CN112755172B - 提高精子质量的化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提高精子活力的化合物及其应用，具体地本发明发现GSSH能够对组蛋白H3进行硫巯基化修饰，并参与调控精子运动能力。即，GSSH能够通过提高H3硫巯基化水平来显著提高精子活力，进而实现对弱精症的预防或治疗。

Description

提高精子质量的化合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及提高精子质量的化合物及其应用。

背景技术

不育症(Infertility)是指与同一个伴侣在无保护措施的情况下以适当频率性交一年或以上无法发生妊娠。目前中国的不育症患者已经超过4000万，占中国总适龄生育人口的12.5％。而不孕症患者中有大约一半的原因是来自男方。随着男性不育症患者数量的逐年增加，男性不育已经成为世界范围内临床医学的重大问题之一。

根据WHO的最新标准，每毫升精液中精子数量少于1500万，则是少精症。而精液中具有前向运动能力的精子的比例少于32％的就被确定为弱精症。在临床上不育患者精子质量低下往往同时表现为少精症与弱精症。因此，这类不育被称为少弱精症(Oligoasthenospermia)。少弱精症是男性不育的主要病因之一，约有三分之一的男性不育患者被诊断为少弱精症。大量研究表明少弱精症的病因非常复杂，与遗传、环境、饮食生活习惯都有密切关系。此外，少弱精症的精子中还存在一些其它异常，例如DNA断裂率较高，过氧化物的水平增加等。但是在分子水平上导致少弱精症机理目前的了解非常有限。

因此，本领域技术人员致力于开发能够提高精子质量的化合物，以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高精子质量的化合物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种GSSH的用途，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于选自下组的一种或多种用途：

(1)促进精子细胞分化成精子；

(2)提高精子质量(即密度与活力)；

(3)预防或治疗少弱精症；

(4)预防或治疗不育症；和

(5)提高蛋白质硫巯基化水平。

在另一优选例中，所述蛋白质为组蛋白H3。

在另一优选例中，所述药物或组合物还用于：硫巯基化组蛋白H3的C111位点。

在另一优选例中，所述药物或组合物还用于：提高精子数量。

在另一优选例中，所述药物或组合物还用于：提高前向运动精子的比例。

在另一优选例中，GSSH的结构如下式所示：

在另一优选例中，所述硫巯基化的组蛋白H3的氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.:1所示的组蛋白H3。

在另一优选例中，所述药物或组合物含有安全有效量的GSSH，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物或组合物还包括抗氧化剂。

在另一优选例中，所述药物或组合物为单元剂型。

在另一优选例中，所述组合物为保健品组合物。

在另一优选例中，所述药物或组合物包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。

在另一优选例中，所述药物或组合物包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、悬浮剂、注射剂、贴剂、滴剂、膏剂、栓剂或喷雾剂。

在另一优选例中，所述药物或组合物的施用方式包括口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、喷雾、或腹腔注射。

在另一优选例中，所述安全有效量指的是5-1000mg/kg；优选的为50-1000mg/kg。

在另一优选例中，所述的安全有效量包括50-200mg/kg(小鼠)，或500-1000mg/kg(人)。

在另一优选例中，所述的安全有效量为100-700mg/kg，更优选地为500-700mg/kg。

本发明的第二方面，提供了一种提高精子活力水平的方法，包括步骤：给需要调节的对象施用GSSH。

在另一优选例中，所述方法通过提高组蛋白H3的硫巯基化水平来提高提高精子活力。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：向需要调节的精子中加入GSSH或其药学上可接受的盐或含有其的组合物，从而提高精子活力水平。

在另一优选例中，所述方法为体外非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述GSSH的浓度为0.001μM-1000μM，优选地为0.1uM-100μM。

本发明的第三方面，提供了一种组蛋白H3的硫巯基化药剂，其中，所述药剂具有将组蛋白H3的C111硫巯基化的能力；所述药剂包括GSSH。

本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗弱精症的组合物，所述组合物包括GSSH。

在另一优选例中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物还包括抗氧化剂。

本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗弱精症的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的GSSH。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1 GSSH合成反应中各分子结构示意图。

