle de isótipo Ac10-G5-PNU e anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9 e XBR1-402-G5-PNU e anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9.

[014] Figura 5. Análise FACS para expressão de ROR1 humano estavelmente expresso em (A) células cancerosas de mama do camundongo CT-26 (clone 3) e (B) células cancerosas de melanoma de camundongo B16 (pool). O CT-26-ROR1 clone 3 e o B16- ROR1 pools selecionados para estudos in vivo foram analisados por coloração FACS para expressão de ROR1 com o clone de anticorpo anti-ROR1 marcado com fluorescência XBR1-402 (pico direito). O controle negativo mostra uma coloração das mesmas células com um anticorpo de controle de isótipo compatível marcado com fluorescência (pico esquerdo).

[015] Figura 6. Evolução do volume de tumor em camundongos transplantados com células de tumor CT-26-ROR1 clone 3 conforme o Exemplo 6: (A) controle de veículo

(não tratado) do grupo 1, (B) controle de isótipo do grupo 2, (C) anti-ROR1 ADC huXBR1- 402-17 do grupo 3, (D) controle de isótipo mais anticorpo inibidor de ponto de controle imunológico anti-PD-1 camundongo do grupo 4, (E) anti-ROR1 ADC huXBR1-402-17 mais anticorpo inibidor de ponto de controle imunológico anti-PD-1 camundongo do grupo

7. As inserções nos painéis A-E fornecem o número de camundongos nos quais o crescimento de tumor foi impedido em relação ao número de camundongos em cada grupo de tratamento. Os resultados sugerem uma cooperação entre o inibidor de ponto de controle imunológico avaliado e o ADC compreendendo derivado de PNU alvo.

[016] Figura 7. Volumes de colônia de superfície pulmonar em camundongos após i.v. aplicação de pools B16 com superexpressão de ROR1, conforme o Exemplo 7, após o tratamento com controle de veículo (“veículo”, grupo 1), anticorpo inibidor de ponto de controle imunológico anti-CTLA-4 camundongo (“CTLA-4”, grupo 2), anti-ROR1 ADC huXBR1-402-17 (“ADC”, grupo 3) e anti-ROR1 ADC huXBR1-402-17 mais anticorpo inibidor de ponto de controle imunológico anti-CTLA-4 camundongo (“ADC+CTLA-4”, grupo 4). Estes resultados sugerem, em um tumor pouco imunogênico, uma forte sinergia entre o inibidor de ponto de controle imunológico avaliado e o ADC compreendendo derivado de PNU alvo. “n.s.” significa diferença estatisticamente não significativa, “*” indica diferença estatisticamente significativa.

[017] Figura 8. Coloração de CD4 e CD8 de crio-seções de tumor B16 superexpressando hROR1 (ROR1 humano) de (A) um camundongo de controle não tratado e (B) os três camundongos tratados com ADCs (uma vez, a 4 mg/kg) conforme a invenção. De acordo com a Figura 8(A), os tumores B16 contêm naturalmente baixos níveis de células CD4+ e CD8+, de acordo com o estado dos tumores B16 como tumores frios. A Figura 8(B) mostra que o tratamento com o ADC, conforme a presente invenção, aumenta o número de células CD4+ e CD8+ dentro do tumor.

[018] Figura 9. Análise de coloração de 41BB (CD137), um marcador de ativação de células T, em linfócitos de infiltração em tumores CT-26 e B-16 com hROR1 (ROR1 humano) superexpresso. De acordo com a Figura 9, um número significativamente menor de linfócitos ativados T CD4+ (A) e CD8+ (B) pode ser observado dentro de tumores B-16 em comparação com tumores CT-26, de acordo com o estado dos tumores B-16 como tumores frios. “*” indica uma diferença estatisticamente significativa.

Descrição detalhada da invenção

[019] Antes que a invenção seja descrita em detalhes, deve-se entender que esta invenção não está limitada às partes componentes particulares dos dispositivos descritos ou às etapas de processo dos métodos descritos, como tais dispositivos e métodos podem variar. Entende-se também que a terminologia usada aqui é apenas para fins de descrição de concretizações particulares e não se destina a ser limitante. Deve-se notar que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes singulares e/ou plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Além disso, entende-se que, no caso de faixas de parâmetros serem dadas e que são delimitadas por valores numéricos, as faixas são consideradas para incluir esses valores de limitação.

[020] Entende-se ainda que as concretizações divulgadas aqui não devem ser entendidas como concretizações individuais que não se relacionariam entre si. As características discutidas com uma concretização devem ser divulgadas também em conexão com outras concretizações mostradas aqui. Se, em um caso, uma característica específica não for divulgada com uma concretização, mas com outra, o técnico no assunto entenderia que isso não significa necessariamente que a referida característica não deva ser divulgada com a referida outra concretização. O técnico no assunto entenderia que é a essência deste pedido divulgar a referida característica também para a outra concretização, mas que apenas para fins de clareza e para manter o relatório descritivo em um volume administrável, isso não foi feito.

[021] Além disso, o conteúdo dos documentos da técnica anterior aqui referidos é incorporado por referência. Isso se refere, particularmente, a documentos da técnica anterior que divulgam métodos padrão ou de rotina. Nesse caso, a incorporação por referência tem, principalmente, o objetivo de fornecer a divulgação suficiente e evitar longas repetições.

[022] De acordo com um aspecto da invenção, um conjugado de proteína-toxina de ligação é fornecido compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina conjugadas a uma proteína de ligação (para a fabricação de um medicamento) para o tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio.

[023] É importante enfatizar que a linguagem acima, com o termo “para a fabricação de um medicamento” entre parênteses, foi escolhida para cumprir diferentes requisitos nacionais/regionais quanto a reivindicações que cubram usos médicos de determinados compostos. A linguagem deve, em particular, abranger tanto o chamado formato de tipo suíço (onde o qualificador “para a fabricação de um medicamento” é necessário) quanto a respectiva linguagem de reivindicação sob o EPC2000 (onde o mesmo qualificador não é mais admissível).

[024] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio, o referido método compreendendo administrar a um paciente um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina.

[025] De acordo com outro aspecto da invenção, uma combinação de (i) um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, e (ii) um inibidor de ponto de controle imunológico é fornecido (para a fabricação de um medicamento) para o tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio,

em que o conjugado de proteína-toxina de ligação e o inibidor de ponto de controle imunológico são administrados ao paciente simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.

[026] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio, o referido método compreendendo administrar a um paciente (i) um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, e (ii) um inibidor de ponto de controle imunológico em que o conjugado de proteína-toxina de ligação e o inibidor de ponto de controle imunológico são administrados ao paciente simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.

[027] De acordo com outro aspecto da invenção, um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, é fornecido para uso em combinação com um inibidor de ponto de controle imunológico (para a fabricação de um medicamento) para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio.

[028] De acordo com outro aspecto da invenção, um inibidor de ponto de controle imunológico para uso em combinação com um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, (para a fabricação de um medicamento) para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio.

[029] Em uma concretização, o inibidor de ponto de controle imunológico modula uma proteína de ponto de controle imunológico positiva. Em outra concretização, o inibidor de ponto de controle imunológico modula uma proteína de ponto de controle imunológico negativa.

[030] Em uma concretização, o conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais toxinas de antraciclina é administrado antes do inibidor de ponto de controle imunológico.

[031] Em uma concretização, o paciente  está sofrendo de e/ou  diagnosticado com uma doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio.

[032] Um “tumor quente” define um tecido canceroso ou neoplásico que é caracterizado pela infiltração de células imunes. O nível de infiltração imunológica reflete se o sistema imunológico está reconhecendo e engajando o tumor. O termo “tumor quente” é usado como sinônimo do termo “tumor imunologicamente responsivo” aqui. Alternativamente, “tumores quentes” podem ser definidos como tumores que respondem ao tratamento por inibidores de ponto de controle imunológico.

[033] Como usado aqui, o termo “responder ao tratamento” significa uma redução estatisticamente significativa da carga ou crescimento do tumor em relação a um veículo comparável ou tratamento de controle de isótipo.

[034] Em uma concretização, o termo “tumor frio” define um tecido canceroso ou neoplásico que é caracterizado por infiltração de célula imune fraca ou ausente. O termo “tumor frio” é sinônimo de “tumor imunologicamente não responsivo" aqui.

[035] Uma referência para um tumor se qualificar como frio é o chamado Immunoscore, baseado na densidade de dois tipos de células T em uma amostra do tumor. Um exemplo é a densidade de duas populações de linfócitos (CD3/CD45RO,

CD3/CD8 ou CD8/CD45RO), tanto no núcleo do tumor (CT) quanto na margem invasiva (IM) dos tumores. O Immunoscore fornece uma pontuação que varia de Imunoscore 0 (I0), quando baixas densidades de ambos os tipos de células são encontradas em ambas as regiões, até Immunoscore 4 (I4), quando altas densidades são encontradas em ambas as regiões.

[036] Métodos para determinar o Immunoscore foram descritos, por exemplo, em Galon et al. 2014, Pages et al. 2009, Angell et al. 2013 e Galon et al. 2013, cujos conteúdos são incorporados por referência aqui.

[037] Até agora, tem sido discutido que tumores com baixo Immunoscore (“tumores frios”) não são muito responsivos ao tratamento com inibidores de ponto de controle imunológico, como anticorpos anti-PD-1, anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1, enquanto tumores com alto Immunoscore respondem a tal tratamento (ver Bu et al. 2016). Sem estar vinculado à teoria, a lógica por trás deste achado pode ser que, se não houver engajamento imunológico em um respectivo tumor, a inibição de um ponto de controle imunológico por um determinado inibidor não pode mudar nada para melhor.

[038] Os inventores perceberam que um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina antraciclina tem eficácia imunológica particular em tumores, resultando, inter alia, em uma proteção imunológica contra o re- desafio do tumor. Este achado surpreendente não pode ser antecipado a partir dos achados feitos com inibidores de ponto de controle imunológico, como anticorpos anti- PD-1, anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1. A lógica que se aplica a este último provavelmente não se aplica ao conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina.

[039] De acordo com uma concretização da invenção, a doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio é um tumor que é ou tem sido refratário, resistente ao tratamento com inibidor de ponto de controle imunológico ou recorrente após o tratamento com inibidor de ponto de controle imunológico.

[040] Como usado aqui, o termo “refratário” refere-se a um tumor que falha, ou falhou, em responder razoavelmente de uma maneira favorável em termos de encolhimento de tumor ou duração de estabilização ou encolhimento em resposta ao tratamento com um inibidor de ponto de controle imunológico.

[041] Como usado aqui, o termo “resistente” refere-se a um tumor que falha, ou falhou, em responder razoavelmente de uma maneira favorável em termos de encolhimento de tumor ou duração de estabilização ou encolhimento em resposta ao tratamento com um inibidor de ponto de controle imunológico por um tempo maior que 3 meses ou mais.

[042] Como usado aqui, o termo “recorrente” refere-se a um tumor que voltou após o tratamento com um inibidor de ponto de controle imunológico, geralmente após um período de tempo durante o qual o tumor não pôde ser detectado. O tumor pode voltar para o mesmo lugar ou para outro lugar no corpo de um sujeito.

[043] Tal tratamento com um inibidor de ponto de controle imunológico tem sido, preferencialmente, uma monoterapia.

[044] Tal tratamento com um inibidor de ponto de controle imunológico tem sido, preferencialmente, administrado em uma dosagem ou regime recomendado no rótulo do respectivo fármaco ou SOPC.

[045] De acordo com uma concretização da invenção, a doença neoplásica caracterizada como sendo um tumor frio é selecionada a partir do grupo consistindo em  melanoma  cânceres ou tumores colorretais,  cânceres ou tumores pancreáticos,  glioblastoma,  cânceres ou tumores de ovário e/ou  cânceres ou tumores de próstata.

[046] De acordo com uma concretização da invenção, a proteína de ligação se liga a pelo menos um alvo selecionado a partir do grupo consistindo em  ROR1  CS1  HER2

 Mesotelina (MN) e/ou  ROR2.

[047] Entre estes, ROR1 é um alvo preferido.

[048] Esses alvos e anticorpos contra os mesmos são descritos nas seguintes publicações  US2019112385A1 (Mesotelina)  US2019153092A1, WO2019016381 (ROR1)  WO2019030240A1 (CS-1),  US2018028682 (HER2) e  WO2019016392A1 (ROR2), cujos conteúdos são incorporados por referência aqui.

[049] Preferencialmente, os referidos alvos são de origem humana. Em particular, ROR1, quando mencionado aqui, significa, preferencialmente, ROR1 humano.

