CN112760326A

CN112760326A - 水稻OsPPR035的基因及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN112760326A
Application number: CN202011480398.5A
Authority: CN
Inventors: 夏辉; 熊杰; 李朝阳; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112760326B

Abstract

本发明提供了一种从水稻DNA中分离克隆的与水稻抗逆相关的OsPPR035基因。该基因编码的蛋白含有PPR(pentatricopeptide repeat)家族保守的结构域，参与线粒体基因的RNA编辑。OsPPR035基因表达响应渗透胁迫与盐胁迫下调表达。OsPPR035的敲除突变体降低了线粒体基因rps4‑406和orfX‑926这两个位点的RNA编辑效率，增强水稻植株的脯氨酸含量，可以提高水稻的抗旱性与耐盐性。本发明的水稻OsPPR035基因对逆境胁迫产生明显响应，其敲除突变体具有可通过渗透调节机制增强水稻的抗旱性与耐盐性，可应用于改良栽培稻的抗逆能力，培育节水抗旱稻。

Description

水稻OsPPR035的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种与水稻生产及抗逆性相关的基因，具体涉及一种新的与水稻苗期耐旱性与耐盐性相关的基因OsPPR035及其应用。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物，为全球超过50％的人口提供粮食。但水稻需水量大，对干旱敏感，干旱缺水严重影响了水稻的生长、发育和生产，导致水稻减产甚至绝收。利用现代生物学技术研究作物抗旱的生理、生化反应及其遗传学机制，克隆重要的抗旱基因，进而通过传统育种方式或现代生物技术转入到作物中改良其抗旱性，培育抗旱水稻新品种，是在全球日益严峻的干旱缺水问题下保障水稻生产、缓解粮食安全问题的有效途径。

植物在长期的进化过程中演化出一系列的适应机制来应对干旱胁迫。植物在遭遇干旱或渗透胁迫时，会调动体内的渗透调节机制，通过增加细胞内的渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性糖等，提高植物细胞的渗透势，从而保护细胞在干旱条件下失水，是一种重要的避旱性机制。同时渗透调节机制也在植物耐盐中发挥重要作用。

线粒体是植物细胞内最重要的能量代谢场所之一，也是细胞内最重要的ROS代谢场所，所以它既能影响到植物正常的生长发育与繁殖(作物产量)，同时又通过逆行信号，调控植物逆境响应。因此，线粒体在作物生产与抗逆中均发挥着重要作用。

线粒体的成熟与行使正常功能很大程度上依赖于线粒体基因转录后的RNA编辑。RNA 编辑是指在基因转录产生的mRNA分子水平上发生的碱基变化，包括核苷酸的插入、缺失和置换等不同方式，导致其翻译产生的蛋白质氨基酸组成也发生变化的现象。在高等植物中，线粒体基因的RNA编辑主要以C-U的变化为主。目前已在水稻线粒体上发现了491个编辑位点，涉及几乎所有重要蛋白编码基因。

线粒体基因的RNA编辑通常需要核编码的PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白的参与。 PPR蛋白是一个保守的蛋白家族，具有35个简并氨基酸作为重复单元串联排列组成的蛋白。它是一种RNA结合蛋白，由核基因编码，转录后进入线粒体参与线粒体基因转录后的编辑、剪接。目前，已在水稻基因组中鉴定出491个编码PPR蛋白的基因。这些PPR基因中，分别有下75个和73个在盐胁迫和干旱胁迫下表达上调，说明水稻中的PPR蛋白可能参与逆境胁迫。

PPR蛋白介导的线粒体基因的RNA编辑在植物生长发育和环境适应中的发挥着重要作用。目前，针对植物线粒体RNA编辑相关的PPR基因功能机制的研究主要集中在拟南芥、玉米和水稻中，分别由43个、10个与4个。这些PPR基因大多数都与植物的生长和发育相关；被证实与植物抗逆相关的PPR基因仅有7个，包括5个拟南芥PPR基因与2个水稻PPR 基因。其中，水稻PPR基因Rf5，它能够抑制ORFH79蛋白的积累，改善根系统的发育，对干旱和盐胁迫的耐受性也有所增加，抵御一定的逆境胁迫。另外，水稻PPR基因WSL的功能缺失突变体对ABA、盐表现出超敏反应。

