CN112779191B - 一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用，该选育方法基于等离子体处理技术，并以高硫化物条件为筛选压力，利用梯度硫化物浓度的平板，选择得到多个完整的菌落，通过高浓度硫化物的培养，考察各菌株硫氧化性能的变化，并通过呼吸测定方法测定细胞硫氧化性能，最后筛选出一株目的菌株。该选育方法能够选育出脱硫性能好，处理效率高的菌株，与野生菌株对比表明，选育出的菌株的硫氧化性能提高，硫酸根积累显著降低，单质硫生成率提高，使得系统能耗低，运行成本低，有力的促进生物脱硫的深入推广，增强了生物脱硫的鲁棒性，为生物脱硫技术应对实际应用中气体成分复杂多变的问题提供了非常有价值的思路。

Description

一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用。
背景技术
生物脱硫是在常温常压下利用具有硫氧化性能的微生物将水中的硫化物去除的技术。利用此法可以将天然气、沼气中的H2S除去。生物脱硫工艺的脱硫能力往往和硫氧化微生物的脱硫性能有直接关系，此外，在实际情况中，生产条件的变化使得气体中硫化氢的含量出现波动性变化，一旦遇到硫化氢情况，极有可能对脱硫系统造成一定的冲击，影响生产的正常运行。因此，高性能的菌株可以有效降低意外情况的风险，同时还可以提高系统运行的稳定性，降低系统运行成本，对推进生物脱硫的工业应用有重要意义。
例如CN107881189A公开了一种有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌硫氧化能力的方法，是以如下方式实现：(1)构建重组菌A.ferrooxidans，实现增加酰基高丝氨酸内酯合成酶基因的拷贝数，通过过表达afeI基因增加酰基高丝氨酸内酯(AHL)的含量，达到提高A.ferrooxidans的硫氧化能力；或(2)在野生型A.ferrooxidans培养过程中，添加5.4×103～10×103mg/mL量外源的酰基高丝氨酸内酯(AHL)，通过增加AHL含量达到提高A.ferrooxidans的硫氧化能力。
又例如CN111996134A公开了一种嗜盐嗜碱性硫氧化复合菌剂及其制备方法和在生物脱硫中的应用，所述嗜盐嗜碱性硫氧化复合菌剂包括硫碱弧菌、硫微螺菌和硫碱杆菌。本发明嗜盐嗜碱性硫氧化复合菌剂具有氧化硫化物生成单质硫的能力，单质硫产率能达到85％以上，硫化物的去除率达到99％以上；该嗜盐嗜碱性硫氧化复合菌剂能够更好地满足工业脱硫的需求，其单质硫生成率和硫化物脱除率等指标达到或超过单一菌株，可以拓展生物脱硫技术应用范围，增强应对复杂工况的能力，提高系统稳定性，强化脱硫效果。
但现有技术中具有高硫氧化性能的脱硫菌株还比较少，关于如何选育高硫氧化性能的脱硫菌株的策略也鲜少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法，所述选育方法包括如下步骤：
(1)将野生脱硫菌菌液涂布于含硫化物的固体培养基上进行等离子体处理，处理后的培养皿进行培养；
(2)挑选单一的、形态完整的菌落分别接种于TDS液体培养基和TD液体培养基中，震荡培养，记录OD值，以野生脱硫菌作为对照，选择两种模式下OD值均偏高的菌液相应的克隆作为疑似菌株；
(3)将步骤(2)筛选的疑似菌株分别接种于梯度硫化物浓度液体培养基中进行培养，以野生脱硫菌作为对照，测定液体中硫化物的含量变化；将步骤(2)筛选的疑似菌株进行洗涤，然后进行生物硫氧化性能测定，以野生脱硫菌作为对照；综合上述测定结果，筛选出所述高硫氧化性能脱硫菌株。
本发明所涉及的高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法基于等离子体处理技术，并以高硫化物条件为筛选压力，利用梯度硫化物浓度的平板，选择得到多个完整的菌落，通过高浓度硫化物的培养，考察各菌株硫氧化性能的变化，并通过呼吸测定方法测定细胞硫氧化性能，最后筛选出一株目的菌株。该选育方法能够选育出脱硫性能好，处理效率高的菌株，与野生菌株对比表明，选育出的菌株的硫氧化性能提高了16.4％，硫酸根积累显著降低，单质硫生成率提高了9.6％，使得系统能耗低，运行成本低，有力的促进生物脱硫的深入推广，增强了生物脱硫的鲁棒性，为生物脱硫技术应对实际应用中气体成分复杂多变的问题提供了非常有价值的思路。
优选地，步骤(1)所述野生脱硫菌选自下述任意一种属：Thiobacillus、Thioalkalivibrio、Thioalkalibacter、Thiomicrospira。
优选地，步骤(1)所述野生脱硫菌菌液中细菌密度为104-106cfu/mL，例如104cfu/mL、5×104cfu/mL、105cfu/mL、5×105cfu/mL或106cfu/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述野生脱硫菌在进行涂布前进行预处理：将野生脱硫菌培养后低速离心去除硫颗粒，上清液再次离心收集细菌，洗涤细菌，调整细菌密度。