[050] Como usado aqui, o termo “inibidor de ponto de controle imunológico” refere- se a qualquer agente ou composto de ligação adequados para agir contra uma proteína de ponto de controle imunológico. Em particular, um “inibidor de ponto de controle imunológico” refere-se a qualquer agente ou composto de ligação adequado para modular a atividade de uma proteína de ponto de controle imunológico, a fim de apoiar a atividade do sistema imunológico e, notavelmente, a capacidade das células T de reconhecer células cancerosas e agir contra elas. As proteínas de ponto de controle imunológico podem ser positivas (ou seja, suportam atividade de células T e uma resposta imunológica) ou negativas (ou seja, limitam a atividade de células T e uma resposta imunológica). No caso de uma proteína de ponto de controle imunológico positiva, um inibidor de ponto de controle imunológico significa um agente ou composto de ligação adequado para promover a atividade desta proteína de ponto de controle imunológico. No caso de uma proteína de ponto de controle imunológico negativa, um inibidor de ponto de controle imunológico significa um agente ou composto de ligação adequado para inibir a atividade desta proteína de ponto de controle imunológico.

[051] Um ponto de controle imunológico é uma proteína que regula o sistema imunológico (Pardoll D.M. “The blockage of immune checkpoints in cancer immunotherapy”, Nature, 2012, Volume 12, p. 252-264) e é crucial para a autotolerância, que impede o sistema imunológico de atacar as células indiscriminadamente, preferencialmente selecionadas a partir do grupo como divulgado na tabela a seguir:

Tipo Alcunha Nome completo Uni Prot Proteína de ponto de controle imunológico positiva ou negativa PD-1 CD279 Proteína de morte celular programada Q15116 Negativo 1 CTLA-4 CD152 Proteína citotóxica associada ao P16410 Negativo linfócito T 4 PD-L1 CD274, B7 Ligante de morte celular programada 1 Q9NZQ7 Negativo Homolog 1 PD-L2 B7-DC, Ligante de morte celular programada 2 Q9BQ51 Negativo CD273 LAG3 CD223 Gene de ativação de linfócito 3 P18627 Negativo CD40 TNFRSF5 Membro da superfamília do receptor P25942 Positivo de fator de necrose tumoral 5 CD40L CD154 Ligante CD154 P29965 Positivo TIM3 HAVCR2 Receptor celular do vírus hepatite A 2 Q8TDQ0 Negativo OX40 TNFRSF4, Membro da superfamília do receptor P43489 Positivo CD134 de fator de necrose tumoral 4 OX40L Ligante para CD134L P23510 Positivo CD112 PVRL2, Relacionado ao receptor de poliovírus Q92692 nectina-2 2 CD155 Receptor de poliovírus P15151 Negativo B7-H3 CD276 Q5ZPR3 Negativo B7-H4 VTCN1 Inibidor de ativação de células T Q7Z7D3 Positivo contendo domínio V-set 1 IDO1 Indolamina-2,3-dioxigenase 1 P14902 IDO2 Indolamina-2,3-dioxigenase 2 Q6ZQW0 TDO2 Triptofano 2,3-dioxigenase P48775 TIGIT WUCAM Imunorreceptor de células T com Q495A1 Negativo Vstm3 domínios Ig e ITIM Galectina-9 O00182 Negativo GITR Receptor de fator de necrose tumoral Q9Y5U5 Positivo induzida por glicocorticoide GITRL Ligante do receptor do fator de Q9UNG2 Positivo necrose tumoral induzido por glicocorticoide

[052] Por exemplo, a proteína de ponto de controle PD-1 expressa na superfície das células T age para evitar que essas células T ataquem outras células do corpo. Quando a célula T PD-1 se liga ao PD-L1 na superfície de uma célula, a célula T não desencadeará uma resposta imunológica contra essa célula. Certas células cancerosas expressam altos níveis de PD-L1, o que as ajuda a evitar ataques do sistema imunológico. Assim, os anticorpos que se ligam ao PD-1 ou PD-L1 e, de acordo com a inibição de sua ligação mútua servem para promover uma resposta imunológica contra células cancerosas. O CTLA-4 é outra proteína de ponto de controle imunológico negativa expressa em células T.

[053] De acordo com um grupo de concretizações, a doença neoplásica é caracterizada como sendo um tumor frio caracterizado como tendo um Immunoscore de I < 1.

[054] O Immunoscore é um método para estimar o prognóstico de pacientes com câncer, baseado nas células imunes que se infiltram no câncer e o cercam. O Imunoscore foi validado internacionalmente em câncer colorretal. É baseado nos achados de Galon et al (2006), que revelaram uma associação positiva de células T citotóxicas e memória com a sobrevivência de pacientes com câncer colorretal.

[055] O Immunoscore incorpora os efeitos da resposta imunológica do hospedeiro na classificação do câncer e melhora a precisão prognóstica. Ele mede a densidade de duas populações de linfócitos T (CD3/CD8, CD3/CD45RO ou CD8/CD45RO) no centro e na periferia do tumor. O Immunoscore fornece uma pontuação que varia de 0 (I0), quando baixas densidades de ambos os tipos de células são encontradas em ambas as regiões, até o Immunoscore 4 (I4), quando altas densidades são encontradas em ambas as regiões. O Immunoscore não mede como as células imunes da periferia do tumor estão organizadas ou a quantidade de células B, estruturas linfoides terciárias e centros germinativos. Todos eles têm papéis importantes na resposta imunológica a cânceres colorretais e outros.

[056] Em uma concretização, o tumor frio é um tumor com um Immunoscore de I0 ou I1 e, preferencialmente, é um tumor com um Immunoscore de I1.

[057] Em outra concretização, o termo “tumor frio” define um tecido canceroso ou neoplásico que é caracterizado por uma falta ou insuficiência de infiltração de células imunes. O nível de infiltração imunológica reflete se o sistema imunológico está reconhecendo o tumor.

[058] Em outra concretização, um tumor frio é um tumor que não responde a um inibidor de ponto de controle imunológico quando o referido inibidor de ponto de controle imunológico é dosado in vivo como uma monoterapia. Nesta concretização e em relação a um modelo de camundongo imunocompetente, um tumor frio é um tumor que, uma vez estabelecido no camundongo, não responde significativamente (em relação a um grupo de controle de veículo) a um inibidor de ponto de controle imunológico dosado como uma monoterapia em até 10 mg/kg, ou até 20 mg/kg, ou até a dose máxima tolerada (MTD) nesse modelo de camundongo. Em um humano, um tumor frio é, em outra concretização, um tumor que não responde significativamente a um inibidor de ponto de controle imunológico dosado de acordo com o rótulo do inibidor de ponto de controle imunológico, por exemplo, como uma monoterapia de até 10 mg/kg, por exemplo, a 1 mg/kg, a 2 mg/kg, a 3mg/kg, ou a 200 ou 240 mg, opcionalmente com dosagem a cada 2 a 3 semanas.

[059] Em outra concretização, e em relação a tumores sólidos humanos, um tumor frio pode ser definido em relação aos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) como publicados em fevereiro de 2000 (Therasse P. et al., “New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors”, Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 3, 2 de fevereiro de 2000) e atualizado em 2009 (Eisenhauer E.A. et al., “New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)”, European Journal of Cancer, Volume 45, Issue 2, 228– 247). Nesse contexto, em outra concretização, um tumor frio é um tumor que está associado com menos de uma resposta parcial (“PR”; ou seja, um tumor que é progressivo (“PD”, doença progressiva) ou permanece estável (“SD”, doença estável) após tratamento com um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico dosados de acordo com as instruções do rótulo do inibidor de ponto de controle imunológico. Em outra concretização, um tumor frio é um tumor que está associado com menos de uma resposta parcial (“PR”; ou seja, um tumor que é progressivo (“PD”, doença progressiva) ou permanece estável (“SD”, doença estável) após tratamento com um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico dosados ao longo de pelo menos 6 semanas, preferencialmente pelo menos 8 semanas, mais preferencialmente pelo menos 12 semanas. Em outra concretização, um tumor frio é um tumor de câncer de mama que é progressivo após a terapia anti-PD-L1.

[060] Em outra concretização, um tumor frio é um tumor que está associado à doença progressiva (“PD”) após pelo menos 6 semanas, preferencialmente após pelo menos 8 semanas, mais preferencialmente após pelo menos 12 semanas de um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico dosados de acordo com as instruções do rótulo do inibidor de ponto de controle imunológico.

[061] Em outra concretização, um tumor frio é um tumor que se torna não responsivo a um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico, ou seja, tumores que anteriormente respondiam ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico, mas se tornam não responsivos.

[062] Em outra concretização, um tumor frio também pode ser definido como um tumor que recidiva (ou seja, sofre uma diminuição da resposta ao tratamento) após resposta inicial a um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico, onde estes últimos são dosados de acordo com as instruções do rótulo do inibidor de ponto de controle imunológico.

[063] Em outra concretização, um tumor frio é um tumor que foi classificado como um tumor frio pelos médicos. Exemplos particulares, não limitantes, de tumores frios incluem tumores de câncer colorretal que têm baixa Instabilidade de Microssatélites baixa (MSI-low; Sinicrope, F. “The Role of Microssatellite Instability Testing in Management of Colorretal Cancer”, Clinical Advances in Hematology & Oncology Volume 14 , Edição 7 de julho de 2016). Esses tumores são conhecidos por não responderem aos inibidores de ponto de controle imunológico. Esses tumores podem ser identificados como tumores frios sem antes tratar com um ou mais inibidores de ponto de controle imunológico para estabelecer a não resposta.

[064] Como discutido acima, os “tumores frios” não são muito responsivos ao tratamento com inibidores de ponto de controle imunológico, como os anticorpos anti- PD-1 ou anti-CTLA-4. A lógica por trás desse fenômeno pode ser que, se não houver engajamento do sistema imunológico em um tumor respectivo, a inibição de um ponto de controle imunológico por um determinado inibidor não pode mudar nada para melhor.

[065] Em particular, um subconjunto de melanoma, cânceres ou tumores colorretais, cânceres ou tumores pancreáticos, glioblastoma, cânceres ou tumores de ovário e cânceres ou tumores de próstata são conhecidos por serem tumores frios.

[066] Os inventores mostram que, com um tratamento compreendendo (i) um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação e (ii) um inibidor de ponto de controle imunológico, tais tumores frios podem ser tratados eficientemente.

[067] Este achado é surpreendente e não poderia ser antecipado a partir dos achados feitos com inibidores de ponto de controle imunológico, como terapias anti-PD-1, anti- CTLA-4 ou anti-PD-L1, nem com conjugados de proteína-toxina de ligação compreendendo antraciclina. Sem estar vinculado à teoria, parece que conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo antraciclina é capaz de tornar tumores frios suscetíveis à terapia de ponto de controle imunológico, ou seja, transformá-los em tumores quentes, para que possam ser tratados eficientemente com inibidores de ponto de controle imunológico.

[068] Preferencialmente, o intervalo dentro do qual os dois agentes diferentes são administrados ao paciente não é mais que, no máximo, quatro semanas.

[069] Em uma concretização, o conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais toxinas de antraciclina é administrado antes do inibidor de ponto de controle imunológico.

[070] De acordo com uma concretização, pelo menos uma meação de toxina de antraciclina é PNU-159682, que é divulgada em Quintierei et al. 2005.

[071] De acordo com outra concretização, pelo menos uma meação de toxina de antraciclina é um derivado da antraciclina PNU-159682 tendo a seguinte fórmula (i) Anel A fórmula (i) a referida toxina sendo conjugada em sua ondulação à proteína de ligação via um ligante.

[072] As antraciclinas derivadas de PNU e o uso das mesmas em conjugados de anticorpo-fármaco são divulgados no documento WO2016102679 atribuído ao mesmo requerente. O conteúdo desta publicação é incorporado por referência aqui.

[073] De acordo com outro grupo de concretizações, o inibidor de ponto de controle imunológico é pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em  anti PD-1  anti PD-L1  anti PD-L2  anti CTLA-4  anti LAG3  anti CD40 ou anti CD40L  anti TIM3,  anti OX40 ou anti OX40L (CD134/CD134L),  anti CD112  anti CD155  anti B7-H3

 anti B7-H4  anti IDO1  anti IDO2  anti TDO2  anti TIGIT  anti GITR e/ou  anti Galectina-9.

[074] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via PD-1/PD-L1 implicada na inibição da ativação de células T, mais preferencialmente um anticorpo anti-PD-1 monoclonal, especialmente nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe ou tislelizumabe, ou mais preferencialmente um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal, mais preferencialmente atezolizumabe, durvalumabe, avelumabe ou BMS-936559.

[075] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via PD-1/PD-L2 implicada na inibição da ativação de células T, mais preferencialmente um anticorpo anti-PD-1 monoclonal, especialmente nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe ou tislelizumabe, ou mais preferencialmente um anticorpo anti-PD-L2 monoclonal.