本发明中的OsPPR035基因，克隆自水稻第1号染色体，响应ABA、渗透胁迫与双氧水处理。利用的CRISPR-Cas9技术创制的OsPPR035功能缺失突变体细胞脯氨酸含量升高，且抵抗渗透胁迫与盐胁迫的能力显著增强。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种用于水稻OsPPR035的基因，并寻求其在抗逆性中的应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

水稻OsPPR035基因在调控水稻抗逆性中的应用，所述水稻OsPPR035基因的序列选自：

SEQ ID NO:1所示的DNA序列；或

与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；或

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

在其中一些实施例中，所述水稻OsPPR035基因为SEQ ID NO:1所示的DNA序列基于CRISPR-Cas9技术的敲除突变体。

在其中一些实施例中，所述敲除突变体选自突变体1、突变体2或突变体3；

所述突变体1在水稻OsPPR035基因转录起始子后第632处有1个碱基的插入，第882处有2个碱基的缺失；

所述突变体2在水稻OsPPR035基因转录起始子后第632处有3个碱基的插入，第883处有1个碱基的缺失；

所述突变体3在水稻OsPPR035基因转录起始子后第632处有1个碱基的缺失，第883处有2个碱基的缺失。

在其中一些实施例中，所述调控水稻抗逆性为：提高苗期耐旱性与耐盐性。

在其中一些实施例中，通过提高渗透调节能力和/或脯氨酸含量提高苗期耐旱性与耐盐性。

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR035的基因编码的蛋白，具体技术方案如下：

水稻OsPPR035基因编码的蛋白在调控水稻抗逆性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体中的一种，或者所述蛋白由上述任一项所述的水稻OsPPR035基因编码得到。

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR035的基因的定点编辑系统，具体技术方案如下：

一种水稻OsPPR035基因的定点编辑系统，其特征在于，包括：sgRNA靶点序列、靶序列引物、边切边连反应体系和重组载体；

所述sgRNA靶点序列为：SEQ ID NO:7；

所述靶序列引物包括：SEQ ID NO:8-11。

在其中一些实施例中，所述重组载体为Ti质粒或植物病毒载体。

在其中一些实施例中，所述重组载体为线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR035的基因的定点编辑的工程菌，具体技术方案如下：

一种工程菌，所述工程菌为含有如上述的水稻OsPPR035基因的定点编辑系统。

在其中一些实施例中，所述工程菌为农杆菌EHA105。

本发明的目的还在于提供一种具有抗逆性的水稻，具体技术方案如下：

一种具有抗逆性的水稻，其特征在于，包含如上所述的水稻OsPPR035基因，或如上所述的水稻OsPPR035基因编码的蛋白。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明中的OsPPR035基因，克隆自水稻第1号染色体，响应ABA、渗透胁迫与双氧水处理。本发明利用的CRISPR-Cas9技术创制的OsPPR035功能缺失突变体细胞脯氨酸含量升高，且抵抗渗透胁迫与盐胁迫的能力显著增强。

本发明从水稻DNA中分离克隆的与水稻抗逆相关的OsPPR035基因。该基因编码的蛋白含有PPR(pentatricopeptide repeat)家族保守的结构域，参与线粒体基因的RNA编辑。 OsPPR035基因表达响应渗透胁迫与盐胁迫下调表达。OsPPR035的敲除突变体降低了线粒体基因rps4-406和orfX-926这两个位点的RNA编辑效率，增强水稻植株的脯氨酸含量，可以提高水稻的抗旱性与耐盐性。本发明的水稻OsPPR035基因对逆境胁迫产生明显响应，其敲除突变体具有可通过渗透调节机制增强水稻的抗旱性与耐盐性，可应用于改良栽培稻的抗逆能力，培育节水抗旱稻。