优选地，所述培养在100-200rpm(例如100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm等)、28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)下TD培养基中进行28-32h(例如28h、29h、30h、31h、32h等)，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述低速离心的速率为800-1200rpm，例如800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm或1200rpm等，时间为1-3min，例如1min、1.5min、2min、2.5min、3min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述再次离心的速率为7000-9000rpm，例如7000rpm、7500rpm、8000rpm、8500rpm、9000rpm等，时间为3-7min，例如3min、4min、5min、6min、7min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述等离子体处理的工作电压为1-10V，例如1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V、8V、9V、10V等，电流为0.1-1.0A，例如0.1A、0.2A、0.3A、0.4A、0.5A、0.6A、0.7A、0.8A、0.9A、1.0A等，处理时间为1-10min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述等离子体处理时调节电极的位置，使上下电极之间的距离为2.5-3.5mm，例如2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3.0mm、3.2mm、3.4mm、3.5mm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述培养在28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)下进行7天。
优选地，步骤(2)所述震荡培养在28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)下进行20-80h(例如20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h等)，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述OD值在600nm处测定。
优选地，步骤(3)所述硫化物浓度梯度范围为10-150mmol/L，例如10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述疑似菌株在接种前在150-180rpm(例如150rpm、160rpm、170rpm、180rpm等)、28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)下培养65-75h(例如65h、67h、68h、69h、70h、72h、74h、75h等)。上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述生物硫氧化性能测定的方法为呼吸测定。
优选地，所述呼吸测定中无硫磺细胞液的生物量的使用浓度为0-10mg·N·L-1，例如1mg·N·L-1、2mg·N·L-1、3mg·N·L-1、4mg·N·L-1、5mg·N·L-1、7mg·N·L-1、8mg·N·L-1、10mg·N·L-1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法筛选得到的菌株。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法在对含硫化物气体或液体的生物脱硫中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法基于等离子体处理技术，并以高硫化物条件为筛选压力，利用梯度硫化物浓度的平板，选择得到多个完整的菌落，通过高浓度硫化物的培养，考察各菌株硫氧化性能的变化，并通过呼吸测定方法测定细胞硫氧化性能，最后筛选出一株目的菌株。该选育方法能够选育出脱硫性能好，处理效率高的菌株，与野生菌株对比表明，选育出的菌株的硫氧化性能提高了16.4％，硫酸根积累显著降低，单质硫生成率提高了9.6％，使得系统能耗低，运行成本低，有力的促进生物脱硫的深入推广，增强了生物脱硫的鲁棒性，为生物脱硫技术应对实际应用中气体成分复杂多变的问题提供了非常有价值的思路。