[076] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via CTLA-4/B7 implicada na inibição da ativação de células T, mais preferencialmente um anticorpo anti-CTLA1-4 monoclonal, mais preferencialmente ipilimumabe ou tremelimumabe.

[077] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via LAG3/MHC classe II implicada na inibição da estimulação de células T e atividade TREG, mais preferencialmente um anticorpo anti- LAG3 monoclonal, especialmente LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK-4280 ou REGN3767.

[078] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via TIM3/Galectina-9 implicada na função de células T reduzida, mais preferencialmente um anticorpo anti-TIM3 monoclonal ou um anticorpo anti-Galectina-9 monoclonal.

[079] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via TIGIT/CD112 implicada na inibição da ativação de células T, mais preferencialmente um anticorpo anti-TIGIT monoclonal ou um anticorpo anti-CD112 monoclonal.

[080] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que antagoniza a via TIGIT/CD155 implicada na inibição da ativação de células T, mais preferencialmente um anticorpo anti-TIGIT monoclonal ou um anticorpo anti-CD155 monoclonal.

[081] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que age como um agonista no GITR, mais preferencialmente um anticorpo anti-GITR monoclonal agonista, especialmente GWN323, BMS-986156, MK- 4166, MK-1248, TRX518, INCAGN1876, AMG 228 ou INBRX-110.

[082] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que age como um agonista no OX40, especialmente anticorpos monoclonais anti-OX40 agonistas, tais como MOXR0916, PF-04518600, MEDI0562, MEDI6469 ou MEDI6383.

[083] Preferencialmente, o inibidor de ponto de controle é um composto ou um anticorpo monoclonal que age como um agonista no CD40, especialmente anticorpos monoclonais anti-CD40 agonistas, tais como CP-870 ou CP-893.

[084] Entre os inibidores de ponto de controle discutidos acima, compostos ou anticorpos monoclonais ligando ou antagonizando  PD-1  PD-L1  CTLA-4 e ou  B7 são particularmente preferidos, com PD-1 e PD-L1 sendo os alvos mais preferidos.

[085] De acordo com outro grupo de concretizações, o conjugado compreende em sua linha ondulada uma estrutura de ligante X – L1 – L2 – L3 – Y, em que L1 – L3 representam ligantes e dois de L1 – L3 são obrigatórios, e em que X e Y representam ainda cada um ou mais ligantes opcionais.

[086] De acordo com outro grupo de concretizações, a estrutura de ligante compreende, como L2, um peptídeo de oligo-glicina (Gly)n acoplado ao referido derivado de antraciclina, diretamente ou por meio de outro ligante L1 e em que n é um inteiro ≥1 e ≤ 21, preferencialmente, de 2 a 5. É importante entender que, em uma concretização específica (onde o Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode ser opcionalmente substituída por uma oligo-alanina (Ala)n ou por peptídeos Gly/Ala mistos.

[087] De acordo com outro grupo de concretizações, o peptídeo oligo-glicina (Gly)n é conjugado ao derivado antraciclina de fórmula (i) por meio de um ligante alquilenodiamino (EDA), designado como L1, que o ligante alquilenodiamino é conjugado ao derivado de antraciclina por meio de uma primeira ligação amida, enquanto é conjugado ao terminal carboxi do peptídeo de oligo-glicina por meio de uma segunda ligação amida, o referido conjugado de ligante alquilenodiamino e peptídeo de oligo-glicina tendo a seguinte fórmula (ii), -NH-(CH2)m-NH-(Gly)n-NH2 fórmula (ii) em que a linha ondulada indica a ligação com o derivado de antraciclina de fórmula (i), em que m é um inteiro ≥ 1 e ≤ 11, preferencialmente de 2 a 5, e n é um inteiro ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente de 2 a 5. É importante entender que, em uma concretização específica (onde o Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode opcionalmente ser substituída por uma oligo-alanina (Ala)n.

[088] De acordo com outro grupo de concretizações, o peptídeo de oligo-glicina (Gly)n é, diretamente ou por meio de outro ligante L1, acoplado ao Anel A do derivado antraciclina de fórmula (ii) (onde o Anel A do núcleo de antraciclina é representado em Shi et al., 2009). É importante entender que, em uma concretização específica (onde o

Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode ser opcionalmente substituída por uma oligo-alanina (Ala)n.

[089] De acordo com outro grupo de concretizações, o peptídeo de oligo-glicina (Gly)n é conjugado ao derivado de antraciclina de fórmula (i) por meio de um ligante alquilenamino (EA), designado como L1, que o ligante alquilenamino é conjugado ao terminal carboxi do peptídeo de oligo-glicina por meio de uma ligação amida, o referido conjugado do ligante alquilenamino e o peptídeo de oligo-glicina tendo a seguinte fórmula (iii) -(CH2)m-NH-(Gly)n-NH2 fórmula (iii) em que a linha ondulada indica a ligação com o derivado antraciclina de fórmula (i), em que m é um inteiro ≥ 1 e ≤ 11, preferencialmente de 2 a 5, e n é um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente de 2 a 5. É importante entender que, em uma concretização específica (onde o Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode ser opcionalmente substituída por uma oligo-alanina (Ala)n.

[090] De acordo com outro grupo de concretizações, a estrutura de ligante L3 compreende um motivo de peptídeo que resulta de clivagem específica de um motivo de reconhecimento de enzima sortase.

[091] O motivo de reconhecimento de enzima sortase serve como tag para a assim chamada conjugação de anticorpo mediada por enzima sortase (tecnologia SMAC), que é divulgada no documento WO2014140317 atribuída ao mesmo candidato. O conteúdo desta publicação é incorporado por referência aqui. Nesta tecnologia, uma enzima sortase conjuga duas moléculas, uma das quais está carregando tal motivo de reconhecimento, enquanto a outra está carregando um peptídeo de oligo-glicina (Gly)n. É importante entender que, em uma concretização específica (onde o Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode ser opcionalmente substituída por uma oligo-alanina (Ala)n.

[092] De acordo com outro grupo de concretizações, o referido motivo de reconhecimento de enzimas sortase compreende pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos: LPXTG, LPXAG, LPXSG, LAXTG, LPXTA ou NPQTN, com X sendo qualquer sequência de aminoácidos concebível.

[093] De acordo com outro grupo de concretizações, o ligante resultante tem pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos: -LPXTG n-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, - LAXTGn-, -LPXTGn-, -LPXTAn- ou -NPQTGn-, com Gn sendo uma oligo-ou poliglicina com n sendo um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21, An sendo uma oligo-ou polialanina com n sendo um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21 e X sendo qualquer sequência de aminoácidos concebível.

[094] De acordo com outro grupo de concretizações, o derivado de antraciclina é conjugado, por meio de um ou mais ligantes, ao terminal carboxi da proteína de ligação ou ao termo carboxi de pelo menos um domínio ou subunidade do mesmo.

[095] De acordo com outro grupo de concretizações, a proteína de ligação é conjugada ao terminal amino do peptídeo de oligo-glicina (Gly)n por meio de uma ligação amida. É importante entender que, em uma concretização específica (onde o Streptococcus pyogenes sortase A é usado, ver abaixo), a oligo-glicina (Gly)n pode ser opcionalmente substituída por uma oligo-alanina (Ala)n.

[096] A sortase que está sendo usada é preferencialmente uma sortase A. Em uma concretização, é uma sortase A de Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus. Em uma concretização, uma sortase A projetada está sendo usada que ainda reconhece o motivo de reconhecimento de sortase A. Em uma concretização, a sortase A projetada é derivada do Streptococcus pyogenes sortase A. Em outra concretização, a sortase A projetada é derivada do Staphylococcus aureus sortase A.

[097] De acordo com outro grupo de concretizações, a proteína de ligação é pelo menos uma selecionada a partir do grupo consistindo em um anticorpo, uma proteína de ligação à base de anticorpo, um formato de anticorpo modificado retendo capacidade de ligação de alvo, um derivado de anticorpo ou um fragmento retendo capacidade de ligação de alvo, um andaime alternativo e/ou um mimético de anticorpo.

[098] Entre os acima, os anticorpos são o tipo mais preferido de proteína de ligação.

[099] Os termos “anticorpo”, “proteína de ligação à base de anticorpo”, “formato de anticorpo modificado retendo capacidade de ligação de alvo”, “derivado de anticorpo ou fragmento retendo capacidade de ligação de alvo” referem-se à(s) cadeia(s) de polipeptídeos que exibem uma forte ligação monovalente, bivalente ou polivalente a um dado antígeno, epítopo ou epítopos. Anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno usados na invenção podem ser gerados usando qualquer tecnologia adequada, por exemplo, tecnologia hibridoma, exibição de ribossomo, exibição de fago, bibliotecas combinatórias de genes, bibliotecas semissintética ou totalmente sintética ou combinações das mesmas. Anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção incluem anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno que contêm as porções de ligação de antígeno de um anticorpo intacto e retêm a capacidade de ligar o antígeno cognato. A menos que especificado de outra forma aqui, todas as sequências de peptídeos, incluindo todas as sequências de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno são referidas na ordem N → C.

[100] Um anticorpo intacto tipicamente compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 kD) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kD) interligadas por ligações de dissulfeto. Os genes reconhecidos de imunoglobulina que codificam cadeias de anticorpo incluem os genes de região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como os inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Cada cadeia pesada de um anticorpo é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada. No caso do IgG, a região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1,CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. Os anticorpos monoclonais (mAbs) consistem em moléculas de anticorpos idênticos.

[101] As regiões VH e VL de um anticorpo podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, também denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que são intercaladas com as regiões framework (FRs) mais conservadas. Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostos desde o terminal amino até o terminal carboxil na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As localizações das regiões CDR e FR e um sistema de numeração foram definidos, por exemplo, o sistema IMGT (Lefranc MP et al., 2015), como usado aqui.

[102] Anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção também abrangem anticorpos de cadeia simples. O termo “anticorpo de cadeia simples” refere-se a um polipeptídeo compreendendo um domínio VH e um domínio VL em ligação de polipeptídeo, geralmente ligado através de um peptídeo espaçador e que pode compreender domínios adicionais ou sequências de aminoácidos nos terminais amino- e/ou carboxil-. Por exemplo, um anticorpo de cadeia simples pode compreender um segmento de cadeia para ligar ao polinucleotídeo de codificação. Como exemplo, um fragmento de região variável de cadeia simples (scFv) é um anticorpo de cadeia simples. Comparado com os domínios VL e VH do fragmento Fv que são codificados por genes separados, um scFv tem os dois domínios unidos (por exemplo, via métodos recombinantes) por um ligante sintético. Isso permite que eles sejam feitos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se juntam para formar moléculas monovalentes.

[103] Exemplos de proteínas de ligação à base de anticorpo são polipeptídeos nos quais os domínios de ligação dos anticorpos são combinados com outros polipeptídeos ou domínios de polipeptídeos, por exemplo, andaimes moleculares alternativos, regiões Fc, outros domínios funcionais ou de ligação de outros polipeptídeos ou anticorpos resultando em moléculas com propriedades de ligação de adição, por exemplo, proteínas ou anticorpos bi ou multiespecíficos. Tais polipeptídeos podem criar um arranjo de domínios de ligação ou funcionais normalmente não encontrados em anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ocorrem naturalmente.

[104] Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo intacto; (v) Fvs estabilizados de dissulfeto (dsFvs) que possuem uma ligação de dissulfeto entre cadeias projetadas entre regiões framework estruturalmente conservadas; (vi) um anticorpo de domínio simples (dAb) que consiste nos domínios VH ou VL (ver, por exemplo, Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989); e (vii) uma região determinante de complementaridade(CDR) isolada como um peptídeo linear ou cíclico.

[105] Fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção também abrangem unidades de ligação de antígeno de domínio simples que têm um andaime de camelídeo. Os animais da família dos camelídeos incluem camelos, lhamas e alpacas. Os camelídeos produzem anticorpos funcionais desprovidos de cadeias leves. O domínio variável de cadeia pesada (VH) dobra-se autonomamente e funciona independentemente como uma unidade de ligação de antígeno. Sua superfície de ligação envolve apenas três CDRs em comparação com os seis CDRs em moléculas clássicas de ligação de antígeno (Fabs) ou fragmentos variáveis de cadeia simples (scFvs). Os anticorpos camelídeos são capazes de atingir afinidades de ligação comparáveis às dos anticorpos convencionais.

[106] Os termos “anticorpo humano” referem-se a um anticorpo, proteína de ligação à base de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que contém sequências derivadas de imunoglobulinas humanas tal que substancialmente todas as regiões CDR são de origem humana e substancialmente todas as regiões FR correspondem às de uma sequência de imunoglobulina humana.