图2不同浓度还原型谷胱甘肽对精子蛋白质硫巯基化水平的影响

上图：H3蛋白和硫巯基化H3蛋白的WB检测；

下图：硫巯基化H3蛋白的相对表达水平(数值为两次独立重复实验结果的平均值)。

图3不同浓度过氧化氢对精子蛋白质硫巯基化水平的影响。

图4 GSSH对精子硫巯基化水平的影响

A：精子裂解前后GSSH的处理对组蛋白H3硫巯基化水平的影响

B：精子裂解后加入GSSH、GSH与GSSG对H3硫巯基化水平的影响

(上述实验共独立重复两次，结果相同)

图5 GSTM3催化蛋白质硫巯基化原理示意图

图6 GSSH及GSTM3对精子蛋白质硫巯基化水平的影响

(上述实验共独立重复两次，结果相同)。

图7 GSSH对H3硫巯基化的修饰作用。

图8 GSSH对小鼠精子数量与运动的影响。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现GSSH能够对组蛋白H3进行硫巯基化修饰，并参与调控精子运动能力。即，GSSH能够通过提高H3硫巯基化水平来显著提高精子活力，进而实现对弱精症的预防或治疗。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

GSSH

GSSH是在细胞内发现的过硫化物，比GSH多一个巯基(图1)。GSSH生物合成依赖cystathionine-β-synthase(CBS)、cystathionineγ-lyase(CSE)或glutathionereductase(GSR)等酶的催化，也是硫化氢信号通路的产物之一。GSSH在细胞内易分解并间接产生硫化氢，并能够直接中和ROS等氧自由基以保护细胞免受氧化损伤。

GSSH的合成可以参考文献进行(Artaud I,Galardon E.Chembiochem.2014；15(16):2361–2364)。

本发明中GSSH的结构如下式所示：

可用于本发明的GSSH包括GSSH化合物本身或其衍生物，所述的衍生物的例子有GSSH的多晶型、或其药学上可接受的盐，例如GSSH的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、碳酸盐、醋酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、乙酸盐或羟乙基磺酸盐等。这些衍生物的制备通常可以通过常规技术手段获得，且其作用和效果可以根据细胞实验或等效性实验中与GSSH比较获得，均在本领域技术人员可以理解和预期的范围内。

本发明GSSH或其衍生物可以直接用于所需的对象，或与药学上可接受的载体混合或经制备后，以组合物的形式进行施用。可用于本发明的GSSH或其衍生物的施用剂量通常为5-150mg/kg/d，例如50-120mg/kg/d，优选为80-90mg/kg/d。而该施用的剂量在临床医师或实验室人员的可预期范围内，例如可通过有效性、安全性测试，对其剂量进行适当的调整，从而获得最优的施用剂量。

组蛋白3(H3)及其硫巯基化修饰

本发明首先开展了弱精症精子的硫巯基化修饰蛋白组学研究，并在人类精子发现了244个硫巯基化蛋白质。与正常精子相比，在弱精症精子中有34个蛋白质的硫巯基化水平显著下降，其中包括组蛋白3(H3)，另有12个蛋白质的硫巯基化水平明显增高。

为了观察精子蛋白之硫巯基化水平与精子功能的关系，本发明人检测了33份临床精子样本的总蛋白质硫巯基化水平及H3硫巯基化水平，发现两者均与精子前向运动能力呈较强的正相关性。通过精子上游实验，本发明人从各个精子样本中分离出高活力与低活力两组精子，并经检测发现，高活力精子中H3硫巯基化水平显著高于低活力精子。本发明人还比较了小鼠精子细胞细胞与成熟精子中H3硫巯基化水平，发现小鼠成熟精子中H3硫巯基化水平约为小鼠精子细胞细胞中的18倍。上述结果表明，H3硫巯基化修饰在精子形成过程中参与调控与精子运动相关的基因表达。