附图说明
图1是野生脱硫菌株和五种候选菌株的脱硫率的对比图；
图2是野生脱硫菌株和选育出的高硫氧化性能脱硫菌株的呼吸速率对比图；
图3是30mmol硫化物浓度下，野生脱硫菌株和选育出的高硫氧化性能脱硫菌株的硫酸根生成率对比图；
图4是30mmol硫化物浓度下，野生脱硫菌株和选育出的高硫氧化性能脱硫菌株的单质硫积累速率对比图；
图5是野生脱硫菌株和选育出的高硫氧化性能脱硫菌株消耗及生成含硫物质比率的对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的野生脱硫菌株D301的保藏信息如下：
多能硫碱弧菌(Thioalkalivibrio versutus)D301菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2013年11月25日，保藏编号为CGMCCNo.8497。
除另有说明，下述实施例所涉及的TD培养基成分(在1L水中)：
Na2CO3 46g、NaHCO3 23g、Na2S2O3·5H2O 19.82g、KNO3 0.505g、K2HPO4·3H2O 2g、NH4Cl 0.268g、MgCl2 0.1g、Trace 2mL。pH为自然。
除另有说明，下述实施例所涉及的TDS培养基成分(在1L水中)：
Na2CO3 46g、NaHCO3 23g、KNO3 0.505g、K2HPO4·3H2O 2g、NH4Cl 0.268g、MgCl20.1g、Trace 2mL。pH为自然。Na2S·9H2O根据实验需求进行调整，过滤灭菌方式加入。固体培养基含2％琼脂。
下述实施例所涉及的硫化合物的测定方法：
S2-利用国标亚甲基蓝法；S2O3 2-与SO4 2-的测定利用离子色谱法；单质硫的浓度通过硫平衡计算。
下述实施例所涉及的呼吸测定的方法：呼吸测定在一个装有溶氧电极和搅拌磁子的7.5mL密封玻璃小瓶中进行。将获得的无硫细胞液加入到碳酸根缓冲溶液中(pH9.0)达到终浓度为15mg NL-1。该溶液用空气吹5分钟，以到达氧饱和状态。然后在小瓶中加入一定浓度的硫化物，反应开始。实时测定DO降低情况。使用初始斜率(d[O2]/dt0)作为氧化速率的度量。此外，不加入细胞的情况下再重复一次实验，测定化学氧化的速率。将两次结果相减，得到生物氧化速率的值。
实施例1
本实施例提供一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法，如下所示：
(1)将野生脱硫菌株D301接种至TD培养基中，在180rpm和30℃下培养30小时，先通过在1000rpm，2min下低速离心去除硫颗粒，然后将上清液转移至新离心管中，在8000rpm和5min的条件下离心收集细胞，然后用干净的TD培养基悬浮，洗涤细胞，离心收集。在用TD培养基悬浮细胞，调光密度OD600为1.0，稀释到细胞密度为105cfu/mL。
(2)取上述0.1mL稀释后的菌液涂布于含120mmol/L的硫化物的TDS固体培养基上，再进行等离子体处理。调节电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3mm，调节电压3V和电流0.5A，使气体产生放电，得到均匀的空气介质阻挡放电等离子体。持续放电处理3分钟，处理后的培养皿放置于30℃培养7天。
(3)在平板上用牙签挑选单一的，形态完整的菌落，分别逐个点在含有TDS培养基的72孔板和含有TD培养基的72孔板中，并以野生菌株作为对照进行同样操作，在30℃下震荡培养，记录24、48、72h三个时间点600nm下的吸光度(OD)值，最后，选择两种模式下，OD都显著偏高的菌液相应的克隆作为疑似高性能菌株，筛选得到5株疑似菌株，分别命名为D303、D305、D307、D309、D311。
(4)将(3)中所筛选的的克隆接种到TD培养液中，在180rpm下培养72小时。然后，将培养好的菌液分别接种到新的含硫化物浓度分别为30、60、90、120mmol/LTDS液体培养基中进行培养，野生型菌株作为对照，测定液体中硫化合物的变化，结果如图1所示，由图可知：随着硫化氢的浓度的上升，6株菌株出现不同程度的硫氧化抑制，然而，D309显示出了最好的高浓度硫化物耐受性。
(5)将(3)所述的培养液进行收集，并按照(1)的方法进行细胞洗涤，制备无硫磺细胞液，最后制成15mg·N·L-1的生物量的细胞液。利用该细胞液进行生物硫氧化性能的呼吸测定，野生型为对照，结果如图2所示，由图可知：D309的硫氧化速率明显高于野生菌株D301，D309的呼吸作用变得更加高效。
(6)最后综合上述步骤(4)和(5)的结果，选择出硫氧化性能最高，硫化物耐受最好，硫酸根积累最少，生物硫磺生成率最高的菌株即D309，即高硫氧化性能脱硫菌株。
进一步地，将野生菌株D301和高硫氧化性能脱硫菌株D309的硫酸根积累和单质硫生成率进行对比，分别如图3和图4所示，由图可知：被氧化的硫化物中，D301将氧化的硫化物的73％转化成了硫酸根，而D309仅有54％的转化率，相应地，D309积累硫磺的能力更强。