[107] Os termos “andaime alternativo” e “mimético de anticorpo” referem-se a proteínas não pertencentes à família das imunoglobulinas e até mesmo não-proteínas, tais como aptâmeros ou polímeros sintéticos. Alguns tipos têm uma estrutura folha beta semelhante a anticorpo. As vantagens potenciais de “miméticos de anticorpo” ou “andaimes alternativos” sobre os anticorpos são melhor solubilidade, maior penetração de tecido, maior estabilidade em relação ao calor e às enzimas e custos de produção relativamente baixos.

[108] Alguns miméticos de anticorpo podem ser fornecidos em grandes bibliotecas, que oferecem candidatos de ligação específicos contra todos os alvos concebíveis. Assim como com anticorpos, a miméticos de anticorpo específico de alvo podem ser desenvolvidos pelo uso de tecnologias de High Throughput Screening (HTS), bem como com tecnologias de exibição estabelecidas, assim como exibição de fago, exibição bacteriana, levedura ou exibição de mamífero. Atualmente, os miméticos de anticorpo desenvolvidos abrangem, por exemplo, proteínas de repetição de anquirina (chamadas DARPins), lectinas do tipo C, proteínas de domínio A de S. aureus, transferrinas, lipocalinas, domínios de 10º tipo III de fibronectina, inibidores de protease de domínio Kunitz, aglutinantes derivados de ubiquitina (chamadas afilinas), aglutinantes derivados de cristalina gama, nós de cisteína, aglutinantes à base de tiorredoxina A, aptâmeros de ácido nucleico, anticorpos artificiais produzidos por impressão molecular de polímeros, bibliotecas de peptídeos de genomas bacterianos, domínios SH-3, stradobodies, “domínios A” de receptores de membrana estabilizados por ligações dissulfeto e Ca2+, compostos baseados em CTLA4, Fyn SH3 e aptâmeros (ácido oligonucleico ou moléculas de peptídeos que se ligam a moléculas alvo específicas).

[109] Anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção podem se ligar a qualquer alvo adequado em uma célula cancerosa ou dentro do ambiente da célula cancerosa do tumor. Em uma concretização, os anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção se ligam a um alvo na superfície da célula cancerosa. Em uma concretização preferida, esse alvo é expresso exclusivamente na célula cancerosa ou é superexpresso na célula cancerosa em relação ao tecido saudável. O requerente sugere que qualquer alvo para o qual os anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção se ligam à célula cancerosa e que fazem com que os anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção sejam internalizados na célula, juntamente com a meação de toxina de antraciclina, resultando na morte de célula imunogênica dessa célula e/ou infiltração de células imunes (por exemplo, células T) no tumor, é um alvo adequado. O técnico no assunto é capaz de identificar tais alvos através do exame da literatura e experimentação.

[110] Em uma concretização, os alvos adequados incluem ROR1, CS-1, HER2, mesotelina e ROR2. Em uma concretização, os anticorpos, proteínas de ligação à base de anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da invenção se ligam ao ROR1.

[111] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação compreendida no conjugado de proteína-toxina de ligação é um anticorpo que a) compreende um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve compreendidas no par de sequências de domínio variável de cadeia pesada/leve estabelecido nos seguintes pares de SEQ ID NOs: 1 e 2; 3 e 4, 5 e 6 e/ou 20 e 21 b) compreende um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve compreendendo as seguintes SEQ ID NOs, na ordem (HCDR1; HCDR2; HCDR3; LCDR1; LCDR2 e LCDR3)  22, 23, 24, 25, 26 e 27,  28, 29, 30, 31, 32 e 33,  34, 35, 36, 37, 38 e 39 e/ou  40, 41, 42, 43, 44 e 45. c) compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve de b), com a condição de que pelo menos uma das CDRs tenha até 3 substituições de aminoácidos em relação às respectivas SEQ ID NOs e/ou d) compreende as regiões determinantes (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve de b) ou c), com a condição de que pelo menos uma das CDRs tenha uma sequência ≥ 66 % para as respectivas SEQ ID NOs, em que as CDRs estão incorporados em uma estrutura de proteína adequada de modo a serem capazes de ligar-se a ROR1 com afinidade de ligação suficiente.

[112] Como usado aqui, o termo “CDR” ou “região determinante de complementaridade” pretende significar os locais de combinação de antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Essas regiões específicas foram descritas por Kabat et al. (1977), Kabat et al. (1991), Chothia et al. (1987) e MacCallum et al., (1996), onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a um CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou variantes dos mesmos destina-se a estar dentro do escopo do termo como definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácidos que abrangem os CDRs como definidos por cada uma das referências citadas acima são estabelecidos na tabela abaixo como comparação. Observe que essa numeração pode diferir dos CDRs que são realmente divulgados na listagem de sequência incluída, porque as definições de CDR variam de caso a caso.

Kabat Chothia MacCallum VH CDR1 31-35 26-32 30-35 VH CDR2 50-65 53-55 47-58 VH CDR3 95-102 96-101 93-101 VL CDR1 24-34 26-32 30-36 VL CDR2 50-56 50-52 46-55 VL CDR3 89-97 91-96 89-96 Definições de CDR

[113] Como usado aqui, o termo “framework” quando usado em referência a uma região variável de anticorpo é inserido para significar todos os resíduos de aminoácido fora das regiões CDR dentro da região variável de um anticorpo. Portanto, uma região variável de framework está entre cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento, mas destina-se a referenciar apenas aqueles aminoácidos fora dos CDRs.

[114] Como usado aqui, o termo “capaz de ligar-se ao alvo X com afinidade de ligação suficiente” deve ser entendido como significando que o respectivo domínio de ligação liga o alvo a um KD de 10-4 ou menor. O KD é a constante de equilíbrio de dissociação, uma proporção de koff/kon, entre o aglutinante de proteína e seu antígeno. KD e afinidade estão inversamente relacionados. O valor KD refere-se à concentração de aglutinante de proteína (a quantidade de aglutinante de proteína necessária para um experimento particular) e, portanto, quanto menor o valor de KD (menor concentração) e, portanto, maior a afinidade do domínio de ligação. A tabela a seguir mostra faixas de KD típicas de anticorpos monoclonais.

Valor de KD Faixa molar 10-4 a 10-6 Micromolar (μM) 10-7 a 10-9 Nanomolar (nM) 10-10 a 10-12 Picomolar (pM) 10-13 a 10-15 Femtomolar (fM) Valores KD e Molar

[115] Preferencialmente, o aglutinante de proteína tem até 2 substituições de aminoácidos e, mais preferencialmente, até 1 substituição de aminoácidos.

[116] Preferencialmente, pelo menos uma das CDRs tem uma identidade de sequência ≥ 67 %; ≥ 68%; ≥ 69%; ≥ 70%; ≥ 71%; ≥ 72%; ≥ 73%; ≥ 74%; ≥ 75%; ≥ 76%; ≥ 77%; ≥ 78%; ≥ 79%; ≥ 80%; ≥ 81%; ≥ 82%; ≥ 83%; ≥ 84%; ≥ 85%; ≥ 86%; ≥ 87%; ≥ 88%; ≥ 89%; ≥ 90%; ≥ 91%; ≥ 92%; ≥ 93%; ≥ 94%; ≥ 95%; ≥ 96%; ≥ 97%; ≥ 98%; ≥ 99 % e o mais preferencialmente 100% para a respectiva SEQ ID NO.

[117] “Porcentagem de identidade de sequência” como usado aqui, é determinada comparando duas sequências alinhadas de forma ótima sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (por exemplo, um polipeptídeo), que não compreende adições ou exclusões, para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.

[118] Os termos “idêntico” ou porcentagem de “identidade”, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas sequências. Duas sequências são “substancialmente idênticas” se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (ou seja, pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de sequência de identidade sobre uma região especificada ou, quando não especificado, sobre toda a sequência de uma sequência de referência), quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. A divulgação fornece polipeptídeos ou polinucleotídeos que são substancialmente idênticos aos polipeptídeos ou polinucleotídeos, respectivamente, exemplificados aqui. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 15, 25 ou 50 nucleotídeos de comprimento ou, mais preferencialmente, sobre uma região que é de 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos de comprimento, ou sobre o comprimento total da sequência de referência. Com relação a sequências de aminoácidos, identidade ou identidade substancial pode existir sobre uma região que tem pelo menos 5, 10, 15 ou 20 aminoácidos de comprimento, opcionalmente pelo menos cerca de 25, 30, 35, 40, 50, 75 ou 100 aminoácidos de comprimento, opcionalmente pelo menos cerca de 150, 200 ou 250 aminoácidos em comprimento, ou ao longo de todo a comprimento da sequência de referência. Com relação a sequências de aminoácidos mais curtas, por exemplo, sequências de aminoácidos de 20 ou menos aminoácidos, existe uma identidade substancial quando um ou dois resíduos de aminoácido são substituídos conservadoramente, de acordo com as substituições conservadoras definidas aqui.

[119] Preferencialmente, pelo menos uma das CDRs foi sujeita a modificação de sequência de CDR, incluindo  maturação de afinidade  redução da imunogenicidade

[120] A maturação de afinidade no processo pelo qual a afinidade de um determinado anticorpo é aumentada in vitro. Como a contraparte natural, a maturação de afinidade in vitro é baseada nos princípios de mutação e seleção. Tem sido usado com sucesso para otimizar anticorpos, fragmentos de anticorpo ou outras moléculas de peptídeos como miméticos de anticorpo. Mutações aleatórias dentro das CDRs são introduzidas usando radiação, mutagênicos químicos ou PCR propenso a erros. Além disso, a diversidade genética pode ser aumentada por embaralhamento de cadeia. Duas ou três rodadas de mutação e seleção usando métodos de exibição como exibição de fago, geralmente, resulta em fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa do nanomolar baixo. Para princípios, ver Eylenstein et al. (2016), cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

[121] Anticorpos projetados contêm regiões CDR derivadas de sequência murina que foram enxertadas, juntamente com quaisquer mutações reversas de estrutura necessárias, em regiões V derivadas de sequência. Assim, as próprias CDRs podem causar reações imunogênicas quando o anticorpo humanizado é administrado a um paciente. Os métodos de redução da imunogenicidade causada por CDRs são divulgados em Harding et al. (2010), cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

[122] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação compreendida no conjugado de proteína-toxina de ligação é um anticorpo que a) os pares de domínios variáveis de cadeia pesada/cadeia leve (HCVD/LCVD) estabelecidos nos seguintes pares de SEQ ID NOs: 1 e 2; 3 e 4, 5 e 6 e/ou 20 e 21 b) os pares de domínios variáveis de cadeia pesada/cadeia leve (HCVD/LCVD) de a), com a condição que  o HCVD tem uma identidade de sequência ≥ 80 % para a respectiva SEQ ID NO e/ou  o LCVD tem uma identidade de sequência ≥ 80 % para a respectiva SEQ ID NO, c) os pares de domínios variáveis de cadeia pesada/cadeia leve (VD) de a) ou b), com a condição de que pelo menos um dos HCVD ou LCVD tenha até 10 substituições de aminoácidos em relação à respectiva SEQ ID NO, o referido aglutinante de proteína ainda sendo capaz de ligar-se a ROR1 com afinidade de ligação suficiente.

[123] Um “domínio variável”, quando usado em referência a um anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, pretende significar a porção de um anticorpo que confere ligação de antígeno à molécula e que não é a região constante. O termo pretende incluir fragmentos funcionais dos mesmos que mantêm parte de toda a função de ligação de toda a região variável. Os fragmentos de ligação de região variável incluem, por exemplo, fragmentos funcionais, tais como Fab, F(ab)2, Fv, Fv de cadeia simples (scFv) e semelhantes. Tais fragmentos funcionais são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Assim, o uso desses termos na descrição de fragmentos funcionais de uma região variável heteromérica pretende corresponder às definições bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Tais termos são descritos em, por exemplo, Huston et al., (1993) ou Plückthun e Skerra (1990).

[124] Preferencialmente, o HCVD e/ou LCVD tem uma identidade de sequência ≥ 81%; ≥ 82%; ≥ 83%; ≥ 84%; ≥ 85%; ≥ 86%; ≥ 87%; ≥ 88%; ≥ 89%; ≥ 90%; ≥ 91%; ≥ 92%; ≥ 93%; ≥ 94%; ≥ 95%; ≥ 96%; ≥ 97%; ≥ 98%; ≥ 99%; ou o mais preferencialmente 100% para a respectiva SEQ ID NO.

[125] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação compreende pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservadora.

[126] Uma “substituição de aminoácido conservadora”, como usado aqui, tem um efeito menor na função de anticorpo do que uma substituição não conservadora. Embora existam muitas maneiras de classificar aminoácidos, eles são classificados frequentemente em seis grupos principais com base em sua estrutura e nas características químicas gerais de seus grupos R.

