CN112791229A - 一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料 - Google Patents

一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其组成为：8%透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1%丙二醇，其中透明质酸水凝胶的主要作用为覆盖伤口、保湿、缓释药物；绿原酸的主要作用为促进成纤维细胞增殖、促进成纤维细胞迁移、促进血管内皮细胞增殖；芍药苷的主要作用为促进血管内皮细胞迁移、促进新生血管形成、下调炎症反应；丙二醇的主要作用为防腐、杀菌、保湿。本发明制成可以从多方面促进伤口愈合的医用敷料，该敷料可以促进成纤维细胞增殖，促进血管生成，下调炎症反应，并且有止血、保湿的特性，涵盖了伤口愈合的各个方面，具有广泛的应用前景。

Description

一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料。
背景技术
皮肤可以保护身体免受外界伤害，感知环境变化，维持生理平衡，但也极易受到损伤。某些生理状态(如年龄、感染和严重损伤)或潜在的医疗条件(如缺血、糖尿病和肥胖)会干扰伤口愈合。与手术创伤、急性创伤和慢性疾病相关的皮肤修复和再生是医疗保健的中心问题。每年用于伤口护理的医疗保险费用估计从281亿美元到968亿美元，给全世界的医疗保健系统造成了严重的负担。值得注意的是，慢性创伤往往伴随着炎症、细胞功能障碍和血管生成障碍等并发症的发生，使医疗护理更加复杂，治疗费用增加，患者生活质量下降，因此迫切需要新的治疗策略。
伤口愈合是一个动态而有序的过程，包括止血、炎症、增殖和重塑(成熟)四个阶段。外科清创术、抗生素和伤口敷料仍然是伤口治疗的主要方式，但这些方式大多只针对一个方面，并且作用效果有限。医用敷料是包伤的用品，用于覆盖疮、伤口或其它损伤的医用材料。相比传统医用敷料，基于天然高分子生物材料的新型医用敷料具有较好的止血促凝作用、促细胞增殖能力及生物兼容性。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种绿原酸和芍药苷的药物联用机制，并将其和水凝胶载药体系结合，制备出一种用于糖尿病皮肤愈合的载药透明质酸水凝胶敷料。
本发明提出的一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，包括如下步骤：
S1选用去离子水20ml，然后在20ml去离子水中溶解0.5g透明质酸钠；
S2将去离子水和透明质酸钠搅拌均匀后加入3g己二酸二酰肼，然后，搅拌放置一夜，得到混合溶液；
S3将混合溶液用HCl调pH值至4.7，加入碳二亚胺盐酸盐0.4g，充分搅拌，使得溶液渐成凝胶状；
S4将凝胶用去无水乙醇在超声波清洗器中清洗3次，在用PBS在超声波清洗器中清洗3次；
S5将清洗后的凝胶进冷冻，冷冻后再置入冷冻真空干燥仪内冻干，制成干燥的凝胶块备用；
S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定；
S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定；
S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定；
S9将绿原酸、芍药苷溶于丙二醇中，再将溶有药物的丙二醇溶液溶解于PBS中，之后使用该溶液复溶透明质酸水凝胶干燥品，最终使其组成为：8％透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1％丙二醇。
优选的，所述步骤S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定的具体步骤为：
S1取在干燥的凝胶块，分成三组，分别称重；
S2在PH 7.4的磷酸缓冲液中溶胀；
S3每隔30min取出胶块，小心地吸干表面水分，然后测量胶块重量，直至胶块重量不变；
S4根据方程计算其溶胀率SR，方程式为：SR＝(Ws－Wd)/Wd，其中，Wd和Ws分别代表水凝胶干燥状态和溶胀状态的质量。
优选的，所述步骤S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定的具体步骤为：
S1取干燥的胶块称重，分别放入10mg/mL的BSA溶液中充分溶胀3天，使水凝胶达到溶胀和吸附平衡；
S2取出胶块，分别测量剩余的BSA溶液体积，Nanodrop测出其中的BSA浓度，计算水凝胶的载药量；