附图说明

图1为本发明利用ClustalW2软件将OsPPR035(基因号：Os01g0651100或 LOC_Os01g46230)基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；

图2为本发明的OsPPR035基因在水稻苗期正常培养与受到外源ABA、PEG、NaCl、H₂O₂处理时的表达水平；

图3为本发明的OsPPR035基因基于Crisper-Cas9技术创制的敲除突变体的基因序列(a) 与蛋白质序列(b)变化；

图4为带绿色荧光的OsPPR035蛋白与带红色荧光标记的GmAOX1蛋白部分重合；

图5为本发明OsPPR035基因敲除突变体与野生型在3个线粒体基因编辑位点上RNA编辑效率的比较；

图6为本发明OsPPR035基因敲除突变体与野生型在20％PEG6000模拟干旱胁迫及180mM NaCl处理下的表现差异。

图7为本发明OsPPR035基因敲除突变体与野生型在20％PEG6000模拟干旱胁迫处理前后的脯氨酸含量的比较。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面通过实施例对本发明进行详细介绍：

实施例1水稻OsPPR035基因的克隆

1.幼苗培育

将水稻品种日本晴置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA分离：

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A+ 试剂的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.逆转录合成第一链cDNA

(1)反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：

37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min 终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

(2)第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：

DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：

将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。 4.水稻OsPPR035基因编码区(CDS)扩增

通过对水稻基因组及全长基因数据库进行搜索，获得水稻OsPPR035(基因号：Os01g0651100/LOC_Os01g46230)编码区(CDS)序列。根据预测信息设计上下游引物。引物序列为：

PPR035-F:ATGCCCCCGCCGTGGCCG，SEQ ID NO:3

PPR035-R:TCACCAGAAATCCCCACA，SEQ ID NO:4

从cDNA中直接克隆获得了OsPPR035基因CDS，凝胶回收，连接到pEASY-Blunt载体上，鉴定后进行序列测定，测序结果与BLAST比对确认。结果显示本发明中的水稻OsPPR035全长CDS的长度为1797，详细序列见SEQ ID NO:1。

实施例2水稻OsPPR035的蛋白序列信息与同源性分析

根据本发明新的水稻OsPPR035(基因号：Os01g0651100/LOC_Os01g46230)的ORF推导出水稻OsPPR035的氨基酸序列，共598个氨基酸，分子量为64430道尔顿，详细序列见 SEQID NO:2。通过NCBI网站的BLASTP程序比对得出 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，OsPPR035蛋白具有典型的PLS、E和DYW结构域，属于PPR蛋白家族中的DYW亚家族。

通过对植物中的部分PPR编码蛋白进行多序列比对，我们发现该类蛋白都含有保守的 PPR结构域(图1)。

实施例3水稻基因OsPPR035在逆境胁迫下的表达分析

1.逆境胁迫处理

选取饱满的日本晴种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行逆境和激素处理，包括：正常水对照(CK)、 20％PEG6000、40mM过氧化氢(H₂O₂)、5μM脱落酸(ABA)和180mM盐(NaCl)。分别在胁迫前、胁迫后0.5、2h、4h、8h、24h对对照与处理材料进行取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的

Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime) 试剂盒，和美国

CFX960定量PCR仪进行。根据OsPPR035全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。20μL反应体系的配制：

其中进行定量PCR的OsPPR035的引物序列为：

Primer-F:TATGGCATGTCGCATGTTTAAG，SEQ ID NO:5；

Primer-R:TCTCCTGCAATTTGACACAAAG，SEQ ID NO:6；

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

结果显示：OsPPR035对20％PEG6000模拟渗透胁迫与180mM NaCl盐胁迫4小时后开始有所响应，发生显著下调(图2)。上述结果表明，OsPPR035响应渗透胁迫与盐胁迫下，可能在水稻抗逆中有重要作用。