[127] Em algumas concretizações, uma “substituição de aminoácido conservadora” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Por exemplo, famílias de resíduos de aminoácido com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com  cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina),

 cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico),  cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína),  cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano),  cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e  cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[128] Outras substituições de aminoácido conservadas também podem ocorrer em famílias de cadeia lateral de aminoácido, tais como ao substituir uma asparagina por ácido aspártico, a fim de modificar a carga de um peptídeo. Mudanças conservadoras podem incluir ainda a substituição de aminoácidos quimicamente homólogos não naturais (ou seja, um aminoácido hidrofóbico não natural sintético no lugar da leucina, um aminoácido aromático não natural sintético no lugar do triptofano).

[129] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação tem uma afinidade de ligação de alvo para ROR1 de, pelo menos, 50% em comparação com a de um anticorpo de acordo com a descrição acima.

[130] Como usado aqui, o termo “afinidade de ligação” pretende significar a força de uma interação de ligação e, portanto, inclui tanto a afinidade de ligação real quanto a afinidade de ligação aparente. A afinidade de ligação real é uma proporção da taxa de associação sobre a taxa de dissociação. Portanto, conferir ou otimizar a afinidade de ligação inclui alterar um ou ambos os componentes para atingir o nível desejado de afinidade de ligação. A afinidade aparente pode incluir, por exemplo, a avidez da interação. Por exemplo, um fragmento de ligação de região variável heteromérica bivalente pode exibir afinidade de ligação alterada ou otimizada devido à sua valência.

[131] Um método adequado para medir a afinidade de um agente de ligação é através da ressonância plasmônica de superfície (SPR). Este método é baseado no fenômeno que ocorre quando as ondas de plasmon de superfície são excitadas em uma interface metal/líquido. A luz é direcionada e refletida a partir do lado da superfície que não está em contato com a amostra e o SPR causa uma redução na intensidade da luz refletida em uma combinação específica de ângulo e comprimento de onda. Os eventos de ligação biomolecular causam alterações no índice de refração na camada superficial, que são detectadas como alterações no sinal SPR. O evento de ligação pode ser uma associação de ligação ou dissociação entre um par receptor-ligante. As alterações no índice de refração podem ser medidas essencialmente instantaneamente e, portanto, permite a determinação dos componentes individuais de uma constante de afinidade. Mais especificamente, o método permite medições precisas das taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff).

[132] As medições de valores de kon e koff podem ser vantajosas porque podem identificar regiões variáveis alteradas ou regiões variáveis otimizadas que são terapeuticamente mais eficazes. Por exemplo, uma região variável alterada, ou fragmento de ligação heteromérico da mesma, pode ser mais eficaz porque tem, por exemplo, um valor kon mais elevado em comparação com regiões variáveis e fragmentos de ligação heteroméricos que exibem afinidade de ligação semelhante. O aumento da eficácia é conferido porque as moléculas com valores de kon mais elevados podem ligar- se e inibir especificamente seu alvo a uma taxa mais rápida. Da mesma forma, uma molécula da invenção pode ser mais eficaz porque exibe um valor koff mais baixo em comparação com moléculas com afinidade de ligação semelhante. O aumento da eficácia observada com moléculas com taxas de koff mais baixas pode ser observada porque, uma vez ligadas, as moléculas são mais lentas para se dissociar de seu alvo. Embora descritos com referência às regiões variáveis alteradas e regiões variáveis otimizadas da invenção, incluindo fragmentos de ligação de região variável heteromérica dos mesmos, os métodos descritos acima para medir taxas de associação e dissociação são aplicáveis a essencialmente qualquer aglutinante de proteína ou fragmento do mesmo para identificar aglutinantes mais efetivos para fins terapêuticos ou diagnósticos.

[133] Outro método adequado para medir a afinidade de um agente de ligação é através da superfície é por análise FACS/Scatchard.

[134] Métodos para medir a afinidade, incluindo taxas de associação e dissociação usando ressonância plasmônica de superfície são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados descritos em, por exemplo, Jonsson e Malmquist, (1992) e Wu et al. (1998). Além disso, um aparelho bem conhecido na técnica para medir interações de ligação é um instrumento BIAcore 2000 que está comercialmente disponível através da Pharmacia Biosensor (Uppsala, Suécia).

[135] Preferencialmente, a referida afinidade de ligação de alvo é ≥ 51%, ≥ 52%, ≥ 53%, ≥ 54%, ≥ 55%, ≥ 56%, ≥ 57%, ≥ 58%, ≥ 59%, ≥ 60%, ≥ 61%, ≥ 62%, ≥ 63%, ≥ 64%, ≥ 65%, ≥ 66%, ≥ 67%, ≥ 68%, ≥ 69%, ≥ 70%, ≥ 71%, ≥ 72%, ≥ 73%, ≥ 74%, ≥ 75%, ≥ 76%, ≥ 77%, ≥ 78%, ≥ 79%, ≥ 80%, ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84%, ≥ 85%, ≥ 86%, ≥ 87%, ≥ 88%, ≥ 89%, ≥ 90%, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, e o mais preferencialmente ≥ 99% em comparação com a do agente de ligação de referência.

[136] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação compete por ligação de ROR1 com um anticorpo de acordo com a descrição acima.

[137] De acordo com outra concretização da invenção, a proteína de ligação se liga essencialmente a mesma, ou a mesma, região em ROR1 como um anticorpo de acordo com a descrição acima.

[138] Como usado aqui, o termo “compete por ligação” é usado em referência a um dos anticorpos definidos pelas sequências como acima, o que significa que o aglutinante de proteína real como uma atividade que se liga ao mesmo alvo, ou epítopo alvo ou domínio ou subdomínio, assim como a referida sequência definiu o aglutinante de proteína e é uma variante deste último. A eficiência (por exemplo, cinética ou termodinâmica) de ligação pode ser a mesma ou maior ou menor que a eficiência deste último. Por exemplo, a constante de equilíbrio de ligação para a ligação ao substrato pode ser diferente para os dois anticorpos.

[139] Tal competição por ligação pode ser adequadamente medida com um ensaio de ligação competitiva. Tais ensaios são divulgados em Finco et al. 2011, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência e seu significado para interpretação de uma reivindicação de patente é divulgado em Deng et al 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

[140] A fim de testar essa característica, tecnologias adequadas de mapeamento de epítopos estão disponíveis, incluindo, inter alia,  Co-cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica (crio-EM)  Varredura de oligo-peptídeo baseada em matriz  Mapeamento de mutagênese direcionado ao local  Mapeamento de epítopos de mutagênese shotgun de alto rendimento  Troca hidrogênio-deutério e/ou  Espectrometria de massa com acoplamento cruzado

[141] Esses métodos são, inter alia, divulgados e discutidos em Banik et al (2010) e DeLisser (1999), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

Exemplos

[142] Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nos desenhos e na descrição anterior, tal ilustração e descrição devem ser consideradas ilustrativas ou exemplares e não restritivas; a invenção não está limitada às concretizações divulgadas. Outras variações às concretizações divulgadas podem ser entendidas e efetuadas por técnicos no assunto na prática da invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da divulgação e das reivindicações anexadas. Nas reivindicações, a palavra “compreendendo” não exclui outros elementos ou etapas e o artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui uma pluralidade. O mero fato de que certas medidas são citadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não pode ser usada com vantagem. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitando o escopo.

[143] Todas as sequências de aminoácidos divulgadas aqui são mostradas a partir do N-terminal até o C-terminal; todas as sequências de ácido nucleico divulgadas aqui são mostradas 5’ → 3’.

Exemplo 1. Geração de ROR1 anti-humano recombinante, purificado e anticorpos de controle de isótipo

[144] Vetores de expressão: as regiões de codificação da região variável de anticorpo foram produzidas por síntese genética total (GenScript) usando MNFGLRLIFLVLTLKGVQC como sequência líder e foram montadas com regiões constantes IgH-γ1 e IgL-κ ou IgL-λ humanas, como aplicável, no vetor de expressão pCB14. Este vetor, um derivado do vetor de expressão epissomal de mamífero pCEP4 (Invitrogen), carrega a origem de replicação EBV, codifica o antígeno nuclear EBV (EBNA-1) para permitir a replicação extracromossômica e contém um marcador de seleção de puromicina no lugar do gene de resistência de higromicina B original.

[145] Expressão e purificação: vetores de expressão baseados em pCB14 foram transfectados em células HEK293T usando Lipofectamine® LTX Reagent with PLUS™ Reagent (Thermo Fisher Scientific, Reinach, Suíça, 15388100); após uma incubação de 1 dia (37°C, 5% CO2, meio de crescimento: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alta glicose (4,5g/L) com L-glutamina com 10% (v/v), soro de bezerro fetal (FCS), 100 IU/mL de Pen-Strep-Fungizone e L-glutamina 2mM (todos Bioconcept, Allschwil, Suíça)), as células foram expandidas em condições de seleção (2μg/mL de puromicina (Sigma- Aldrich, Buchs SG, Suiça, P8833-25mg stock a 2mg/mL)). As células foram divididas e expandidas (37°C, 5% CO2); uma vez que a confluência foi atingida, as placas de cultura de tecido foram revestidas com 20μg/ml de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, P1524) por 2h a 37°C e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram tripsinizadas e divididas 1:3 em placas revestidas de poli-L-lisina. Novamente após atingir a confluência, as células foram lavadas com PBS seguidas de substituição de meio para meio de produção (DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03) suplementadas com 1μg/mL puromicina (Sigma, P8833), 100 UI/mL de Pen-Strep-Fungizone (Bioconcept), 161μg/mL de N-acetil-L-cisteína (Sigma-Aldrich, A8199) e 10μg/mL de L-glutationa reduzida (Sigma-Aldrich, G6529). O sobrenadante, colhido quinzenalmente e filtrado (0,22 μm) para remover as células, foi armazenado a 4°C até a purificação.

[146] Para purificação, o sobrenadante filtrado foi carregado em uma coluna Protein A HiTrap com PBS equilibrado (GE Healthcare, Frankfurt am Main, Alemanha, 17-0405-

01) ou uma coluna JSR Amsphere™ Protein A (JSR Life Sciences, Leuven, Bélgica, JWT203CE) e lavado com PBS; a eluição foi realizada usando glicina 0,1M (pH 2,5) em um AEKTA puro (GE Healthcare). As frações foram imediatamente neutralizadas com tampão Tris-HCl 1M (pH 8,0) e analisadas quanto a pureza e integridade de proteína por SDS-PAGE. As frações contendo proteínas foram misturadas e submetidas à troca de tampão usando unidades de filtragem Amicon (Millipore, Schaffhausen, Suíça, UFC901008) para atingir uma diluição de 1:100 em PBS e, em seguida, esterilizadas por filtragem usando um filtro de baixa retenção (0,20 μm, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha, PA49.1).

[147] Os anticorpos foram expressos transitoriamente em células CHO por métodos conhecidos na técnica e os anticorpos recombinantes foram purificados por purificação de proteína A padrão de sobrenadantes de células CHO, como conhecido na técnica. A pureza e a integridade dos anticorpos recombinantes foram analisadas por SDS-PAGE.

Tabela 1. Anticorpos anti-hROR1 e de controle de isótipo usados nos Exemplos Anticorpo SEQ ID Tags de C-terminal Anticorpo Formato HC/LC (HC: Cadeia Pesada, LC: Cadeia Leve) HC: SEQ ID NO.1 HC: LPETG-Strep XBR1-402 (mAb202) IgG LC: SEQ ID NO.2 LC: G4LPETG-Strep HC: SEQ ID NO.3 HC: LPETG-Strep Ac10 (mAb046) IgG LC: SEQ ID NO.4 LC: G4SLPETG-Strep HC: SEQ ID NO.5 HC: LPETG-Strep 2A2 (mAb066) IgG LC: SEQ ID NO.6 LC: G4SLPETG-Strep huXBR1-402-17 HC: SEQ ID NO.20 HC: nenhum IgG (mAb357) LC: SEQ ID NO.21 LC: G4SLPETG-TwinStrep HC: SEQ ID NO.3 HC: nenhum Ac10 (mAb340) IgG LC: SEQ ID NO.4 LC: G4SLPETG-TwinStrep Exemplo 2. Conjugação de mAbs com toxinas de glicina modificada para formar ADCs usando SMAC-technologyTM

[148] Sortase A. Uma enzima Sortase A recombinante e afinidade purificada baseada na Sortase A de Staphylococcus aureus foi produzida em E. coli conforme as técnicas descritas no documento WO2014140317A1.

[149] Geração de toxinas de glicina modificada. A fim de gerar ADCs conjugados com SMAC-technologyTM, derivado de pentaglicina-EDA-PNU (G5-EDA-PNU) foi fabricado pela Concortis (retratada na Figura 1). A identidade e pureza da toxina de pentaglicina modificada foram confirmadas por espectrometria de massa e HPLC, respectivamente. O G5-EDA-PNU exibiu pureza >95%, como determinado por cromatografia HPLC.

