CN112795501A - 分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌d2406及应用 - Google Patents

分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌d2406及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物领域，具体公开了分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌D2406及应用，所述贝莱斯芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020874，该菌株可以促进亮斑扁角水虻生长，并可以在离体条件和水虻幼虫体内稳定抑制金黄色葡萄球菌。本发明的肠道细菌，可以提高幼虫的转化率、提高物料的减少率、提高幼虫增重率、在离体条件和水虻幼虫体内稳定抑制金黄色葡萄球菌。该菌产生的挥发性化合物2,5‑二甲基吡嗪对人畜共患致病细菌具有显著的抑制效果。将该肠道细菌接种到亮斑扁角水虻转化体系中，不仅提高了水虻幼虫转化效能，而且消减了转化物料中金黄色葡萄球菌的丰度，并有望降低化学药物使用过程中带来的环境污染。

Description

分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌D2406及应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌D2406及应用。
技术背景
作为农业大国，我国每年产生多达38亿吨的畜禽粪污，这些废弃物严重污染环境、传播疾病、威胁人类安全。其中的致病性微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生原生动物以及蠕虫等。然而，由于环保意识薄弱，废弃物处理技术和设施的落后以及养殖场对生产处理成本的考虑，畜禽养殖业的发展带来了环境污染，还威胁人类和动物的健康。研究发现畜禽粪便中病原菌主要包括放线菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、梭菌、棒状杆菌、大肠杆菌、球菌、李斯特菌、分枝杆菌、博德特氏菌、葡萄球菌和链球菌等。抗生素的这种广泛使用已导致动物粪便中存在大量的抗生素抗性基因(ARGs)，并且通过水平基因转移将ARGs传播给人类病原体的可能性增加，使畜禽粪污和动物尸体中的抗生素抗性病原菌增多，对环境和人类健康造成严重威胁。
亮斑扁角水虻(Hermetiaillucens)，英文名为Black soldier fly，是双翅目，水虻科，扁角水虻属，亮斑扁角水虻种的一种昆虫。亮斑扁角水虻幼虫食性杂、食量大，能处理畜禽粪便、餐厨剩余垃圾等多种有机废弃物。亮斑扁角水虻转化猪粪等有机废弃物、减少有机废弃物积累、解决环境污染、生产新型生物能源，缓解资源和能源的短缺，引起了世界各国学者和政府工作者的广泛关注。亮斑扁角水虻幼虫能够正常生活在畜禽粪便、餐厨剩余物等微生态环境复杂的环境中。国内外对水虻抑制致病菌进行了研究，研究显示昆虫水虻在转化过程中能够有效抑制常见的人畜共患病原菌，如大肠杆菌、金黄葡萄球菌和沙门氏菌等。肠道微生物在宿主亮斑扁角水虻转化畜禽粪便等有机废物和拮抗人畜共患致病菌方面具有重要作用。
从水虻幼虫肠道内筛选能够同时促进水虻生长和拮抗人畜共患致病菌的微生物，应用到水虻转化畜禽粪污等有机废弃物产业中，一菌多用，有望减少抗生素和化学药品的使用，将会大大降低生产成本，提高工作效率，是一种环境友好型的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株促进宿主生长与拮抗金黄色葡萄球菌的亮斑扁角水虻幼虫肠道细菌，所述细菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020874，该肠道细菌不仅提高了水虻幼虫转化效能，而且消减了转化物料中金黄色葡萄球菌的丰度，产生的挥发性化合物2,5-二甲基吡嗪能够显著拮抗人畜共患致病细菌。
本发明的另一个目的在于提供了贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明的贝莱斯芽胞杆菌分离自亮斑扁角水虻幼虫肠道，革兰氏阳性杆状有芽胞，该菌株已于2020年12月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(B acillus velezensis)D2406，保藏编号：CCTCC NO：M2020874，地址：中国武汉武汉大学。
所述的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406具有常规的贝莱斯芽胞杆菌的形态特征和培养方式。
本发明的保护范围，还包括：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406或其发酵液在制备细菌抑菌剂中的应用，所述的细菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonella e nteritidis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria mo nocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或树状类芽胞杆菌(Paenibacillusdendritiformis)；