实施例4水稻基因OsPPR035敲除突变体创制

1.利用CRISPR-Cas9技术构建含有OsPPR035多靶点敲除载体：

(1)引导RNA靶点序列选择与引物设计

根据OsPPR035的基因组序列(基因号：Os01g0651100/LOC_Os01g46230)，设计2个sgRNA。20nt的核苷酸sgRNA靶点序列按照5’-GN₁₉NGG-3’(SEQ ID NO:7)序列进行设计，同时设计靶点序列引物PPR035-gRT+和PPR035-OsU6aT-，其3’端有15-17nt分别与sgRNA 和U6a启动子配对。将设计好的sgRNA靶点序列进行水稻基因组数据库比对排除非特异性的靶切位点，具体靶点核苷酸序列如下。

PPR035-1-gRT+:5’-CGGAAGATCTCCATCGCCGgttttagagctagaaat-3’,SEQ ID NO:8；

PPR035-1-OsU6aT-:5’-CGGCGATGGAGATCTTCCGCggcagccaagccagca-3’SEQ ID NO:9

PPR035-2-gRT+:5’-AAGCACCTGAGAGAAACCTgttttagagctagaaat-3’SEQ ID NO:10

PPR035-2-OsU6aT-:5’-AGGTTTCTCTCAGGTGCTTCggcagccaagccagca-3’SEQ ID NO:11

(2)接头引物变性退火，将引物稀释到10umol的工作浓度，待用；

反应体系：1ul PPR035-1-gRT(PPR035-2-gRT)引物+1ul PPR035-1-OsU6aT(PPR035-2-OsU6aT)引物+8ul H₂O

反应条件：90℃30s，然后自然冷却。

两对引物分别完成。

(3)边切边连反应体系：

反应条件：37℃5min，20℃5min，5个循环

两对引物分别完成。

(4)边切边连产物作为模板，进行第一轮PCR。采用东洋纺的KOD NEO-plus

此PCR产物命名为u1

此PCR产物命名为g1

反应条件为：98℃，3min；98℃，15s；58℃，20s；68℃，20s；68℃，2min；12℃，10min。30个循环。

第二个靶标重复以上实验，注意引物配对即可(U-F+PPR035-1-OsU6aT；PPR035-1-gRT +gRNA-R)命名为u2，g2。

引物序列为：

U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’SEQ ID NO:12

gR-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’SEQ ID NO:13

(5)重叠延伸，第4步产物作为模板，用的也是东洋纺的KOD NEO-plus

取2ul u1+2ul g1+16ul ddH2O混匀(其目的是把第4步产物稀释10倍)，命名为u1+g1

此PCR产物命名为6-T1

第二个靶标重复以上实验，模板为u2+g2

反应条件：同上。

此PCR产物命名为6-T2

反应体系中所需用到的引物序列：

U-GAL:5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATC GGCAGCAAAGG-3’,SEQID NO:14

Pgs-GAR:5’-TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCA TCCACTCCAAGCTCTTG-3’,SEQ ID NO:15

(6)重叠延伸产物纯化(用得是自配的醋酸钠3mol/L,pH5.2)

20ul重叠延伸产物+70ul ddH₂O+10ul 3M醋酸钠，混匀加200ul冰无水乙醇(无水乙醇要在-20℃低温保存一段时间的，离心去上清，75％乙醇洗一遍、离心去上清、风干，加ddH₂O 15ul。

(7)边切边连终载体，其体系为：

37℃，酶切10min

再加

T4 DNA连接酶Buffer(NEB) 0.5ul

T4 DNA连接酶(NEB) 0.1ul

反应条件：37℃2min，10℃3min，20℃5min，12-15个循环。

(8)结束后直接进行转化，涂布含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性单克隆进行测序验证。

2.农杆菌转化

(1)根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L 冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100μL，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