经本发明人鉴定，H3.1蛋白分子中第111位的半胱氨酸(C111)是硫巯基化位点。然后，本发明人将该位点突变成丝氨酸，分别构建了H3.1野生型与突变型的慢病毒表达载体，并感染小鼠C18-4精原干细胞株。结果发现，与过表达野生型H3.1蛋白的细胞相比，过表达C111突变型H3.1蛋白的细胞生长速度显著增加，表明硫巯基化修饰对H3.1的功能具有重要的调节作用。

此外，本发明人还发现，与GSH相比，被硫巯基化修饰的还原型谷胱甘肽(GSSH)具有更强的上调精子蛋白质(包括H3)硫巯基化水平的能力；而且与只有GSSH存在相比，在GSSH与GSTM3同时存在的条件下，H3的硫巯基化水平得到进一步上调，提示GSTM3与GSSH是H3硫巯基化的生理性共调节因子。

综合上述，本发明结果表明，精子中蛋白中H3蛋白的硫巯基化修饰参与调控了精子运动能力的建立与维持，而H3的硫巯基化修饰异常参与弱精症的病理过程。

在本发明的一个优选地实施方式中，组蛋白H3的不同亚型H3.1、H3.2、H3.3、H3.5、H3.1T的氨基酸序列分别如下：

H3.1:martkqtark stggkaprkq latkaarksa patggvkkph ryrpgtvalr eirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaceaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(SEQ ID NO.:1)

H3.2:martkqtark stggkaprkq latkaarksa patggvkkph ryrpgtvalr eirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(SEQ ID NO.:2)

H3.3:martkqtark stggkaprkq latkaarksa pstggvkkph ryrpgtvalr eirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqsaaigalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(SEQ ID NO.:3)

H3.5:martkqtark stggkaprkq latkaarkst pstcgvk-ph ryrpgtvalr eirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfntdlrfqsavvgalqeaseaylvglledtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(SEQ ID NO.:4)

H3.1T:martkqtarkstggkaprkqlatkvarkstpatggvkkphryrpgtvalr eirryqkstellirklpfqrlmreiaqdfntdlrfqsaavmalqeacesylvglledtnlcvihakrvtimpkdiqlarrirgera(SEQ ID NO.:5)

药物或组合物

如本文所用，术语“药物或组合物”是指将用于特定目的而被施用的组合物，包括药物组合物或保健品组合物。

如本文所用，术语“活性成分”指的是GSSH或其衍生物。

本发明活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、灌肠、喷雾、外敷、或腹腔注射。

用于口服给药的固体剂型包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、或胶囊剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷雾剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选6～600mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。通常其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

应用

本发明提供了GSSH的临床新应用，即用于预防或治疗少弱精症(Oligoasthenospermia)或弱精症(Asthenozoospermia，AS)，预防或治疗不育症。本发明人发现GSSH能够显著促进精子细胞分化成精子，提高精子质量，比如提高精子密度以及精子活力。

而用于细胞实验时，本发明活性成分还可以用于提高培养中的精子的质量(即密度与活力)。通常，培养的精子中，所添加的本发明活性成分的浓度大约为0.001μM-1000μM，优选地为0.01-100μM，该浓度可以根据所需达到的效果对添加的浓度进行进一步调整和验证，这均在本领域技术人员可以常规获得的范围内。

本发明中，术语“调节”包括治疗、预防或干扰。

术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的活性成分。

术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。

本发明的主要优点在于：

(1)首次公开了硫巯基化修饰的还原型谷胱甘肽(GSSH)具有提高精子活力的功能；

(2)首次公开了GSSH能够对H3蛋白分子中第111位的半胱氨酸(C111)进行硫巯基化修饰。

(3)首次公开了硫巯基化修饰的还原型谷胱甘肽(GSSH)具有更强的上调精子蛋白质(包括H3)硫巯基化水平的能力。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1 GSSH促进H3蛋白硫巯基化