S3将载药的凝胶放入1mL新的PBS溶液中，每2h，Nanodrop测出溶液中的BSA的量，即得到牛血清蛋白的释放曲线。
优选的，所述水凝胶随时间释药的结果由累计释药方程来进行表征：累计释药量(wt％)＝Mt/M∞其中，Mt指的是在时间t内从水凝胶中释放出的BSA的量，M∞指的是水凝胶中载入的BSA的总量。
优选的，所述步骤S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定的具体步骤为：
S1取完全溶胀的水凝胶，放置于1mL 100u/ml的透明质酸酶溶液；
S2每24h取样一次，用咔唑显色，于530nm处测定吸收度，以HAse浓度为横坐标，吸收度为纵坐标做线性回归，计算直线的平均斜率。
本发明中，所述一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，制成可以从多方面促进伤口愈合的医用敷料，该敷料可以促进成纤维细胞增殖，促进血管生成，下调炎症反应，并且有止血、保湿的特性，涵盖了伤口愈合的各个方面，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本绿原酸和芍药苷对HUVECS血管生成的影响示意图；
图2为本绿原酸和芍药苷对巨噬细胞炎症因子表达的影响示意图；
图3为本发明透明质酸水凝胶的扫描电镜(TEM)结构示意图；
图4为本发明透明质酸水凝胶的溶胀率示意图；
图5为本发明透明质酸水凝胶的缓释率示意图；
图6为本发明透明质酸水凝胶的抗酶解能力示意图；
图7为本糖尿病大鼠皮肤愈合率示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参照图1-7，一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，包括如下步骤：
S1选用去离子水20ml，然后在20ml去离子水中溶解0.5g透明质酸钠；
S2将去离子水和透明质酸钠搅拌均匀后加入3g己二酸二酰肼，然后，搅拌放置一夜，得到混合溶液；
S3将混合溶液用HCl调pH值至4.7，加入碳二亚胺盐酸盐0.4g，充分搅拌，使得溶液渐成凝胶状；
S4将凝胶用去无水乙醇在超声波清洗器中清洗3次，在用PBS在超声波清洗器中清洗3次；
S5将清洗后的凝胶进冷冻，冷冻后再置入冷冻真空干燥仪内冻干，制成干燥的凝胶块备用；
S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定；
S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定；
S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定；
S9将绿原酸、芍药苷溶于丙二醇中，再将溶有药物的丙二醇溶液溶解于PBS中，之后使用该溶液复溶透明质酸水凝胶干燥品，最终使其组成为：8％透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1％丙二醇。
本发明中，步骤S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定的具体步骤为：
S1取在干燥的凝胶块，分成三组，分别称重；
S2在PH 7.4的磷酸缓冲液中溶胀；
S3每隔30min取出胶块，小心地吸干表面水分，然后测量胶块重量，直至胶块重量不变；
S4根据方程计算其溶胀率SR，方程式为：SR＝(Ws－Wd)/Wd，其中，Wd和Ws分别代表水凝胶干燥状态和溶胀状态的质量。
本发明中，步骤S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定的具体步骤为：
S1取干燥的胶块称重，分别放入10mg/mL的BSA溶液中充分溶胀3天，使水凝胶达到溶胀和吸附平衡；
S2取出胶块，分别测量剩余的BSA溶液体积，Nanodrop测出其中的BSA浓度，计算水凝胶的载药量；
S3将载药的凝胶放入1mL新的PBS溶液中，每2h，Nanodrop测出溶液中的BSA的量，即得到牛血清蛋白的释放曲线。
本发明中，水凝胶随时间释药的结果由累计释药方程来进行表征：累计释药量(wt％)＝Mt/M∞其中，Mt指的是在时间t内从水凝胶中释放出的BSA的量，M∞指的是水凝胶中载入的BSA的总量。
本发明中，步骤S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定的具体步骤为：
S1取完全溶胀的水凝胶，放置于1mL 100u/ml的透明质酸酶溶液；
S2每24h取样一次，用咔唑显色，于530nm处测定吸收度，以HAse浓度为横坐标，吸收度为纵坐标做线性回归，计算直线的平均斜率。