[150] Conjugação de anticorpo mediada por sortase. A toxina acima mencionada foi conjugada a anticorpos conforme a Tabela 2, incubando mAbs com tag LPETG [10 μM] com toxina de glicina modificada [200 μM] e 3 μM Sortase A no tampão de conjugação listado por 3,5 h a 25°C. A reação foi interrompida passando-a através de uma coluna rProtein A GraviTrap (BioRad). O conjugado ligado foi eluido com 5 volumes de coluna de tampão de eluição (glicina 0,1M, pH 2,5, 50nM NaCl), com frações de volume de 1 coluna coletadas em tubos contendo 25% v/v, HEPES 1M, pH 8 para neutralizar o ácido. As proteínas contendo frações foram agrupadas e formuladas no tampão de formulação da Tabela 2 usando uma coluna de dessalinização ZebaSpin.

[151] Análise da ADC. A proporção fármaco-anticorpo (DAR) foi avaliada por cromatografia de fase reversa realizada em um Polymer Labs PLRP 2.1mm x 5cm, 5μm de coluna executado a 1mL/min/80°C com um gradiente linear de 25minutos entre 0,05 e 0,1% TFA/H2O e 0,04 a 0,1% TFA/CH3CN. As amostras foram primeiramente reduzidas por incubação com DTT em pH 8,0 a 37°C por 15 minutos. O DAR determinado por cromatografia de fase reversa está resumido na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Resumo analítico dos ADCs fabricados neste estudo. DAR, proporção fármaco-anticorpo. ND, não determinado. ADC mAb (ref.) Toxina Tampão de conjugação Tampão de formulação DAR XBR1-402- XBR1-402 50mM HEPES (pH 7,5), G5-PNU PBS ND G5-PNU (mAb202) 150mM NaCl, 5mM CaCl2 Ac10-G5- Ac10 50mM HEPES (pH 7,5), G5-PNU PBS 3,7 PNU (mAb046) 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ac10-G3- Ac10 250mM HEPES, pH 7,5, G3-PNU PBS 1,9 PNU (mAb340) 5mM CaCl2, 50% Glicerol huXBR1- 15mM Histidina, pH huXBR1- 250mM HEPES, pH 7,5, 402-17-G3- G3-PNU 6,5, 175mM sacarose, 1,9 402-17 5mM CaCl2, 50% Glicerol PNU 0,02% Tween20 huXBR1- 15mM Histidina, pH huXBR1- 250mM HEPES, pH 7,5, 402-17-G2- G2-PNU 6,5, 175mM sacarose, 2,0 402-17 5mM CaCl2, 50% Glicerol PNU 0,02% Tween20

[152] A partir dessas análises pode-se concluir que a conjugação SMAC-technologyTM de procedeu com alta eficiência.

Exemplo 3. Geração de células EMT-6 expressando estavelmente ROR1 humano

[153] Células de câncer de mama EMT-6 murino foram cultivadas em DMEM completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alta glicose (4.5g/L) com L-glutamina com 10% (v/v) soro de bezerro fetal (FCS), 100 UI/mL de Pen-Strep-Fungizone e L-glutamina 2mM (todos Bioconcept, Allschwil, Suíça)) a 37°C e 5% de CO2. As células foram projetadas para superexpressar ROR1 por transposição da seguinte forma: as células foram centrifugadas (6 min, 290 x g, 4°C) e ressuspensas em meio RPMI-1640 (5x106 células/mL). 400 μL de suspensão de células foi então adicionado a 400 μL de RPMI contendo 13,3 μg de qualquer vetor transponível pPB-PGK-Puro-ROR1 (direcionando a co-expressão de ROR1 de comprimento completo (NP_005003.2) juntamente com o gene de resistência à puromicina) e 6,6 μg de vetor pCDNA3.1_hy_mPB contendo transposase. A mistura de células DNA/EMT-6 foi transferida para cubetas de eletroporação (0,4 cm-lacuna, 165-2088, BioRad, Cressier, Suíça) e eletroporada usando o Biorad Gene Pulser II com extensor de capacitância a 300 V e 950 μF. Em seguida, as células foram incubadas por 5-10 min em temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram centrifugadas a 290 x g por 6 min em uma centrífuga Eppendorf 5810R, lavadas uma vez e posteriormente ressuspensas em DMEM completo antes da incubação a 37°C em uma incubadora umidificada em 5% de atmosfera de CO2. Um dia após a eletroporação, as piscinas de células que expressavam estavelmente o ROR1 humano foram selecionadas pela adição de 3 μg/mL de puromicina (Sigma-Aldrich, P8833).

[154] Os clones de uma única célula que expressa ROR1 foram derivados de células EMT-6-ROR1 selecionadas por antibiótico. Resumidamente, após a tripsinização, 106 células foram centrifugadas em tubos FACS; as pelotas obtidas foram ressuspensas em tampão (PBS com 2% (v/v) FCS). As células foram então incubadas com anticorpo anti- ROR1 2A2 por 30min (4°C, concentração final 2 μg/mL), seguido por centrifugação e lavagem. As células foram então ressuspensas como anteriormente e incubadas com anticorpo IgG anti-humano (Fc gama-específico) PE (eBioscience, Viena, Áustria, 12-

4998-82) com uma diluição de 1:250 no escuro (30 min, 4°C), lavado uma vez em tampão e mantido em gelo até a triagem de célula única de células que expressam antígeno por FACS usando um instrumento FACSAriaII (BD Biosciences, San Jose, EUA).

Exemplo 4. Avaliação in vivo de ADCs anti-ROR1 em modelo de tumor de mama singênico EMT-6-ROR1

[155] 1x106 células de tumor EMT-6-ROR1 clone 14 em PBS 100 μl foram implantadas ortotopicamente na almofada de gordura mamária de cada camundongo BALB/c. Ao atingir um volume médio de tumor de aproximadamente 30-80 mm3 (por compasso de calibre), no dia 0 (D0), os camundongos foram randomizados em blocos em grupos de 8 animais cada, de acordo com o tamanho do tumor. Os camundongos foram então tratados uma vez com doses diferentes (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1 mg/kg) (Fig. 3), a fim de determinar uma dose sub-ótima, na qual as ADCs só resultam em uma resposta parcial anti-tumor. Após isso, os mesmos modelos foram configurados para tratamento com a baixa dose de ADC, incluindo um ADC de controle de isótipo compatível e com ou sem tratamento de combinação com 10 mg/kg anti-CTLA4 inibidor de ponto de controle imunológico mAb 9D9 de acordo com a Tabela 3. Os camundongos foram monitorados por pelo menos 40 dias e sacrificados em caso de carga tumoral excessiva ou sinais de angústia. O inibidor de ponto de controle imunológico 9D9 é um inibidor de camundongo CTLA-4 e foi formulado em PBS e foi comprado na BioXcell, West Lebanon, New Hampshire, EUA.

Tabela 3: Grupos experimentais para avaliação in vivo de ADCs à base de toxina PNU em combinação com inibidores de ponto de controle Concentração Aplicação Grupo de tratamento Volume Rota Esquema após randomização 1 Controle de Veículo - 5 ml/kg i.v. Uma vez D0 Ac10-G5-PNU (controle de 2 0,25 mg/kg 5 ml/kg i.v. Uma vez D0 isótipo) 4 XBR1-402-G5-PNU 0,25 mg/kg 5 ml/kg i.v. Uma vez D0 anticorpo α-mCTLA-4 (9D9) D2 e mais dois tratamentos 10 mg/kg i.p. + com 3-4 dias de diferença 6 + 5 ml/kg + Ac10-G5-PNU (controle de + 0,25 mg/kg i.v. isótipo) Uma vez D0

D2 e mais dois tratamentos anticorpo α-mCTLA-4 (9D9) 10 mg/kg 5 ml/kg i.p. com 3-4 dias de diferença 11 + + + + + XBR1-402-G5-PNU 0,25 mg/kg 5 ml/kg i.v. Uma vez D0

[156] Os volumes de tumor foram determinados com base na medição do tamanho do tumor com compasso de calibre duas vezes por semana. Para o cálculo da mediana dos volumes de tumor do grupo, foram considerados os valores dos animais que estavam vivos no dia em questão. Além disso, os volumes de tumor de animais que foram sacrificados devido à sua carga tumoral foram levados adiante usando a metodologia Last-Observation-Carried-Forward (LOCF) enquanto isso aumentou o volume médio/mediana de tumor do grupo.

[157] A Figura 4 apresenta a evolução do volume de tumor para camundongos individuais, bem como a evolução da mediana do volume de tumor. A evolução do volume de tumor para camundongos individuais tratados com (A) controle do veículo, (B) controle de isótipo Ac10-G5-PNU, (C) XBR1-402-G5-PNU, (D) controle de isótipo Ac10-G5-PNU mais anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9, (E) XBR1-402-G5-PNU mais anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9. (F) Evolução da mediana do volume de tumor do grupo (com aplicação da metodologia Last-Observation-Carried-Forward (LOCF)) para os seguintes grupos: controle de veículo, controle de isótipo Ac10-G5-PNU e XBR1- 402-G5-PNU. (G) Evolução da mediana do volume de tumor do grupo (com aplicação da metodologia Last-Observation-Carried-Forward (LOCF)) para os seguintes grupos: controle de veículo, controle de isótipo Ac10-G5-PNU e anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9 e XBR1-402-G5-PNU e anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9.

[158] Como mostrado pelos resultados na figura, a combinação de XBR1-402-G5-PNU e anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9 fornece respostas anti-tumor aprimoradas em relação ao tratamento individual com ADC a 0,25 mg/kg sozinho. Além disso, o painel D mostra que, em relação ao veículo (Painel A) e ao controle de isótipo (Painel B), o anticorpo anti-CTLA-4 camundongo 9D9 mostra alguma eficácia anti-tumor, suportando que o modelo de tumor EMT-6-ROR1 pode ser caracterizado como um modelo de tumor quente.

[159] Além disso, todos os camundongos sobreviventes no grupo 11 (mas não em outros grupos? - talvez seja importante mostrar?) foram protegidos do crescimento tumoral no re-desafio (dia 102) com 1x106 células tumorais EMT-6-ROR1 clone 14, implantadas na almofada de gordura mamária sem injeção prévia (não mostrada) indicando que apenas na combinação da ADC com o inibidor de ponto de controle foi gerada uma resposta imunológica anti-tumor protetora.

Exemplo 5. Geração de células CT-26 e B16-F10 expressando estavelmente ROR1 humano

[160] Células de carcinoma de cólon CT-26 murino e células de melanoma B16-F10 (“B16”) (ambas da ATCC) foram cultivadas em meio RPMI com 10% (v/v) de soro de bezerro fetal (FCS), 100 UI/mL de Pen-Strep-Fungizone e L-glutamina 2 mM (todos Bioconcept, Allschwil, Suíça) a 37°C e 5% de CO2. As células foram projetadas para superexpressar ROR1 por transposição da seguinte forma: as células foram centrifugadas em uma centrífuga Eppendorf 5810R (6 min, 290 x g, 4°C) e ressuspensas em meio RPMI (5x106 células/mL). 400 μL de suspensão de células foi então adicionado a 400 μL de RPMI contendo 13,3 μg de vetor transponível pPB-PGK-Puro-ROR1 (direcionando a co-expressão de ROR1 de comprimento completo (NP_005003.2) juntamente com o gene de resistência à puromicina) e 6,6 μg do vetor pcDNA3.1_hy_mPB contendo transposase. A mistura de células DNA/CT-26 ou B16 foi transferida para cubetas de eletroporação (0,4 cm-lacuna, 165-2088, BioRad, Cressier, Suíça) e eletroporada usando o Biorad Gene Pulser II com extensor de capacitância a 300V e 950 μF. Em seguida, as células foram incubadas por 5-10min em temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram centrifugadas a 290 x g por 6 min, lavadas uma vez e posteriormente ressuspensas em RPMI completo prévia à incubação a 37°C em uma incubadora umidificada em 5% de atmosfera de CO2. Um dia após a eletroporação, as piscinas de células que expressavam o ROR1 humano foram selecionadas adicionando 3 μg/mL de puromicina (Sigma-Aldrich, P8833).