以上所述的应用中，优选的，该抑菌剂为触杀剂或熏杀剂。
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406在制备成水虻肠道抑菌剂中的应用，其应用过程包括将贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406接种至水虻的饲料；
以上所述的应用中，当制备成抑菌剂时，其主效成分为2,5-二甲基吡嗪。
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406在促进水虻生长或制备成水虻生长促进剂中的应用，其应用过程包括将贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406接种至水虻的饲料。
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406在消减水虻转化物料中金黄色葡萄球菌丰度中的应用。
以上所述的应用中，优选的，所述的水虻为亮斑扁角水虻武汉品系。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明利用亮斑扁角水虻幼虫与微生物联合转化猪粪，可以提高幼虫的转化率、提高猪粪的减少率、提高幼虫增重率、在离体条件和水虻幼虫体内稳定抑制金黄色葡萄球菌，而且消减了转化物料中金黄色葡萄球菌的丰度，产生的挥发性化合物2,5-二甲基吡嗪能够显著拮抗人畜共患致病细菌。
2.提高猪粪处理效率，降低环境污染问题。
4.不仅提高了亮斑扁角水虻水虻与微生物联合转化的效能，而且提高了亮斑扁角水虻的营养价值。
附图说明
图1为2,5-二甲基吡嗪触杀抑菌谱。
图2为2,5-二甲基吡嗪熏杀抑菌谱。
具体实施方式
以下结合具体的实施例和实验数据对本发明做进一步的说明。本发明实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术方案，所用试剂或配方若未特别说明，均购自生化商店。
本发明实施例中所述6日龄幼虫为亮斑扁角水虻武汉品系，(Fen Zhou,JefferyK.Tomberlin,Longyu Zheng,Ziniu Yu,and Jibin Zhang,Developmental and WasteReduction Plasticity of Three Black Soldier Fly Strains(Diptera:Stratiomyidae)Raised on Different Livestock Manures.Journal of MedicalEntomology,2013,50(6):1224-1230.)，约3.2mg/头；
所述猪粪采集自华中农业大学生猪精准饲养与饲料安全技术湖北省工程实验室。
实验在水虻转化容器(28cm×28cm×12cm)内进行，控制温室温度为27℃和环境相对湿度70％；
本发明中，无论是接种菌株还是接种幼虫，均是以物料的湿重计算的。
实施例1：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406的获得：
本发明的贝莱斯芽胞杆菌分离自亮斑扁角水虻幼虫肠道，革兰氏阳性杆状有芽胞，该菌株已于2020年12月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(B acillus velezensis)D2406，保藏编号：CCTCC NO：M2020874，地址：中国武汉武汉大学。
所述的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406具有常规的贝莱斯芽胞杆菌的形态特征和培养方式。
实施例2：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406的抑菌作用：
挑取指示菌单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养16h，取200μL指示菌发酵液加入到100mL即将凝固的LB固体培养基中，轻轻摇匀后倾注平板。挑取贝莱斯芽胞杆菌D2406单菌落接种到LB液体培养基中(以无菌LB液体培养基为空白对照)，28℃，180r/min震荡培养36h；取该菌发酵液上清(发酵液经8000人/min离心10min后，上清过0.22μm滤头，即得发酵液上清)200μL添加到指示菌平板上的牛津杯中，对角线2个平行。37℃静置培养。24h或48h后观察牛津杯周围是否有抑菌圈；
所述的指示菌为：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
结果如下：
贝莱斯芽胞杆菌发酵液在离体条件下能够显著抑制金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径约23mm，对照组无抑菌圈。
实施例3：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406在促进亮斑扁角水虻生长中的应用：