绿原酸可以明显提高小鼠成纤维细胞L929的细胞活力和人脐静脉上皮细胞HUVECS的细胞活力，而芍药苷无明显作用；绿原酸和芍药苷联合给药时，无显著的最优比例，与整体给药浓度相关；绿原酸和芍药苷都可以促进人脐静脉上皮细胞HUVECS的迁移，连用时也可以促进HUVECS的迁移；绿原酸可以促进小鼠成纤维细胞L929的迁移，而芍药苷无明显作用，同时连用时也可以促L929进细胞迁移；绿原酸(50μM)和芍药苷(50μM)都可以促进人脐静脉上皮细胞HUVECS的在基质胶上形成血管，连用时也可以促进HUVECS的血管生成。
实施例二
透明质酸水凝胶的制备，20ml去离子水加入透明质酸钠(1800-2200kDa)0.2g，搅拌均匀后加入己二酸二酰肼1.4g，搅拌过夜；用HCl调pH值至4.7，加入碳二亚胺盐酸盐0.4g，充分搅拌，溶液渐成凝胶状；将凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，用NaOH调pH值到7，于-20℃冰箱预冷；置于冷冻真空干燥仪内冻干，置于真空干燥器中备用，使用时用去离子水配制成8％的水凝胶。
实施例三
细胞活力检测，调整细胞密度为2×104个/mL，96孔板除边缘外的每个孔中加入100μL，使每孔细胞数为2000个，十字振荡混匀，边缘孔加入200μL培养基；孵箱培养过夜，待细胞贴壁给药，将96孔板中接种细胞的孔弃液，1640完全培养基溶液浓度依次从小到大加入孔中，每孔180μL(设5副孔为一组，每弃一组加入一个浓度梯度药物)，对照组加入180μL含10％FBS的1640培养基，空白组加50μL DMSO，孵箱培养24h。.给药组、对照组、空白组每孔加入20μLMTT溶液，轻敲板底，使壁上的液滴落入孔底；孵箱孵育4h；用注射器将每孔液体吸出弃掉，每孔加入150μL DMSO溶解蓝紫色甲臜；微孔板恒温振荡器，37℃，500rpm孵育10min；紫外可见光分光光度计，检测570nm的吸光度；增值率＝[OD给药组-OD空白组]/[OD对照组-OD空白组]×100％。
实施例四
平板划痕实验，9.调整细胞密度为4×105个/mL，6孔板每个孔中加入1mL，使每孔细胞数为4×105个，再加入1mL含10％FBS的1640培养基，十字振荡混匀。孵箱培养过夜，待细胞贴壁，将爬满6孔板底部的细胞弃液，1mL PBS清洗，重复三次；使用1mL枪头纵向笔直划出一条划痕；1mL PBS清洗，重复三次，洗掉脱落的细胞；分别加入不同浓度的药物溶液2mL，每个浓度三副孔，对照组加入2mL 1640培养基；孵箱培养24h后，镜下观察拍照，取中间位置视野，用显微镜的卡尺测量划痕的宽度；迁移率＝W给药/W对照×100％。
实施例五
新生血管诱导实验，Matrigel冰上冻融；枪头预冷，EP管预冷，matrigel混匀后取出1.2mL分装，整个过程冰上操作，其余放回-20℃储存；24孔板预冷，每孔加入200μLmatrigel，冰上操作，注意不要有气泡；
孵箱中放置45min，待matrigel凝固；取对数生长期的HUVEC细胞，消化，离心，1mL含10％FBS的1640培养基重悬；计数，调整密度为1×106个/mL；向铺有matrigel的24孔板中加入100μL，使每孔细胞个数为1×105个；给药组加入不同浓度药物，对照组加入100μL1640完全培养基，每组3个副孔，轻轻振荡混匀；孵箱中孵育4h后，镜下观察血管形成情况。
实施例6
取SPF级别4周龄C57/BL雄性小鼠，从股骨和胫骨处获得BMDM，在含10％FBS、1％双抗、20ng/mL M-CSF的高糖DMEM、5％CO2、37℃培养。在培养第5天换为含有100ng/mL LPS、20ng IFN-γ和20ng/mL M-CSF的高糖DMEM，将BMDM诱导为M1型巨噬细胞。
实施例七
大鼠全层皮肤损伤模型的建立，雄性Wistar大鼠，6周龄，体重在220g，常温饲养，昼夜交替，自由摄食饮水。禁食12至16h，不禁水。链脲佐菌素55mg/kg体重腹腔注射，对照组动物腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲液，剪去尾尖取血测定血糖浓度。1周后糖尿病大鼠表现多饮、多食、多尿和体重明显减轻，血糖值≥14mmol/L者列入糖尿病动物。手术当天将大鼠背部备皮，温水清洗，拭干，以10％水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，于背部脊柱旁每侧1cm各剪去直径为2cm的创面两个，每个面积为3.14cm2，创面距离均为2.0cm，背部共四个创面，创面深达筋膜层，但不损伤皮下脉管系统，生理盐水冲洗切口，擦净积液。创面制作后不作包扎，待清醒后于高压灭菌垫料中单笼标准饲养环境饲养,自由摄食饮水，造模后每日给予伤口对应药物，每日测量伤口面积，并计算愈合率，第3，7，14天分别处死大鼠，取背部愈合组织样本，包括周围2mm完整皮肤，进行后续分子生物学实验。