1.材料与方法

1.1 GSSH合成

参考文献进行GSSH的合成(Artaud I,Galardon E.Chembiochem.2014；15(16):2361–2364)。

1.2小分子LC-MS质谱检测

标准品以乙腈：水(3:7)稀释至0.1mg/ml，样品以同样溶液稀释至1mg/ml。使用SPE柱对样品进行初步脱盐纯化，收集洗脱液，真空抽干后以乙腈：水(3:7)复溶上机。色谱条件为：流动相A为水溶0.1％甲酸，流动相B为乙腈溶0.1％甲酸；进样量为20μl，柱温为45℃。样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞电压分别为：1.0kV,40V和6eV.离子源温度和去溶剂温度分别为120℃和500℃，载气流量为900L/h，质谱扫描范围为50-1000m/z，扫描时间和间隔时间分别为0.1s和0.02s。原始数据经代谢组学处理软件XCMS进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间较正、峰对齐和归一化。

2.实验结果

2.1 GSH处理对精子蛋白质硫巯基化水平的影响

本发明人发现蛋白质硫巯基化修饰水平与精子质量之间存在正相关性。本发明人推测一些能降低精子质量的因素，特别是环境因素也能通过改变蛋白质硫巯基化降低精子质量。

作为GSTM3的底物之一，GSH也是重要的内源性抗氧化物，因此，本发明人检测了GSH对精子蛋白质硫巯基化的作用，以了解还原剂对精子蛋白质硫巯基化的影响。本发明人将正常精子培养于含不同浓度GSH的培养液中1hr后，检测其蛋白质硫巯基化水平的变化，结果显示，随着GSH的浓度升高，高分子量的部分蛋白硫巯基化水平也逐渐增加，但低分子量蛋白的变化并不明显(图2)。本发明人还发现，GSH处理对精子中H3蛋白的硫巯基化水平有明显影响。在GSH浓度不高于1μmol/L条件下，GSH能上调H3硫巯基化水平，但未观察到明显的剂量效应。在GSH浓度上升至2μmol/L以上，H3硫巯基化水平反而发生大幅下降(图2)。上述结果提示，细胞氧化还原平衡状态对精子蛋白质硫巯基化修饰水平具有调节作用。

2.2过氧化氢处理对精子蛋白质硫巯基化水平的影响

除了还原剂之外，ROS对精子蛋白质硫巯基化水平的影响也值得本发明人关注。过氧化氢是常见的细胞内源性氧化物，也是细胞氧化压力的主要来源之一。本发明人将正常精子培养于含不同浓度过氧化氢的培养液中1hr后，观察蛋白质硫巯基化水平的变化。结果显示，在不同浓度过氧化氢的存在下，H₂O₂能明显地降低H3硫巯基化水平。

2.3 GSSH的合成与鉴定

为了了解GSSH是否能影响精子蛋白质硫巯基化，本发明人自己在实验室对GSSH进行了化学合成制备，并对其进行了LC-MS检测，结果显示，质谱图中存在一个大小为340kDa的显著洗脱峰，即为GSSH。

2.4 GSSH对精子H3硫巯基化水平的影响

在获得了含GSSH的合成产物后，本发明人首先观察了该产物对精子蛋白质硫巯基化水平的影响。本发明人分别在精子裂解前、后加入了终浓度为1mmol/L的GSSH混合物，结果显示，GSSH有提升精子H3硫巯基化水平的趋势，且该趋势在精子裂解后加入GSSH时更为显著(图4中的A)，提示其对硫巯基化的作用方式较为直接。

考虑到所制备的GSSH产物中含有GSH与GSSG，本发明人观察比较了GSSH、GSH与GSSG对精子H3硫巯基化影响的强弱。为此，本发明人在精子裂解后分别加入相同浓度(1mmol/L)的GSSH产物、GSH和GSSG，并检测了H3硫巯基化水平的变化。结果显示，GSSH产物上调H3硫巯基化水平的趋势相对GSH与GSSG更为明显(图4中的B)，这提示GSSH能促进H3蛋白的硫巯基化。