在新鲜猪粪中接种1％(v/w)的贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液(以接种等体积的LB液体培养基为对照)，将人工饲料饲养至6日龄的水虻幼虫接种到上述猪粪中(1500头/kg猪粪)，任其自由取食，待1％的幼虫开始预蛹后虫料分离，所述的贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液的有效菌浓度为109cfu/mL。
收获的幼虫与物料残渣用于检测分析物料减少率、水虻转化率和水虻增重率，并采用金黄色葡萄球菌选择性培养基(Baird-Parker琼脂)检测猪粪中自然存在的金黄色葡萄球菌丰度变化。
结果如下：
猪粪减少率、水虻幼虫转化率和增重率比较
Figure BDA0002851842800000041
注：平均值±标准差，n＝3，同一行数据不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下表同。
添菌组的猪粪减少率、水虻幼虫转化率、水虻幼虫增重率均显著高于对照组。添菌组的水虻幼虫增重率提高了11.00％，水虻幼虫转化率提高了2.00％，猪粪减少率提高了6.27％。
肠道微生物体内抑菌效果检测结果(log10)
Figure BDA0002851842800000042
添菌组的对新鲜猪粪中的金黄色葡萄球菌的抑制效果显著高于对照组，其金黄色葡萄球菌菌数比对照组降低了2个数量级。
实施例4：
贝莱斯芽胞杆菌D2406的挥发性物质的鉴定：
将贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液3mL装入容量为15mL的顶空瓶中(以装入3mL无菌LB液体培养基为对照)，采用PDMS萃取和GC-MS法检测发酵液中的挥发性有机化合物。
结果如下：
使用Carboxen/PDMS纤维柱萃取对照LB培养基后，经GC/MS检测得到的挥发性有机化合物，鉴定到6种物质；使用Carboxen/PDMS纤维柱萃取贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液后，经GC/MS检测得到的挥发性有机化合物，共鉴定到8种挥发性化合物，化合物名称及丰度见下表：
采用Carboxen/PDMS萃取贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液得到的挥发性有机化合物面积百分比
Figure BDA0002851842800000051
Figure BDA0002851842800000061
扣除背景峰后，肠道细菌B.velezensisD2406发酵液种特有的挥发性有机化合物有2种，分别为丙酮(Acetone)、2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethyl pyrazine)。
购买2,5-二甲基吡嗪标准品检测特有挥发性有机化合物抑菌效果：
平板对峙实验：
将贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)BS F-CL(CN106854627B)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmo nella enteritidis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、单核细胞增生李斯特氏菌(List eria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)BSFL-6(CN106987543A)、树状类芽胞杆菌(Paenibacillusdendritiformis)分别接种在对应的液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养过夜，制备发酵液。取各菌发酵液100μL加入到即将凝固的对应固体培养基中，轻轻摇匀后倾注平板。在培养基上均匀放置无菌滤纸片
Figure BDA0002851842800000062
分别吸取10μL有机试剂(2,5-二甲基吡嗪)滴于滤纸片上，封口膜封口后37℃恒温培养48h后观察。
熏蒸实验过程如下：
将贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)BS F-CL(CN106854627B)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmo nella enteritidis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、单核细胞增生李斯特氏菌(List eria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)BSFL-6(CN106987543A)、树状类芽胞杆菌(Paenibacillusdendritiformis)分别接种在对应的液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养过夜，制备发酵液。将1mL有机试剂(2,5-二甲基吡嗪)加入到24孔板中间一孔，在其四周8孔中分别加入2mL各菌对应无菌液体培养基，在培养基中接种50μL各菌发酵液，每株菌单独使用一个24孔板防止互相干扰。以不加有机试剂的处理作为对照组。37℃恒温培养48h后取各菌液在OD600检测吸光度。