(2)农杆菌转化，采取冻融法：

向农杆菌感受态细胞(100μL)中加入5μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用1.5％有效浓度次氯酸钠溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g 蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2,4-D (浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D (浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6 周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、 0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h 光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1基本培养基成分1

表2基本培养基成分2

10.敲除突变体植株阳性株系的检测

(1)基因组DNA提取：液氮浸泡代测样品叶片，研磨成细粉，装入10mL离心管中，加4mL 56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇(24:1)4mL，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3mL至新离心管中(10 mL)，加300μL 10％的CTAB(56℃水浴预热)，以及3.3mL的氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7mL至新离心管中(10mL)，加5.4mL 1％CTAB (56℃预热)，轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2mL含1μL RNA酶的 1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm 离心5min，弃上清，75％乙醇清洗沉淀，晾干，加100μL灭菌水溶解DNA。

(2)敲除突变体OsPPR035基因的PCR扩增与克隆测序：同实施例1-4。

结果显示：针对3个敲除突变体OsPPR035基因的序列分析，我们发现3个突变体分别在基因转录起始子后第632插入、632缺失、632插入1、3、1个碱基，在882、883、883处缺失2、1、2个碱基(图3a)。3个突变体DNA序列的碱基缺失，均会导致翻译过程提前终止，形成不完整的PPR035蛋白(图3b)。突变体中的OsPPR035成功被敲除。

实施例5 OsPPR035的亚细胞定位

(1)水稻RNA的提取及cDNA反转同实施例1。

(2)针对PPR035的基因序列设计引物PPR035-F和PPR035-R

PPR035-F GGACAGCCCAGATCAACTAGTATGCCCCCGCCGTGGCCG,SEQ ID NO:16

PPR035-R AGCTCCGGACTTAAGACTAGTCCAGAAATCCCCACAAGA,SEQ ID NO:17

(3)以步骤1中的cDNA为模板，扩增OsPPR035的cDNA片段并连接到pAN580载体上，使OsPPR035与GFP融合，将OsPPR035-GFP表达载体和线粒体标记基因GmAOX1-RFP在水稻原生质体中瞬时表达后，用激光共聚焦显微镜(FV10)观察荧光。。

结果显示：带绿色荧光的OsPPR035蛋白与带红色荧光标记的GmAOX1蛋白部分重合(图 4)，因此OsPPR035定位于水稻线粒体。

实施例6敲除突变体材料线粒体基因RNA编辑效率的检测

(1)水稻RNA的提取及cDNA反转同实施例1。

(2)以步骤1中的cDNA为模板，对线粒体基因rps4与orfX进行PCR扩增。相关引物如下表所示：

PCR扩增，采用20ul体系：

PCR扩增条件为：95℃ 3min，95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 1min，72℃ 5min，10℃保存。 (3)针对扩增产物凝胶回收，连接到pEASY-Blunt载体上，转化大肠杆菌后挑30个单克隆进行一代测序。在水稻中发生的RNA编辑均为胞嘧啶到尿嘧啶的改变，即C-U，因此我们统计的编辑效率即为同一位点发生编辑后尿嘧啶所占的比例，编辑效率计算公式为：编辑效率＝检测到为U的克隆数量/(检测到为U+检测到为C的克隆的数量)。

结果显示：在3个敲除突变体中，线粒体rps4(926位)与orfX(406位)中各有1个编辑位点C-U的编辑效率发生了急剧下降(图5)，表明OsPPR035参与调控上述3个编辑位点的RNA编辑，从而导致表型差异。

