CN112760266B - 水工混凝土用芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

水工混凝土用芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用，涉及一种芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。要解决现有水工环境中混凝土易被微生物腐蚀，导致混凝土耐久性差的问题。该制剂包括强光催化芽孢杆菌T4、菌株Y39‑6的胞外聚合物和保护剂。方法：一、对强光催化芽孢杆菌T4活化；富集培养；培养至菌液中细菌数均为109个/mL；离心保留菌体沉淀；二、将菌株Y39‑6接种到胞外聚合物培养液中，培养完成后离心，保留含胞外聚合物上清液；三、将菌体沉淀与含胞外聚合物上清液混合，加入保护剂，制备成芽孢杆菌制剂。芽孢杆菌制剂能够显著降低微生物对混凝土的腐蚀性。混凝土表面生物膜形成量减少，混凝土表面光滑，且没有裂缝。本发明用于保护水工环境中混凝土。

Description

水工混凝土用芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及土木工程领域，尤其涉及一种水工混凝土用芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
混凝土是土木水利工程设施中应用最为广泛的建筑材料，在实际工程中，一旦水工混凝土结构耐久性不能满足要求，将会威胁工程安全性，甚至带来巨大的经济损失，因此，混凝土结构的耐久性一直以来备受人们关注。
影响混凝土耐久性的因素包括物理化学作用、冻融作用以及微生物腐蚀作用。混凝土的微生物腐蚀作用与微生物的新陈代谢作用有关，硫氧化菌、硫杆菌和噬混凝土菌等细菌的代谢作用生成生物硫酸导致混凝土腐蚀；硝化细菌能通过对胺的硝化作用生成硝酸，同样会导致水泥化合物(C-S-H)的分解，并丧失胶结能力；与厌氧生物代谢生成的草酸、乙酸、内酸等有机酸及碳酸，可以与钙离子形成可溶性螯合物，导致C-S-H的分解。混凝土表面的粗糙结构为微生物附着生长提供了有利条件，各类微生物附着在混凝土表面后，进行繁殖代谢形成生物膜，混凝土的粗糙表面为生物膜提供了保护作用，使得生物酸对混凝土的腐蚀作用远大于化学酸，生物膜内微生物的高度繁殖代谢及向混凝土内部穴居，使混凝土内部直接遭受腐蚀。
发明内容
本发明是要解决现有水工环境中混凝土易被微生物腐蚀，导致混凝土耐久性差的问题，提供一种水工混凝土用芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。
本发明水工混凝土用芽孢杆菌制剂包括强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4、菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6的胞外聚合物和保护剂。
进一步的，所述保护剂由腐殖酸、TiO2和水组成。其中腐殖酸的质量浓度为0.5％～2％，TiO2的质量浓度为0.05％～0.1％。
进一步的，所述强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCC No.18986。
进一步的，所述菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16652。
上述水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法为：
一、在UV254条件下，对强光催化芽孢杆菌T4在固体活化培养基上进行活化；挑取活化好的单菌落接种于液体培养基上进行富集培养10-24h，得到富集培养液；然后将富集培养液接种于液体培养基中培养至菌液中细菌数均为109个/mL；通过离心弃去上清液，保留菌体沉淀；
二、将菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6接种到胞外聚合物培养液中，培养条件为30℃，pH值为7.2～7.6，培养过程中保持培养液中溶解氧为3～5mg/L，培养时间为24h；培养完成后对菌液进行离心，保留上清，即为含胞外聚合物上清液；
三、将步骤一中制备好的菌体沉淀与步骤三中得到的含胞外聚合物上清液混合，均质，加入保护剂，制备成芽孢杆菌制剂。
进一步的，步骤一中富集培养的条件为温度35℃，振荡速度180r/min，好氧，UV254紫外光照射。
进一步的，步骤三中所述菌体沉淀、含胞外聚合物上清液和保护剂的体积比为(7～8)：(1.5～2)：(0.5～1)。
上述芽孢杆菌制剂在预防水工环境混凝土生物腐蚀中的应用。
进一步的，所述芽孢杆菌制剂用于预防水工环境混凝土生物腐蚀的具体方法为：将芽孢杆菌制剂均匀涂抹至混凝土表面。
本发明的有益效果：
本发明的芽孢杆菌制剂预防混凝土生物腐蚀的原理是：Pseudomonasextremaustralis Y39-6菌株生产的胞外聚合物主要由氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、丝氨酸、亮氨酸、磷脂、糖醛酸组成，该胞外聚合物对混凝土外围包裹，对混凝土表面起到保护作用，阻断了硫酸根、氯离子、氢离子等对混凝土的侵蚀。保护剂中的腐殖酸辅助胞外聚合物之间的交联作用，形成网状结构，更好的保护混凝土表面。强光催化芽孢杆菌T4分泌出的抗菌素，能够防止真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等在胞外聚合物上生长聚集。另外，由于强光催化芽孢杆菌T4具有耐紫外光照射、耐光催化氧化作用的优势，保护剂中的TiO2可以抑制其他微生物生长，但不影响强光催化芽孢杆菌T4的生长。
将本发明的芽孢杆菌制剂涂抹至混凝土表面，能够显著降低微生物对混凝土的腐蚀性。混凝土表面生物膜形成量减少，尤其是藻类生长少，混凝土表面光滑，且没有形成裂缝。
附图说明
图1为实施例1中混凝土上生物膜试验结果；
图2为实施例1中未涂布芽孢杆菌制剂的混凝土试块上裂缝形成情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种水工混凝土用芽孢杆菌制剂包括强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4、菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6的胞外聚合物和保护剂。
进一步的，所述保护剂由腐殖酸、TiO2和水组成。其中腐殖酸的质量浓度为0.5％～2％，TiO2的质量浓度为0.05％～0.1％。
进一步的，所述强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCC No.18986。
进一步的，所述菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16652。菌株Pseudomonas extremaustralisY39-6已经于2019年在专利CN109706099A中公开。