2.5 GSTM3与GSSH对精子蛋白质硫巯基化水平的协同作用

由于GSH是GSTM3的反应底物之一，而GSSH是只比GSH多一个巯基的GSH衍生物，因此，本发明人提以下假设：GSTM3有可能将GSSH转移至蛋白质半胱氨酸位点，而由于蛋白质与GSSH连接的三硫键及不稳定，容易发生断裂，从而最终使蛋白质发生硫巯基化(图5)。为此，本发明人以GSTM3抗体对精子中的GSTM3蛋白进行免疫沉淀富集并纯化后，检测了GSTM3和GSSH，以及它们共同作用下对裂解后精子蛋白的影响。结果显示：GSSH与GSTM3同时存在时，H3硫巯基化水平发生显著提升，并高于GSSH单独处理后的H3硫巯基化水平(图6)，提示GSSH很可能是胞内蛋白质硫巯基化的巯基供体，而GSTM3蛋白可能参与并催化这一过程。

3.讨论：

本发明人发现GSSH具有比GSH显著更强的促进H3与其它精子蛋白硫巯基化的作用。本发明人这一实验结果表明，GSSH能通过提高蛋白质硫巯基化水平而调节细胞内氧化还原的平衡。而GSSH的这一功能在本发明之前尚未见于报道。

实施例2 GSSH功能的体外研究

1.材料与方法

1.1人精子样本由上海计生所医院经医学伦理批准，研究对象知情同意后收集。精液样本由研究对象禁欲2-5天后，通过手淫方法采集。精液经液化后采用计算机辅助精子分析(Computer-aided sperm analysis,CASA)分析系统测定精子浓度及活动力。

1.2主要仪器设备

(1)自动精子运动分析仪CASA(Hamilton Thorne)

(2)高速冷冻离心机(Avanti JXN-26，Beckman)

(3)台式离心机(Centrifuge 5430，Eppendorf)

(4)垂直式电泳槽(美国Bio-Rad)

(5)天平(上海精天电子仪器)

(6)分析天平(上海上天精密仪器，FA1004)

(7)pH计(Orion Research)

(8)转膜仪(美国BioRad)

(9)化学发光仪(上海天能科技)

(10)紫外分光光度计(Evolotion 60，Thermo)

(11)超声破碎仪(上海科导超声仪器有限公司)

(12)质谱仪(Scientific Orbitrap Fusion，Thermo)

1.3精子蛋白粗提物的制备

将精子以HEN缓冲液(250mmol/L HEPES(pH 7.0)，5mmol/L EDTA，0.1mmol/Lneocuproine)重悬并洗涤一次后，加入2.5％SDS及蛋白酶抑制剂的HEN缓冲液充分重悬后，冰上静置裂解10min；在冰上使用超声裂解(10W，1s，间隔2s，重复5次)；4℃15000rpm离心10min后，将上清转移至新的1.5ml离心管中备用

1.4富集硫巯基化蛋白质的Biotin-Switch方法

在已裂解好的精子蛋白溶液中加入MMTS至25mmol/L，55℃水浴20min，期间不断振荡；之后加入2倍体积的丙酮并上下颠倒混匀，再于-20℃静置20min沉淀蛋白；4℃15000rpm离心10min后，去除上清；以1ml丙酮重悬后，再次4℃15000rpm离心10min，去除上清，再空离一次，用10μl小枪头吸净液体并开盖自然晾干，确保丙酮挥发干净；再加入400μl HEN缓冲液，并加入终浓度为1％的SDS和终浓度为4mmol/L的Biotin-HPDP，充分重悬，37℃水浴2hr；4℃15000rpm离心10min后，将上清转移至新的1.5ml离心管中，并作为样品；取部分样品，加入一倍体积无还原剂的SDS上样缓冲液(5％SDS，250mmol/L Tris-Cl 6.8，0.01％溴酚蓝)，充分混合后，37℃水浴5min，作为SDS-PAGE电泳样品。