结果如下：
通过平板对峙实验检测发现，2,5-二甲基吡嗪对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu s)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)BSFL-6(CN106987543A)、树状类芽胞杆菌(Paenibacillusdendr itiformis)具有明显的接触抑制作用，而对贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)BSF-CL(CN106854627B)无接触抑制作用。
其中，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)BSFL-6也为申请人前期自水虻肠道中分离出的有益菌，其能被同为分离自水虻肠道的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)D2406抑制，可能其并不同时存在于水虻肠道中；或者处于肠道中的不同的地位，作用互不影响。
熏蒸实验发现：2,5-二甲基吡嗪对金黄色葡萄球菌(P＝0.001)、肠炎沙门氏菌(P<0.001)、嗜水气单胞菌(P<0.001)、单核细胞增生李斯特氏菌(P＝0.021)、大肠杆菌(P＝0.039)、粘质沙雷氏菌BSFL-6(P<0.001)、树状类芽胞杆菌(P<0.001)具有显著的熏杀抑制作用，而对贝莱斯芽胞杆菌D2406(P＝0.695)、枯草芽胞杆菌BSF-CL(P＝0.520)无熏蒸抑制作用，这与触杀抑制结果一致。
实施例5：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)D2406定殖于亮斑扁角水虻肠道内发挥作用：
在无菌人工饲料中接种1％(v/w)的贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液(以接种相同体积的无菌LB液体培养基为对照)，将无菌人工饲料饲养至6日龄的无菌水虻幼虫接种到上述含有贝莱斯芽胞杆菌D2406发酵液的人工饲料中(150头/100g人工饲料)，任其自由取食，继续饲养8天后解剖取肠道进行研磨，采用PDMS萃取和GC-MS法检测肠道研磨液中的挥发性有机化合物是否含有2,5-二甲基吡嗪。
结果如下：
无菌水虻回接B.velezensisD2406后能够在肠道内检测出2,5-二甲基吡嗪，而在对照组无菌水虻体内未检测出该挥发性有机化合物，仅在相近时间点出现丰度极低的峰，通过GC/MS未能检测出是何种挥发性物质。推测在封闭的水虻肠道内2,5-二甲基吡嗪可以通过熏蒸作用对不同生态位上的致病菌(如金黄色葡萄球菌)产生抑制作用。因此B.velezensisD2406菌株产生的2,5-二甲基吡嗪通过接触和熏蒸作用能够有效拮抗金黄色葡萄球菌的扩增，且其具有较广的抑菌谱，对其他常见人畜共患致病菌也具有显著的抑制作用。
综上，来源于亮斑扁角水虻幼虫肠道的贝莱斯芽胞杆菌D2406，可以在离体条件下有效抑制金黄色葡萄球菌。贝莱斯芽胞杆菌D2406与亮斑扁角水虻幼虫联合转化猪粪等有机废弃物能够显著促进亮斑扁角水虻幼虫转化效率和显著消减畜禽粪便中的金黄色葡萄球菌。贝莱斯芽胞杆菌D2406产生的挥发性化合物2,5-二甲基吡嗪能够通过触杀和熏杀方式显著拮抗人畜共患致病细菌。
本发明可广泛应用于有机废弃物的处理，通过接种亮斑扁角水虻等资源昆虫的益生菌剂，促进资源昆虫对有机废弃物的资源化利用，生产高附加值的产品，并减轻或消除有机废弃物对环境造成的压力。

Claims (9)

1.一株分离的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），其保藏编号为CCTCC NO：M2020874。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在制备细菌抑菌剂中的应用，所述的细菌包括：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）或树状类芽胞杆菌（Paenibacillusdendritiformis）。
3.权利要求2所述的应用中的抑菌剂为触杀剂或熏杀剂。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在制备成水虻肠道抑菌剂中的应用。
5.权利要求2或4所述应用中的抑菌剂，其主效成分为2,5-二甲基吡嗪。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在促进水虻生长中的应用。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在制备成水虻生长促进剂中的应用。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在消减水虻转化物料中金黄色葡萄球菌丰度中的应用。
9.根据权利要求4或6或7或8所述的应用，所述的水虻为亮斑扁角水虻武汉品系。
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