Pseudomonas extremaustralis Y39-6菌株生产的胞外聚合物主要由氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、丝氨酸、亮氨酸、磷脂、糖醛酸组成，该胞外聚合物对混凝土外围包裹，对混凝土表面起到保护作用，阻断了硫酸根、氯离子、氢离子等对混凝土的侵蚀。保护剂中的腐殖酸辅助胞外聚合物之间的交联作用，形成网状结构，更好的保护混凝土表面。强光催化芽孢杆菌T4分泌出的抗菌素，能够防止真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等在胞外聚合物上生长聚集。另外，由于强光催化芽孢杆菌T4具有耐紫外光照射、耐光催化氧化作用的优势，保护剂中的TiO2可以抑制其他微生物生长，但不影响强光催化芽孢杆菌T4的生长。
上述水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法为：
一、在UV254条件下，对强光催化芽孢杆菌T4在固体活化培养基上进行活化；挑取活化好的单菌落接种于液体培养基上进行富集培养10-24h，得到富集培养液；然后将富集培养液接种于液体培养基中培养至菌液中细菌数均为109个/mL；通过离心弃去上清液，保留菌体沉淀；
二、将菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6接种到胞外聚合物培养液中，培养条件为30℃，pH值为7.2～7.6，培养过程中保持培养液中溶解氧为3～5mg/L，培养时间为24h；培养完成后对菌液进行离心，保留上清，即为含胞外聚合物上清液；
三、将步骤一中制备好的菌体沉淀与步骤三中得到的含胞外聚合物上清液混合，均质，加入保护剂，制备成芽孢杆菌制剂。
进一步的，步骤一中固体活化培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，K2HPO4 0.05～0.2g/L，NaCl 0.05～0.12g/L，MnSO4·4H2O0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂0.5～1g/L，琼脂18g/L，其中碳源为腐殖酸、葡萄糖或淀粉，筛选用催化剂可以是TiO2、铁粉、硫酸亚铁等。
优选的，步骤一中富集培养的条件为温度35℃，振荡速度180r/min，好氧，UV254紫外光照射。
进一步的，步骤一中液体培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O0.01～0.05g/L，K2HPO4 0.05～0.2g/L，NaCl 0.05～0.12g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂0.5～1g/L，其中碳源为腐殖酸、葡萄糖或淀粉，筛选用催化剂可以是TiO2、铁粉、硫酸亚铁等。
优选的，步骤一中离心的转速为4000～5000g，离心时间为5～10min。
进一步的，步骤二中胞外聚合物培养液配方为：乙酸钠2～4g/L，NaNO3 0.1～0.5g/L，MnSO4 0.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl2 0.01～0.05g/L，Na2HPO4 0.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.2～7.6。
进一步的，步骤三中所述菌体沉淀、含胞外聚合物上清液和保护剂的体积比为(7～8)：(1.5～2)：(0.5～1)。
上述芽孢杆菌制剂在预防水工环境混凝土生物腐蚀中的应用。
进一步的，所述芽孢杆菌制剂用于预防水工环境混凝土生物腐蚀的具体方法为：将芽孢杆菌制剂均匀涂抹至混凝土表面。
优选的，所述涂抹厚度不超过1mm。
以下结合具体实施例并参照附图，对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1：
本实施例水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法为：
一、在UV254条件下，对强光催化芽孢杆菌T4在固体活化培养基上进行活化；挑取活化好的单菌落接种于液体培养基上进行富集培养20h，富集培养的条件为UV254紫外光照射，温度35℃，振荡速度180r/min，好氧，得到富集培养液；然后将富集培养液接种于液体培养基中培养至菌液中细菌数均为109个/mL；通过离心弃去上清液，保留菌体沉淀；离心转速为4000～5000g，离心时间为5～10min；
二、将菌株Pseudomonas extremaustralis Y39-6接种到胞外聚合物培养液中，培养条件为30℃，pH值为7.4，培养过程中保持培养液中溶解氧为4mg/L，培养时间为24h；培养完成后对菌液进行离心，保留上清，即为含胞外聚合物上清液；
三、将步骤一中制备好的菌体沉淀与步骤三中得到的含胞外聚合物上清液混合，均质，加入保护剂，制备成芽孢杆菌制剂。其中所述菌体沉淀、含胞外聚合物上清液和保护剂的体积比为7：2：1。
进一步的，步骤一中固体活化培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.2g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，K2HPO4 0.1g/L，NaCl 0.1g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂1g/L，琼脂18g/L，其中碳源为葡萄糖，筛选用催化剂为TiO2。
步骤一中液体培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，K2HPO4 0.1g/L，NaCl 0.1g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂1g/L，其中碳源为葡萄糖，筛选用催化剂是TiO2。
步骤二中胞外聚合物培养液配方为：乙酸钠3g/L，NaNO3 0.3g/L，MnSO4 0.03g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.05g/L，CaCl2 0.02g/L，Na2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，NaCl 0.5g/L，pH值7.4。
采用普通混凝土浇筑40mm×40mm×160mm棱柱形试件，将本实施例制备的的芽孢杆菌制剂均匀涂布在混凝土试件的表面，以未涂布的混凝土试件做对照，置于模拟河道水环境中120d，通过显微镜观察试块表面生物膜形成及混凝土表面腐蚀情况。
混凝土上生物膜试验结果如图1所示，图1中左侧为未涂布芽孢杆菌制剂的混凝土试块，右侧为涂布芽孢杆菌制剂的混凝土试块。未涂布芽孢杆菌制剂的混凝土试块上裂缝形成情况如图2所示(放大倍数200×)。
结果表明，将试件放置在模拟河道水环境中120d后，涂布芽孢杆菌制剂的试件上，生物膜形成量小，尤其是藻类生长少，混凝土表面光滑，没有形成裂缝；而未涂布芽孢杆菌制剂的混凝土上，藻类生长量大，且有明显的裂缝形成，证明发生了腐蚀。未涂布芽孢杆菌制剂的混凝土上，形成的裂缝占试块总面积的0.3％～0.5％。