实施例7敲除突变体材料苗期耐旱性与耐盐性的鉴定

将敲除突变体家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)。然后用清水浸种24h，37℃催芽48小时，挑选发芽好且长势一致的种子，转移到96孔板，用水稻常规营养液进行培养，每3-5天换一次营养液。生长20天左右进入4叶期，然后用20％的PEG6000及180mM的NaCl进行渗透胁迫处理，在20％PEG处理的第2 天测量相对含水量，在20％PEG与NaCl处理5天并复水3天后测量存活率。实验设置3个重复，每个重复有48个单株。同时，在处理第2天取叶片样品(3个重复)利用南京建成的生化试剂盒测定突变体植株与野生型植株的脯氨酸含量(产品号A107-1-1)。

营养液成分如下所表：

结果显示：OsPPR035的敲除突变体在20％PEG6000处理与180mM NaCl处理5天后的存活率显著高于野生型(图6)，相对含水量略高于野生型(图6)；这表明OsPPR035敲除以后能增强突变体的苗期抗旱与耐盐性。同时，还发现敲除突变体中的脯氨酸含量(图7) 在处理前后均高于野生型。这表明OsPPR035的敲除突变体是通过提高渗透调节能力(脯氨酸含量)，提高其自身抗旱与耐盐能力的。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻OsPPR035的基因及其编码蛋白与应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atgcccccgc cgtggccgcc ggccgcgccg ccgccggcct gcgcgcgctc gctcgctgac 60