2.实验结果

体外研究表明，当GSH、GSSG与GSSH分别加入精子的蛋白抽提物、并在37℃温育1hr。然后本发明人检测了组蛋白H3的硫巯基化水平。结果显示GSH与GSSG对H3硫巯基化的影响不大。但是GSSH则显著增加H3硫巯基化水平(图7中的A)。

为了进一步研究了GSSH的作用是直接的还是间接的。如果GSSH的作用是间接的，则蛋白抽提物含有直接的巯基供体。理论上该供体是个小分子。也就是说，GSSH提高该供体的水平，后者在直接促进H3的硫巯基化反应。本发明人通过离心超滤管处理，将蛋白抽提物中的小分子化合物的含量降低了约400倍。理论上，供体的含量也降低大约400倍。这一改变将降低GSSH通过该供体对H3硫巯基化的促进作用。但是研究表明，超滤处理不仅没有降低H3.3的硫巯基化水平，而且该反应得到了加强(图7中的B)。该结果排除了GSSH的作用是间接的这一可能性，或者说本发明人的上述研究结果表明，GSSH就是蛋白质硫巯基化供体。

本发明人发现人类精子中蛋白质组的总硫巯基化水平与精子的活力呈正相关，GSSH直接促进H3的硫巯基化反应。进一步的，将GSSH加入体外培养的弱精症患者精液样品中，观察精子的活力，发现GSSH能够显著促进体外培养的精液样品中精子的活力。弱精症患者精子在不同浓度GSSH(500nM、1μM、10μM、100μM)存在的培养条件下处理48小时，然后测定精子前项运动能力。对照组中不添加GSSH。结果表明，GSSH能够显著促弱精症患者精液样品中精子的前向运动PR(％)，并且随着GSSH浓度的增加效果增强。在10μM GSSH浓度的水平下，与空白对照相比，精子前向运动PR(％)提高了约70％。

实施例3GSSH功能的体内研究

1.材料与方法

1.1动物分组与处理

30只6至7周龄雄性C57小鼠随机分为2组，每组15只，分别为对照组和给药组。小鼠购进后先饲喂1周减少应激，适应环境后开始试验。对照组小鼠每天以0.1ml生理盐水皮下注射。一周6次，持续36天；给药组小鼠腹腔注射GSSH(溶解于生理盐水)。剂量为100mg/kg/天(GSSH用量/小鼠体重)。一周6次，持续36天。

1.2小鼠精子浓度及运动性能的测定。

小鼠精子取自附睾尾部。然后采用计算机辅助精子分析(Computer-aided spermanalysis,CASA)分析系统测定精子浓度及运动性能。

2.实验结果

本发明人发现GSSH处理将精子数量提高了23％，将运动精子的比例提高了15％(图8)。上述体内实验结果表明，GSSH能提高雄鼠的精子质量。该结果证明GSSH可用于男性不育症的治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计划生育科学研究所

<120> 提高精子活力的化合物及其应用

<130> P190216-1CNCNA9

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala

1 5 10 15

Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala

35 40 45

Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Cys Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala

100 105 110

Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala

115 120 125

Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 2

<211> 136

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala

1 5 10 15

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100 105 110

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115 120 125

Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 3

<211> 136

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala

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<210> 4

<211> 135

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

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1 5 10 15

Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Thr Pro Ser

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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<210> 5

<211> 136

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

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1 5 10 15

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100 105 110

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115 120 125

Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

Claims (7)

1.GSSH在制备用于治疗弱精症的药物中的用途，所述 GSSH的结构如下式所示：

。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物含有安全有效量的GSSH和药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包括抗氧化剂。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂或注射剂。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的施用方式为口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注或腹腔注射。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过提高组蛋白H3的硫巯基化水平来治疗弱精症。