本发明：选用去离子水20ml，然后在20ml去离子水中溶解0.5g透明质酸钠；将去离子水和透明质酸钠搅拌均匀后加入3g己二酸二酰肼，然后，搅拌放置一夜，得到混合溶液；将混合溶液用HCl调pH值至4.7，加入碳二亚胺盐酸盐0.4g，充分搅拌，使得溶液渐成凝胶状；将凝胶用去无水乙醇在超声波清洗器中清洗3次，在用PBS在超声波清洗器中清洗3次；将清洗后的凝胶进冷冻，冷冻后再置入冷冻真空干燥仪内冻干，制成干燥的凝胶块备用；对干燥的凝胶块进行溶胀率测定；对干燥的凝胶块进行药物释放测定；对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定；绿原酸、芍药苷溶于丙二醇中，再将溶有药物的丙二醇溶液溶解于PBS中，之后使用该溶液复溶透明质酸水凝胶干燥品，最终使其组成为：8％透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1％丙二醇，制得载药透明质酸水凝胶。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其特征在于，包括8％透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1％丙二醇，具体制备步骤如下：
S1选用去离子水20ml，然后在20ml去离子水中溶解0.5g透明质酸钠；
S2将去离子水和透明质酸钠搅拌均匀后加入3g己二酸二酰肼，然后，搅拌放置一夜，得到混合溶液；
S3将混合溶液用HCl调pH值至4.7，加入碳二亚胺盐酸盐0.4g，充分搅拌，使得溶液渐成凝胶状；
S4将凝胶用去无水乙醇在超声波清洗器中清洗3次，在用PBS在超声波清洗器中清洗3次；
S5将清洗后的凝胶进冷冻，冷冻后再置入冷冻真空干燥仪内冻干，制成干燥的凝胶块备用；
S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定；
S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定；
S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定；
S9将绿原酸、芍药苷溶于丙二醇中，再将溶有药物的丙二醇溶液溶解于PBS中，之后使用该溶液复溶透明质酸水凝胶干燥品，最终使其组成为：8％透明质酸水凝胶、500μM绿原酸、500μM芍药苷、1％丙二醇。
2.根据权利要求1所述的一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其特征在于，所述步骤S6对干燥的凝胶块进行溶胀率测定的具体步骤为：
S1取在干燥的凝胶块，分成三组，分别称重；
S2在PH 7.4的磷酸缓冲液中溶胀；
S3每隔30min取出胶块，小心地吸干表面水分，然后测量胶块重量，直至胶块重量不变；
S4根据方程计算其溶胀率SR，方程式为：SR＝(Ws－Wd)/Wd，其中，Wd和Ws分别代表水凝胶干燥状态和溶胀状态的质量。
3.根据权利要求1所述的一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其特征在于，所述步骤S7对干燥的凝胶块进行药物释放测定的具体步骤为：
S1取干燥的胶块称重，分别放入10mg/mL的BSA溶液中充分溶胀3天，使水凝胶达到溶胀和吸附平衡；
S2取出胶块，分别测量剩余的BSA溶液体积，Nanodrop测出其中的BSA浓度，计算水凝胶的载药量；
S3将载药的凝胶放入1mL新的PBS溶液中，每2h，Nanodrop测出溶液中的BSA的量，即得到牛血清蛋白的释放曲线。
4.根据权利要求3所述的一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其特征在于，所述水凝胶随时间释药的结果由累计释药方程来进行表征：累计释药量(wt％)＝Mt/M∞其中，Mt指的是在时间t内从水凝胶中释放出的BSA的量，M∞指的是水凝胶中载入的BSA的总量。
5.根据权利要求1所述的一种含有绿原酸、芍药苷的透明质酸水凝胶医用敷料，其特征在于，所述步骤S8对完全溶胀的水凝胶进行外抗酶解酶降解测定的具体步骤为：
S1取完全溶胀的水凝胶，放置于1mL 100u/ml的透明质酸酶溶液；
S2每24h取样一次，用咔唑显色，于530nm处测定吸收度，以HAse浓度为横坐标，吸收度为纵坐标做线性回归，计算直线的平均斜率。
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