ctcctcgtcg cgctctccgc cgcccgcgcg ctccccaagg ggcagcagct ccacgggcat 120

ctcctcaagg caggccacct ccccgccacc gcctcctccc acgcgcccat cgcccaccac 180

ctcctcacct tctacgcccg ctgcgcgctc cccggcgact ccctctgcgc cttcctcgac 240

ctccccgcgc cgccatcccc ggccgcgtgg tcctccctca tatcctcctt ctcacagaac 300

ggcctccccg ccgccgcgtt cgacgccttc cgccgcatgc tcgcggccgg cgtccccgcc 360

accgaccgca acattccctc cgccgccaag gcggtcgcag ccgcggaaga ctcctcgcgc 420

ccgcctcttg ccccgcacgc gctccatgga ctctccgcca agacaccgtt cgccggcgac 480

gtgtttgtcg ggtcgtcggt gcttgacatg tatgccaagt gcgggcacct tgccgacgcc 540

cgccggctat tcgatgaaat gccgaagcgg aatgtcgtct cctggtctgc tctcatatgt 600

gggtacgctg atgctgggat gcattccgcg gcgatggaga tcttccgctt agcacttgag 660

gaggcagtgc cggttaatga cttcacagtt tcgtgcattc ttcgcgtgtg tgctgcagca 720

acactctttg agcttggtgc tcaggtgcac gcccgatcta taaagacagc tctaaatgca 780

tcaccgtttg tgggtagctc gcttgtttct ctttactcaa aatgtggcct tgtggagtgt 840

gcataccagg tgtttggtga agcacctgag agaaaccttg gaatttggaa tgcggggctc 900

aatgcatctg ctcagcatgg tcatactact gcagcatttc aacggtttat ggatatgcaa 960

aatgctggat ttcgtcccaa ctccatcacg ttcctgtctt tgatcactgc ttgtagccat 1020

gctggtcttg ttgatgaggg aaagagatat ttttccctca tgaaagagta cagaattgag 1080

ccgcaggctg agcattatgc tgcaatggtt gacctacttg gccgtgtagg acgtataagt 1140

gaagcactag gccttattga gtcaatgccc atggagccac ctgagtatgt ctggggtgca 1200

ctccttatgg catgtcgcat gtttaaggat gctgacgctg cagcaattgc tgcaaagagg 1260

ttgtttgaga cagggtcacg aagctctggt gcacatatgc tcttgtcaag cacgtatgca 1320

gctgcaggaa ggcatatgga tgcagcactt gcgaggaaag caatgcgtga tgcaggtgta 1380

cgtaaagaga ctggactaag ctggctggaa gctgcagggg aggtacatac ctttgtgtca 1440

aattgcagga gacatccaag aagcaacgaa atttacaatg tgctggagaa agttggtgag 1500

aagatggagg cagctggtta tgtagcagat acaagtgcag tggttaagga tgtggacaag 1560

gatgagaagc aggcaacaat gaggtatcat agtgaaaggc tagcaatagg tttggggctt 1620

ctgattgttc cagaaggtgt accaatacga gttatgaaga acctacgagt ttgtgatgat 1680

tgccacaatg cagttaagta tctcagtaag tgtacaggaa ggattgtaat tctcagggat 1740

aaccgtcggt ttcaccggtt tgaggatggg gtatgctctt gtggggattt ctggtga 1797

<210> 2

<211> 598

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Cys Ala Arg

1 5 10 15

Ser Leu Ala Asp Leu Leu Val Ala Leu Ser Ala Ala Arg Ala Leu Pro

20 25 30

Lys Gly Gln Gln Leu His Gly His Leu Leu Lys Ala Gly His Leu Pro

35 40 45

Ala Thr Ala Ser Ser His Ala Pro Ile Ala His His Leu Leu Thr Phe

50 55 60

Tyr Ala Arg Cys Ala Leu Pro Gly Asp Ser Leu Cys Ala Phe Leu Asp

65 70 75 80

Leu Pro Ala Pro Pro Ser Pro Ala Ala Trp Ser Ser Leu Ile Ser Ser

85 90 95

Phe Ser Gln Asn Gly Leu Pro Ala Ala Ala Phe Asp Ala Phe Arg Arg

100 105 110

Met Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Thr Asp Arg Asn Ile Pro Ser Ala

115 120 125

Ala Lys Ala Val Ala Ala Ala Glu Asp Ser Ser Arg Pro Pro Leu Ala

130 135 140

Pro His Ala Leu His Gly Leu Ser Ala Lys Thr Pro Phe Ala Gly Asp

145 150 155 160

Val Phe Val Gly Ser Ser Val Leu Asp Met Tyr Ala Lys Cys Gly His

165 170 175

Leu Ala Asp Ala Arg Arg Leu Phe Asp Glu Met Pro Lys Arg Asn Val

180 185 190

Val Ser Trp Ser Ala Leu Ile Cys Gly Tyr Ala Asp Ala Gly Met His

195 200 205

Ser Ala Ala Met Glu Ile Phe Arg Leu Ala Leu Glu Glu Ala Val Pro

210 215 220

Val Asn Asp Phe Thr Val Ser Cys Ile Leu Arg Val Cys Ala Ala Ala

225 230 235 240

Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ala Gln Val His Ala Arg Ser Ile Lys Thr

245 250 255

Ala Leu Asn Ala Ser Pro Phe Val Gly Ser Ser Leu Val Ser Leu Tyr

260 265 270

Ser Lys Cys Gly Leu Val Glu Cys Ala Tyr Gln Val Phe Gly Glu Ala

275 280 285

Pro Glu Arg Asn Leu Gly Ile Trp Asn Ala Gly Leu Asn Ala Ser Ala

290 295 300

Gln His Gly His Thr Thr Ala Ala Phe Gln Arg Phe Met Asp Met Gln

305 310 315 320

Asn Ala Gly Phe Arg Pro Asn Ser Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Thr

325 330 335

Ala Cys Ser His Ala Gly Leu Val Asp Glu Gly Lys Arg Tyr Phe Ser

340 345 350

Leu Met Lys Glu Tyr Arg Ile Glu Pro Gln Ala Glu His Tyr Ala Ala

355 360 365

Met Val Asp Leu Leu Gly Arg Val Gly Arg Ile Ser Glu Ala Leu Gly

370 375 380

Leu Ile Glu Ser Met Pro Met Glu Pro Pro Glu Tyr Val Trp Gly Ala

385 390 395 400

Leu Leu Met Ala Cys Arg Met Phe Lys Asp Ala Asp Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Ala Lys Arg Leu Phe Glu Thr Gly Ser Arg Ser Ser Gly Ala His