[161] Os clones de uma única célula CT-26 que expressa ROR1 foram derivados de células selecionadas por antibióticos. Resumidamente, após a tripsinização, 10 6 células foram centrifugadas em tubos FACS; as pelotas obtidas foram ressuspensas em tampão

(PBS com 2% (v/v) FCS). As células foram então incubadas com anticorpo anti-ROR1 XBR1-402 por 30 min (4°C, concentração final 2 μg/mL), seguido por centrifugação e lavagem. As células foram então ressuspensas como anteriormente e incubadas com anticorpo IgG anti-humano (Fc gama-específico) PE (eBioscience, Viena, Áustria, 12- 4998-82) a uma diluição de 1:250 no escuro (30min, 4°C), lavada uma vez em tampão e mantida em gelo até a triagem de células únicas de células que expressam antígeno por FACS usando um instrumento FACSAriaII (BD Biosciences, San Jose, EUA). A Figura 5 (A) mostra os resultados de coloração FACS do CT-26 projetado clone 3. A expressão de ROR1 nas piscinas B16 usadas no experimento abaixo também foi determinada por FACS (Figura 5 (B)).

Exemplo 6. Modelo de camundongo com carcinoma de cólon CT26 superexpressando hROR1 tratado com ADCs anti-ROR1 e combinações com inibidores de ponto de controle imunológico

[162] CT26 estabelece tumores mornos a quentes em modelos de camundongos, o que significa que estes respondem aos inibidores de ponto de controle imunológico quando dosados suficientemente altos (Mosely, S. et al., 2017). Os grupos experimentais, conforme a Tabela 4, cada um continha oito camundongos BALB/c fêmeas de 6-8 semanas de idade. 1x106 células tumorais CT-26-ROR1 clone 3 (do Exemplo 5) em 100 μl de PBS foram implantadas unilateralmente no flanco de cada camundongo. Ao atingir um volume médio de tumor de aproximadamente 30-100 mm3 (por compasso de calibre), no dia 0 (D0), os camundongos foram randomizados em grupos de acordo com o tamanho do tumor. Os camundongos foram então tratados de acordo com a Tabela 4 e monitorados três vezes por semana durante 42 dias ou até que os tumores atingissem a 1500 mm3 (por compasso de calibre). RPM1-14 (BioXcell, West Lebanon, New Hampshire, EUA) é um inibidor de camundongo PD-1 e foi formulado em PBS. Este inibidor de ponto de controle imunológico foi dosado abaixo de sua dose efetiva como uma monoterapia, como previamente determinado por Oncotest (dados não mostrados).

Tabela 4: Grupos experimentais para avaliação in vivo de ADCs anti-ROR1 com inibidores de ponto de controle imunológico

Concentração Aplicação Grupo (tamanho do grupo) de tratamento Rota Esquema após randomização i.v. Uma vez D0 1 Controle de Veículo - i.p. D0, D4, D8 2 Ac10-G3-PNU (isótipo) 4 mg/kg i.v. Uma vez D0 3 huXBR1-402-17-G3-PNU 4 mg/kg i.v. Uma vez D0 Ac10-G3-PNU 4 mg/kg i.v. Uma vez D0 4 + + + + anticorpo α-mPD-1 (RPM1-14) 5 mg/kg i.p. D0, D4, D8 huXBR1-402-17-G3-PNU 4 mg/kg I.v. Uma vez D0 5 + + + + anticorpo α-mPD-1 (RPM1-14) 5 mg/kg i.p. D0, D4, D8

[163] A Figura 6 apresenta a evolução do volume de tumor para camundongos individuais em cada grupo: (A) controle de veículo (não tratado) do grupo 1, (B) controle de isótipo do grupo 2, (C) ADC anti-ROR1 huXBR1-402-17-G3-PNU do grupo 3, (D) controle de isótipo mais anticorpo anti-PD-1 camundongo inibidor de ponto de controle imunológico do grupo 4, (E) ADC anticorpo anti-ROR1 huXBR1-402-17-G3-PNU mais inibidor de ponto de controle imunológico anticorpo anti-PD-1 camundongo do grupo

7. Ressalta-se que o ADC-direcionado ao alvo foi dosado em uma dose significativamente menor que o necessário para a resposta completa como monoterapia, como mostrado no Painel C. Os resultados sugerem uma forte sinergia entre o inibidor de ponto de controle imunológico avaliado e o derivado de PNU alvejado compreendendo ADC.

Exemplo 7. Modelo de camundongo com melanoma B16 superexpressando hROR1 tratado com ADCs anti-ROR1 e combinações com inibidores de ponto de controle imunológico

[164] B16 estabelece tumores fracamente imunogênicos (frios) em modelos de camundongos (Celik, C. et al. 1983), o que significa que estes não respondem aos inibidores de ponto de controle imunológico quando dosados dentro de uma faixa razoável, ou seja, até cerca de 50 a 100 μg/camundongo (Grosso, J. et al., 2013). Grupos experimentais, conforme a Tabela 7, cada um continha dez camundongos BL6/6NRj fêmeas de 8-9 semanas de idade. 2x105 células tumorais B16-ROR1 (do Exemplo 5) em 100 μl de solução de sal balanceado de Hanks (HBSS, Thermo Fischer) foram injetados i.v. em cada camundongo no dia 0 (D0). Os camundongos foram randomizados em grupos por simples alocação aleatória e tratados de acordo com a Tabela 5, com monitoramento de5 dias por semana durante 12-19 dias.

Tabela 5: Grupos experimentais para avaliação in vivo de ADCs anti-ROR1 com inibidores de ponto de controle imunológico Concentração Aplicação Grupo (tamanho do grupo) de tratamento Rota Esquema após randomização i.v. Uma vez D1 1 Controle de Veículo - i.p. D1, D5, D9 2 huXBR1-402-17-G2-PNU 4 mg/kg i.v. Uma vez D1 3 anticorpo α-mCTLA-4 (9D9) 10 mg/kg i.p. D1, D5, D9 huXBR1-402-17-G2-PNU 4 mg/kg i.v. Uma vez D1 4 + + + anticorpo α-mCTLA-4 (9D9) 10 mg/kg i.p. D1, D5, D9

[165] No último dia de monitoramento, os camundongos foram sacrificados por CO2 seguido de coleta e fixação de pulmão inteiro em solução de Bouin (Labforce Bio- Optica). Metástase induzida experimentalmente (Saxena M. et al., 2013) em cada superfície pulmonar (representando colônias B16-ROR1) foram contabilizadas visualmente e cada uma foi avaliada para atribuição a uma das três caixas (diâmetro <1 mm, 1-2 mm, >2 mm) sob condições cegas. O volume das colônias em cada pulmão foi então determinado de acordo com a seguinte fórmula (aproximando cada colônia como uma esfera):

[166] Volume da colônia (mm3) = contagem (pontos com diâmetro < 1 mm) x 0,004 mm3 + contagem (pontos com diâmetro de 1-2 mm) x 0,21 mm3 + contagem (pontos com diâmetro > 2 mm) x 0,485mm3.

[167] As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism e teste T não pareado de média. O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (*), o valor de p ≥ 0,5 foi considerado estatisticamente não significativo (n.s.).

[168] A Figura 7 apresenta os volumes das colônias dos diferentes grupos de tratamento da Tabela 5. Os resultados sugerem, em um tumor fracamente imunogênico (“frio”) sem efeito significativo do inibidor de ponto de controle imunológico, uma forte sinergia entre o inibidor de ponto de controle imunológico avaliado e o derivado de PNU alvejado compreendendo ADC.

Exemplo 8. Modelo de camundongo com melanoma B16 superexpressando hROR1 tratado com ADCs anti-ROR1

[169] Os grupos experimentais, conforme a Tabela 6, continham camundongos BL6/6NRj fêmeas de 8-9 semanas de idade. 106 células tumorais B16-ROR1 (do exemplo 5) em 100 μl de solução de sal balanceado de Hanks (HBSS, Thermo Fischer) foram implantadas unilateralmente no flanco de cada camundongo. Ao atingir um volume médio de tumor de aproximadamente cerca de 250 mm3 (por compasso de calibre), no dia 0 (D0), os camundongos foram randomizados em grupos de acordo com o tamanho do tumor conforme a Tabela 6. Os camundongos foram então tratados de acordo com a Tabela 6 e foram sacrificados 24 horas após a administração, seguido pela extração do tumor.

Tabela 6: Grupos experimentais para avaliação in vivo de ADC anti-ROR1 Camundongos Rota de Cronograma Concentração no grupo Administração de Grupo (tamanho do grupo) de tratamento Tratamento 1 Controle não tratado - 1 - - 3 i.v. D0 2 huXBR1-402-17-G2-PNU 4 mg/kg

[170] Os tumores foram congelados rapidamente em um composto de temperatura de corte ótimo (oct, da Fischer Scientific). As crio-seções foram coradas usando primariamente anticorpos comerciais anti-CD4 camundongo e anti-CD8 camundongo (GK1.5 BioLegend 100402 e 53-6.7 BioLegend 100702, respectivamente). A detecção foi realizada usando um anticorpo anti-camundongo (AlexaFluor488, Invitrogen A21208).

[171] A Figura 8 mostra imagens representativas da coloração por CD4 e CD8 do hROR1 (ROR1 humano) superexpresso nas crio-seções de tumor B16 de (A) o camundongo de controle não tratado e (B) os três camundongos tratados com ADCs (uma vez, a 4 mg/kg) de acordo com a Tabela 6. Conforme a Figura 8(A), os tumores B16 contêm naturalmente baixos níveis de células CD4+ e CD8+, de acordo com o estado dos tumores B16 como tumores frios. A Figura 8(B) mostra que o tratamento com o ADC, conforme a presente invenção, aumenta o número de células CD4+ e CD8+ dentro do tumor.

[172] Além disso, os tumores CT-26 e B-16 superexpressando hROR1 (ROR1 humano) foram mecanicamente e enzimaticamente digeridos e submetidos à coloração FACS para células viáveis e marcadores de célula imune para confirmar as populações de células T. O esquema de coloração FACS relatado na Tabela 7 foi usado, em combinação com o LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit para reagente de coloração de excitação de 633 ou 635 nm (ThermoFischer).

Tabela 7: Anticorpos de coloração FACS para coloração de população de células imunes Anticorpo Rótulo Alvo Clone Cat. # Empresa anti-CD45 PE-CF592 CD45 30-F11 562420 BD Biosciences camundongo anti-CD3ε PE/Cy7 CD3 145-2C11 100319 Biolegend camundongo anti-CD4 PE CD4 RM4-4 116005 Biolegend camundongo anti-CD8a Alexa Fluor 488 CD8 53-6.7 100726 Biolegend camundongo anti-CD137 APC 4-1BB 17B5 106109 Biolegend camundongo anti-Ki-67 PerCP/Cy5.5 Ki67 16A8 652423 ThermoFisher camundongo

[173] A Figura 9 mostra o estado de ativação das populações de células T positivas CD4 (Painel A) e CD8 (Painel B) nos dois modelos de tumor (não tratados), confirmando a natureza fria do modelo de tumor B-16 superexpressando hROR1 (ROR1 humano).

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[174] As seguintes sequências fazem parte da divulgação do presente pedido. Uma listagem de sequência eletrônica compatível com o WIPO ST 25 também é fornecida com este pedido. Para evitar dúvidas, se houver discrepâncias entre as sequências da tabela a seguir e a listagem de sequência eletrônica, as sequências nesta tabela serão consideradas as corretas.