Claims (10)

1.水工混凝土用芽孢杆菌制剂，其特征在于该制剂包括强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4、适冷假单胞菌(Pseudomonas extremaustralis)Y39-6的胞外聚合物和保护剂；
所述强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCC No.18986；
所述适冷假单胞菌(Pseudomonas extremaustralis)Y39-6保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16652。
2.根据权利要求1所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂，其特征在于所述保护剂由腐殖酸、TiO2和水组成；其中腐殖酸的质量浓度为0.5％～2％，TiO2的质量浓度为0.05％～0.1％。
3.如权利要求1所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、在UV254条件下，对强光催化芽孢杆菌T4在固体活化培养基上进行活化；挑取活化好的单菌落接种于液体培养基上进行富集培养10-24h，得到富集培养液；然后将富集培养液接种于液体培养基中培养至菌液中细菌数均为109个/mL；通过离心弃去上清液，保留菌体沉淀；
二、将适冷假单胞菌(Pseudomonas extremaustralis)Y39-6接种到胞外聚合物培养液中，培养条件为30℃，pH值为7.2～7.6，培养过程中保持培养液中溶解氧为3～5mg/L，培养时间为24h；培养完成后对菌液进行离心，保留上清，即为含胞外聚合物上清液；
三、将步骤一中制备好的菌体沉淀与步骤二中得到的含胞外聚合物上清液混合，均质，加入保护剂，制备成芽孢杆菌制剂。
4.根据权利要求3所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于步骤一中固体活化培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，K2HPO4 0.05～0.2g/L，NaCl 0.05～0.12g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂0.5～1g/L，琼脂18g/L，其中碳源为腐殖酸、葡萄糖或淀粉，筛选用催化剂为TiO2、铁粉或硫酸亚铁。
5.根据权利要求3所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于步骤一中富集培养的条件为温度35℃，振荡速度180r/min，好氧，UV254紫外光照射。
6.根据权利要求3所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于步骤一中液体培养基配方为：碳源1g/L，NH4Cl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，K2HPO40.05～0.2g/L，NaCl 0.05～0.12g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，筛选用催化剂0.5～1g/L，其中碳源为腐殖酸、葡萄糖或淀粉，筛选用催化剂为TiO2、铁粉或硫酸亚铁。
7.根据权利要求3所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于步骤二中胞外聚合物培养液配方为：乙酸钠2～4g/L，NaNO3 0.1～0.5g/L，MnSO4 0.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl2 0.01～0.05g/L，Na2HPO4 0.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.2～7.6。
8.根据权利要求3所述的水工混凝土用芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于步骤三中所述菌体沉淀、含胞外聚合物上清液和保护剂的体积比为(7～8)：(1.5～2)：(0.5～1)。
9.如权利要求1所述的芽孢杆菌制剂在预防水工环境混凝土生物腐蚀中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述芽孢杆菌制剂用于预防水工环境混凝土生物腐蚀的具体方法为：将芽孢杆菌制剂均匀涂抹至混凝土表面。
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