420 425 430

Met Leu Leu Ser Ser Thr Tyr Ala Ala Ala Gly Arg His Met Asp Ala

435 440 445

Ala Leu Ala Arg Lys Ala Met Arg Asp Ala Gly Val Arg Lys Glu Thr

450 455 460

Gly Leu Ser Trp Leu Glu Ala Ala Gly Glu Val His Thr Phe Val Ser

465 470 475 480

Asn Cys Arg Arg His Pro Arg Ser Asn Glu Ile Tyr Asn Val Leu Glu

485 490 495

Lys Val Gly Glu Lys Met Glu Ala Ala Gly Tyr Val Ala Asp Thr Ser

500 505 510

Ala Val Val Lys Asp Val Asp Lys Asp Glu Lys Gln Ala Thr Met Arg

515 520 525

Tyr His Ser Glu Arg Leu Ala Ile Gly Leu Gly Leu Leu Ile Val Pro

530 535 540

Glu Gly Val Pro Ile Arg Val Met Lys Asn Leu Arg Val Cys Asp Asp

545 550 555 560

Cys His Asn Ala Val Lys Tyr Leu Ser Lys Cys Thr Gly Arg Ile Val

565 570 575

Ile Leu Arg Asp Asn Arg Arg Phe His Arg Phe Glu Asp Gly Val Cys

580 585 590

Ser Cys Gly Asp Phe Trp

595

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcccccgc cgtggccg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccagaaa tccccaca 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatggcatgt cgcatgttta ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcctgcaa tttgacacaa ag 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggaagatct ccatcgccgg ttttagagct agaaat 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggcgatgga gatcttccgc ggcagccaag ccagca 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcacctga gagaaacctg ttttagagct agaaat 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtttctct caggtgcttc ggcagccaag ccagca 36

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accggtaagg cgcgccgtag tgctcgacta gtatggaatc ggcagcaaag g 51

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tagctcgaga ggcgcgccaa tgataccgac gcgtatccat ccactccaag ctcttg 56

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggacagccca gatcaactag tatgcccccg ccgtggccg 39

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agctccggac ttaagactag tccagaaatc cccacaaga 39

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acaatagggg aagcggaaaa ccg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tatgttttgg ccacgtccgt ttc 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgttgcaacg tcttyaatag catgc 25

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcraatttgt tgatgttgca ccc 23

Claims

1.水稻OsPPR035基因在调控水稻抗逆性中的应用，其特征在于，所述水稻OsPPR035基因的序列选自：

SEQ ID NO:1所示的DNA序列；或

与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；或

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻OsPPR035基因为SEQ ID NO:1所示的DNA序列基于CRISPR-Cas9技术的敲除突变体。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述敲除突变体选自突变体1、突变体2或突变体3；

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述调控水稻抗逆性为：提高苗期耐旱性与耐盐性。

5.水稻OsPPR035基因编码的蛋白在调控水稻抗逆性中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体中的一种，或者所述蛋白为由权利要求1-3任一项所述的水稻OsPPR035基因编码得到。

6.一种水稻OsPPR035基因的定点编辑系统，其特征在于，包括：sgRNA靶点序列、靶序列引物、边切边连反应体系和重组载体；

所述sgRNA靶点序列为：SEQ ID NO:7；

所述靶序列引物包括：SEQ ID NO:8-11。

7.根据权利要求8所述的水稻OsPPR035基因的定点编辑系统，其特征在于，所述重组载体为Ti质粒或植物病毒载体。

8.根据权利要求6或7所述的水稻OsPPR035基因的定点编辑系统，其特征在于，所述重组载体为线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。

9.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为含有如权利要求6-8任一项所述的水稻OsPPR035基因的定点编辑系统。

10.一种具有抗逆性的水稻，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的水稻OsPPR035基因，或权利要求5所述的水稻OsPPR035基因编码的蛋白。