1 Sequência de QEQQKESGGGLFKPTDTLTLTCTASGFDISSYYMSWVRQAPGNGLEWIGAIGISGNAYYASWAKS aminoácidos RSTITRNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS XBR1-402 HC SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 2 Sequência de SYELTQLPSVSVSLGQTARITCEGNNIGSKAVHWYQQKPGLAPGLLIYDDDERPSGVPDRFSGSNS aminoácidos GDTATLTISGAQAGDEADYYCQVWDSSAYVFGGGTQLTVTGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKAT XBR1-402 LC LVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTH

EGSTVEKTVAPTECS 3 Sequência de QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFK aminoácidos GKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAP Ac10 HC SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT

YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 4 Sequência de DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARF aminoácidos SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT Ac10 LC ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE

VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 5 Sequência de QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFSDYEMHWVIQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKF aminoácidos KGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTGYYDYDSFTYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAP 2A2 HC SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT

YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 6 Sequência de DIVMTQSQKIMSTTVGDRVSITCKASQNVDAAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGS aminoácidos GSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYDIYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV 2A2 LC CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC 7 Staphylococcus aureus sortase A sequência de reconhecimento 1, com X sendo -LPXTG qualquer aminoácido 8 Staphylococcus aureus sortase A sequência de reconhecimento 2, com X sendo -LPXAG qualquer aminoácido 9 sequência de reconhecimento para Staphylococcus aureus sortase A ou sortase A -LPXSG 4S-9 projetada de Staphylococcus aureus, com X sendo qualquer aminoácido 10 sequência de reconhecimento para sortase A 2A-9 projetada de Staphylococcus -LAXTG aureus, com X sendo qualquer aminoácido 11 Streptococcus pyogenes sortase A sequência de reconhecimento, com X sendo -LPXTA qualquer aminoácido 12 Staphylococcus aureus sortase sequência de reconhecimento -NPQTN 13 Ligante derivado de Staphylococcus aureus sortase A sequência de -LPXT(Gn)- reconhecimento 1, com X sendo qualquer aminoácido e n ≥ 1 e ≤ 21

14 Ligante derivado de Staphylococcus aureus sortase A sequência de -LPXA(Gn)- reconhecimento 2, com X sendo qualquer aminoácido e n ≥ 1 e ≤ 21 15 Ligante derivado de sequência de reconhecimento para Staphylococcus aureus -LPXS(Gn)- sortase A ou sortase A 4S-9 projetada de Staphylococcus aureus, com X sendo qualquer aminoácido e n ≥ 1 e ≤ 21 16 Ligante derivado de sequência de reconhecimento para sortase A 2A-9 projetada -LAXT(Gn)- de Staphylococcus aureus, com X sendo qualquer aminoácido e n ≥ 1 e ≤ 21 17 Ligante derivado de sequência de reconhecimento de Streptococcus pyogenes -LPXT(Gn)- sortase A, com X sendo qualquer aminoácido e n ≥ 1 e ≤ 21 ou -LPXT(An)- 18 Ligante derivado de sequência de reconhecimento de Staphylococcus aureus -NPQT(Gn)- sortase, com n ≥ 1 e ≤ 21 19 sequência líder MNFGLRLIFLVLTLK

GVQC 20 Sequência de QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSR aminoácidos VTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS huXBR1-402- KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI 17 HC CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD

VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 21 Sequência de SYELTQPPSVSVAPGKTARITCEGNNIGSKAVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDERPSGIPERFSGSNS aminoácidos GNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSAYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL huXBR1-402- VCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHE 17 LC GSTVEKTVAPTECS 22 XBR1-402 SYYMS HCDR1 23 XBR1-402 AIGISGNAYYASWAKS HCDR2 24 XBR1-402 DHPTYGMDL HCDR3 25 XBR1-402 EGNNIGSKAVH LCDR1 26 XBR1-402 DDDERPS LCDR2 27 XBR1-402 QVWDSSAYV LCDR3 28 Ac10 HCDR1 YTFTDYYIT 29 Ac10 HCDR2 WIGWIYPGSGNTKY 30 Ac10 HCDR3 NYGNYWFAY 31 Ac10 LCDR1 QSVDFDGDSYMN 32 Ac10 LCDR2 VLIYAASNLES 33 Ac10 LCDR3 QQSNEDPW 34 2A2 HCDR1 YTFSDYEMH 35 2A2 HCDR2 WIGAIDPETGGTAY 36 2A2 HCDR3 GYYDYDSFTY 37 2A2 LCDR1 QNVDAAVA 38 2A2 LCDR2 LLIYSASNRYT 39 2A2 LCDR3 QQYDIYPY

40 huXBR1-402- FDISSYYMS 17 HCDR1 41 huXBR1-402- WIGAIGISGNAYYASWA 17 HCDR2 42 huXBR1-402- RDHPTYGMDL 17 HCDR3 43 huXBR1-402- NIGSKAVH 17 LCDR1 44 huXBR1-402- LVIYDDDERPS 17 LCDR2 45 huXBR1-402- QVWDSSAY 17 LCDR3

Claims (29)

1. REIVINDICAÇÕES 1) Um conjugado de proteína-toxina de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais meações de toxina de antraciclina conjugadas a uma proteína de ligação para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica como sendo um tumor frio.
2. 2) Um método de tratamento ou prevenção de uma doença neoplásica como sendo um tumor frio, caracterizado pelo fato de que o referido método compreendendo administrar a um paciente um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina.
3. 3) Uma combinação, caracterizada pelo fato de que combina (i) um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, e (ii) um inibidor de ponto de controle imunológico para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica como sendo um tumor frio, em que o conjugado de proteína-toxina de ligação e o inibidor de ponto de controle imunológico são administrados ao paciente simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.
4. 4) Um método de tratamento ou prevenção de uma doença neoplásica como sendo um tumor frio, caracterizado pelo fato de que o referido método compreendendo administrar a um paciente (i) um conjugado de proteína-toxina de ligação compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, e

   (ii) um inibidor de ponto de controle imunológico em que o conjugado de proteína-toxina de ligação e o inibidor de ponto de controle imunológico são administrados ao paciente simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.
5. 5) Um conjugado de proteína-toxina de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, para uso em combinação com um inibidor de ponto de controle imunológico (para a fabricação de um medicamento) para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica como sendo um tumor frio.
6. 6) Um inibidor de ponto de controle imunológico (ICI) caracterizado pelo fato de que é usado em combinação com um conjugado de proteína-toxina de ligação, compreendendo uma ou mais meações de toxina de antraciclina, conjugadas a uma proteína de ligação, (para a fabricação de um medicamento) para uso no tratamento de um paciente  sofrendo de,  estar em risco de desenvolver e/ou  sendo diagnosticado com uma doença neoplásica como sendo um tumor frio.
7. 7) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que a doença neoplásica como sendo um tumor frio é um tumor que é ou tem sido refratário, resistente ao tratamento de inibidor de ponto de controle imunológico ou recorrente após o tratamento de inibidor de ponto de controle imunológico.
8. 8) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que a doença neoplásica como sendo um tumor frio é selecionada a partir do grupo consistindo em  melanoma,  cânceres ou tumores colorretais,  cânceres ou tumores pancreáticos,  glioblastoma,  cânceres ou tumores de ovário e/ou  cânceres ou tumores de próstata.
9. 9) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação se liga a pelo menos um alvo selecionado a partir do grupo consistindo em  ROR1  CS1  HER2  Mesotelina (MN) e/ou  ROR2.
10. 10) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que a doença neoplásica como sendo um tumor frio caracterizado tem um imunoscore de < 1.
11. 11) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma meação de toxina de antraciclina é um derivado da antraciclina PNU-159682 tendo a seguinte fórmula (i)

    Anel A fórmula (i) a referida toxina sendo conjugada em sua linha ondulada para a proteína de ligação via um ligante.
12. 12) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 3-11, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de controle imunológico é pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em  anti PD-1  anti PD-L1  anti PD-L2  anti CTLA-4  anti LAG3  anti CD40 ou anti CD40L  anti TIM3,  anti OX40 ou anti OX40L (CD134/CD134L),  anti CD112  anti CD155  anti B7-H3  anti B7-H4  anti IDO1  anti IDO2  anti TDO2  anti TIGIT  anti GITR e/ou

     anti Galectin-9.
13. 13) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 1-12, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende em sua linha ondulada uma estrutura de ligante X – L1 – L2 – L3 – Y, em que L1 – L3 representam ligantes e dois de L1 – L3 são obrigatórios, e em que X e Y representam ainda cada um ou mais ligantes opcionais.
14. 14) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a estrutura de ligante compreende, como L2, um peptídeo de oligo-glicina (Gly)n acoplado ao referido derivado de antraciclina, diretamente ou por meio de outro ligante L1 e em que n é um inteiro ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente, de 2 a 5.
15. 15) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo oligo-glicina (Gly)n é conjugado ao derivado de antraciclina de fórmula (i) por meio de um ligante alquilenodiamino (EDA), designado como L1, que o ligante alquilenodiamino é conjugado ao derivado de antraciclina por meio de uma primeira ligação amida, enquanto é conjugado ao terminal carboxi do peptídeo de oligo-glicina por meio de uma segunda ligação amida, o referido conjugado de ligante alquilenodiamino e peptídeo de oligo-glicina tendo a seguinte fórmula (ii), -NH-(CH2)m-NH-(Gly)n-NH2 fórmula (ii) em que a linha ondulada indica a ligação com o derivado de antraciclina de fórmula (i), em que m é um inteiro ≥ 1 e ≤ 11 e n é um inteiro ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente de 2 a

    5.
16. 16) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de oligo-glicina (Gly)n é, diretamente ou por meio de outro ligante L1, acoplado ao Anel A do derivado de antraciclina de fórmula (ii).
17. 17) O método, conjugado, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de oligo-glicina (Gly)n é conjugado ao derivado de antraciclina de fórmula (ii) por meio de um ligante alquilenamino (EA), designado como L1, que o ligante alquilenamino é conjugado ao terminal carboxi do peptídeo de oligo-glicina por meio de uma ligação amida, o referido conjugado do ligante alquilenamino e o peptídeo de oligo-glicina tendo a seguinte fórmula (iii) -(CH2)m-NH-(Gly)n-NH2 fórmula (iii) em que a linha ondulada indica a ligação com o derivado de antraciclina de fórmula (ii), em que m é um inteiro ≥ 1 e ≤ 11 e n é um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente de 2 a 5.
18. 18) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 13-18, caracterizado pelo fato de que a estrutura de ligante L3 compreende um motivo de peptídeo que resulta de clivagem específica de um motivo de reconhecimento de enzima sortase.
19. 19) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o motivo de reconhecimento de enzima sortase compreende pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos: LPXTG, LPXAG, LPXSG, LAXTG, LPXTA ou NPQTN, com X sendo qualquer sequência de aminoácidos concebível.
20. 20) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o ligante resultante tem pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos: -LPXTGn-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, -LAXTGn-, -LPXTGn-, -LPXTAn- ou-NPQTGn-, com G n sendo uma oligo- ou poliglicina com n sendo um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21, An sendo uma oligo- ou polialanina com n sendo um inteiro entre ≥ 1 e ≤ 21, preferencialmente 2-5 e X sendo qualquer sequência de aminoácidos concebível.
21. 21) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-20, caracterizado pelo fato de que o derivado de antraciclina é conjugado, por meio de um ou mais ligantes, ao terminal carboxi da proteína de ligação ou ao termo carboxi de pelo menos um domínio ou subunidade do mesmo.
22. 22) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-21, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é conjugada ao terminal amino do peptídeo de oligo-glicina (Gly)n por meio de uma ligação amida.
23. 23) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é pelo menos uma selecionada a partir do grupo consistindo em um anticorpo, uma proteína de ligação à base de anticorpo, um formato de anticorpo modificado retendo capacidade de ligação de alvo, um derivado de anticorpo ou um fragmento retendo capacidade de ligação de alvo, um andaime alternativo e/ou um mimético de anticorpo.
24. 24) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo que a) compreende um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve compreendida no par de sequências de domínio variável de cadeia pesada/leve estabelecido nos seguintes pares de SEQ ID NOs: 1 e 2; 3 e 4, 5 e 6 e/ou 20 e 21 b) compreende um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/leve compreendendo as seguintes SEQ ID NOs, na ordem (HCDR1; HCDR2; HCDR3; LCDR1; LCDR2 e LCDR3)  22, 23, 24, 25, 26 e 27,  28, 29, 30, 31, 32 e 33,  34, 35, 36, 37, 38 e 39 e/ou  40, 41, 42, 43, 44 e 45. c) compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve de b), com a condição de que pelo menos uma das CDRs tenha até 3 substituições de aminoácidos em relação às respectivas SEQ ID NOs e/ou d) compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada/cadeia leve de b) ou c), com a condição de que pelo menos uma das CDRs tenha uma identidade de sequência ≥ 66% para as respectivas SEQ ID NOs,

    em que as CDRs estão incorporadas em uma estrutura de proteína adequada de modo a serem capazes de ligar-se a ROR1 com afinidade de ligação suficiente.
25. 25) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo que compreende a) os pares de domínios variáveis de cadeia pesada/cadeia leve (HCVD/LCVD) estabelecidos nos seguintes pares de SEQ ID NOs: 1 e 2; 3 e 4, 5 e 6 e/ou 20 e 21 b) os pares de domínios variáveis de cadeia pesada/cadeia leve (HCVD/LCVD) de a), com a condição de que  o HCVD tem uma identidade de sequência ≥ 80% para a respectiva SEQ ID NO e/ou  o LCVD tem uma identidade de sequência ≥ 80% para a respectiva SEQ ID NO, c) os pares de domínios variáveis (VD) de cadeia pesada/cadeia leve de a) ou b), com a condição de que pelo menos um dos HCVD ou LCVD tenha até 10 substituições de aminoácidos em relação à respectiva SEQ ID NO, o referido aglutinante de proteína ainda sendo capaz de ligar-se a ROR1 com afinidade de ligação suficiente.
26. 26) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com as reivindicações 24-25, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação compreende pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservadora.
27. 27) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação tem uma afinidade de ligação de alvo a ROR1 de pelo menos 50% em comparação com a de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25.
28. 28) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação compete pela ligação ROR1 com um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25.
29. 29) O conjugado, método, combinação ou ICI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação liga-se essencialmente à mesma, ou a mesma, região em ROR1 como um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25.