实施例2
本实施例对野生型菌株D301和实施例1筛选出的高硫氧化性能脱硫菌株D309进行生物脱硫性能验证。
实验室设备为有效体积1L的气升式反应器，通过蠕动泵将含90mmol/L硫化物的TDS培养基加入反应器中，进行硫氧化反应器。实验温度为30℃，水力停留时间为160min，通气量为1.0L/min。
两株脱硫菌性能对比结果如图5所示：D309的硫化物脱出率达到92％，脱硫能力较D301增加了16.4％。相应地，D309的单质硫生成率增加了9.6％，达到91％，而硫酸根的生成率降低仅有5％。因此，在反应器脱硫实验室中，D309表现更显著的优势。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明一种高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (12)

1.一种高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，所述高硫氧化性能脱硫菌株的选育方法包括如下步骤：
(1)将野生脱硫菌Thioalkalivibrio在100-200rpm、28-32℃下TD培养基中进行28-32h培养后，低速离心去除硫颗粒，上清液再次离心收集细菌，洗涤细菌，调整细菌密度得到菌液，菌液涂布于含硫化物的固体培养基上进行等离子体处理，处理后的培养皿进行培养；等离子体处理的工作电压为1-10V，电流为0.1-1.0A，处理时间为1-10min，调节电极的位置，使上下电极之间的距离为2.5-3.5mm；所述野生脱硫菌的保藏编号为CGMCC No.8497；
(2)挑选单一的、形态完整的菌落分别接种于TDS液体培养基和TD液体培养基中，震荡培养，记录OD值，以野生脱硫菌作为对照，选择两种模式下OD值均比野生脱硫菌高的菌液相应的克隆作为疑似菌株；
(3)将步骤(2)筛选的疑似菌株分别接种于梯度硫化物浓度液体培养基中进行培养，以野生脱硫菌作为对照，测定液体中硫化物的含量变化；将步骤(2)筛选的疑似菌株进行洗涤，然后进行生物硫氧化性能测定，以野生脱硫菌作为对照；综合上述测定结果，筛选出所述高硫氧化性能脱硫菌株；
所述TDS液体培养基的配方为：在1L水中，含有Na2CO3 46g、NaHCO3 23g、KNO3 0.505g、K2HPO4·3H2O 2g、NH4Cl 0.268g、MgCl2 0.1g、Trace 2mL，Na2S·9H2O，pH自然；
所述TD液体培养基的配方为：在1L水中，含有Na2CO3 46g、NaHCO3 23g、Na2S2O3·5H2O19.82g、KNO3 0.505g、K2HPO4·3H2O 2g、NH4Cl 0.268g、MgCl20.1g、Trace 2mL，pH自然。
2.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(1)所述野生脱硫菌菌液中细菌密度为104-106cfu/mL。
3.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，所述低速离心的速率为800-1200rpm，时间为1-3min。
4.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，所述再次离心的速率为7000-9000rpm，时间为3-7min。
5.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(1)所述处理后的培养皿进行培养在28-32℃下进行7天。
6.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(2)所述震荡培养在28-32℃下进行20-80h。
7.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(2)所述OD值在600nm处测定。
8.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(3)所述硫化物浓度梯度范围为10-150mmol/L。
9.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(3)所述疑似菌株在接种前在150-180rpm、28-32℃下培养65-75h。
10.如权利要求1所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，步骤(3)所述生物硫氧化性能测定的方法为呼吸测定。
11.如权利要求10所述的高硫氧化性能脱硫菌株，其特征在于，所述呼吸测定中无硫磺细胞液的生物量的使用浓度为0-10mg·N·L-1。
12.如权利要求1-11中任一项所述的高硫氧化性能脱硫菌株在对含硫化物气体或液体的生物脱硫中的应用。
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