MX2008012660A - Metalotioneinas modificadas y metodos para exploracion y tratamiento de las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo. - Google Patents

Metalotioneinas modificadas y metodos para exploracion y tratamiento de las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo.

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Abstract

La presente invención se basa en el potencial terapéutico de una forma reducida de tioneina; por consiguiente, la invención presenta proteínas metalotioneina o tioneina modificadas, por ejemplo, en donde por lo menos un átomo de azufre está sustituido con selenio (por ejemplo, una cisteína sustituida con selenocisteína), y sus fragmentos; la invención también presenta métodos de análisis de compuestos candidatos que (i) disminuyen la unión de metal (por ejemplo, zinc) a metalotioneina o tioneina (ii) no cambian el estado de oxidación de metalotioneina, tioneina, u otra proteína; también se presentan métodos para generar proteínas tioneina modificadas con afinidad reducida al metal y métodos para tratar a pacientes con una enfermedad asociada con estrés oxidante.

Description

METALOTIONEINAS MODIFICADAS Y METODOS PARA EXPLORACION Y TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES ASOCIADAS CON EL ESTRES OXIDATIVO ANTECEDENTES DE LA INVENCION La invención se refiere a métodos y tratamientos para las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo y proteínas modificadas de metalotioneína o tioneína que pueden ser útiles en dichos métodos. La familia de proteínas metalotioneínas fue identificada inicialmente como proteínas de unión de metal, incluyendo zinc. Sin embargo, aunque el zinc no es un metal activo de oxidación-reducción, en virtud de su agrupamiento único de residuos de cisteína susceptibles de unión de metal (por ejemplo zinc), la metalotioneína y la tioneína pueden participar en las reacciones redox. Por consiguiente, antes de la presente invención, la oxidación de metalotioneína y la liberación del metal enlazado han estado estrechamente asociadas. Las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa. Como muchas de estas enfermedades no tienen curación, se requieren nuevos métodos para identificar tratamientos para dichas enfermedades.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se basa en el potencial terapéutico de una forma reducida de tioneína. Por consiguiente, la invención presenta metalotioneína, tioneína, o un fragmento de las mismas, en donde uno o más átomos de azufre han sido sustituidos por selenio. Por ejemplo, se pueden sustituir 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más cisteínas por selenocisteínas (por ejemplo, en alguna o todas las cisteínas o metioninas, como se describen en la presente). En una modalidad, la invención presenta un fragmento de metalotioneína (por ejemplo, un dominio a o un dominio ß de metalotioneína), capaz de unirse a un metal (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en los metales del grupo principal, los metales de transición, lantánidos y actínidos, o seleccionados del grupo que consiste en zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano), en donde por lo menos un átomo de azufre (por ejemplo todos) están sustituidos por selenio (por ejemplo, cualquier sustitución descrita en la presente). Los átomos de azufre en cualquiera de los polipéptidos aquí descritos pueden estar en una cisteína. La invención también presenta un método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa). El método incluye los pasos de (a) poner en contacto un compuesto (por ejemplo un compuesto seleccionado de una colección química) con metalotioneína o tioneína y un segundo polipéptido que incluye un aminoácido susceptible de ser oxidado, y (b) medir la cantidad de metal (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en los metales del grupo principal, los metales de transición, lantánidos y actínidos, o seleccionado del grupo que consiste en zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano), liberado de la metalotioneína o tioneína, y la formación de un aminoácido oxidado (por ejemplo, sulfóxido de metionina) en el segundo polipéptido (por ejemplo, metalotioneína o tioneína), en presencia del compuesto, en donde un compuesto que (i) aumenta la liberación de metal de la metalotioneína o tioneína, y (ii) que sustancialmente no aumenta la cantidad del aminoácido oxidado en el segundo polipéptido, en comparación con la misma prueba en ausencia del compuesto, indica que el compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. La invención presenta otro método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento del una enfermedad asociada con el estrés oxidativo (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa). El método incluye los pasos de (a) poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto (por ejemplo, un compuesto seleccionado de una colección química), y (b) medir la cantidad de metalotioneína o tioneína y el estado de oxidación (por ejemplo, la presencia de aminoácidos oxidados tales como sulfóxido de metionina) de la célula o extracto celular, en donde un compuesto que (i) aumenta la cantidad de tioneína (por ejemplo, tioneína libre de metal) o disminuye la cantidad de metalotioneína, y (ii) sustancialmente no aumenta el estado de oxidación de la célula o extracto celular, en comparación con una célula o extracto celular que no se puso en contacto con el compuesto, indica que el compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. La invención también presenta un tercer método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa). El método incluye los pasos de (a) poner en contacto un compuesto (por ejemplo, un compuesto seleccionado de una colección química) con una célula o extracto celular que incluye un polinucleótido que codifica tioneína, y (b) medir la expresión de tioneína en la célula o extracto celular, en donde un aumento de la expresión de tioneína en presencia del compuesto, en comparación con la misma prueba en ausencia del compuesto, indica que el compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con estrés oxidativo. En otra modalidad, la invención presenta un método para identificar una variante de tioneína con afinidad disminuida por un metal. El método incluye (a) introducir una mutación de punto, inserción o supresión en la tioneína, o alterar químicamente la tioneína, creando así una tioneína modificada; y (b) determinar la afinidad del metal (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en los metales del grupo principal, los metales de transición, lantánidos y actínidos, o seleccionados del grupo que consiste en zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano) con la tioneína modificada, en donde una disminución de la afinidad por el metal indica que la tioneína modificada es una variante de tioneína con afinidad disminuida por el metal. El paso de determinación también puede incluir medir la actividad reductora de la tioneína modificada, en donde una disminución no sustancial de la actividad reductora de la tioneína modificada indica que la tioneína modificada es una variante de tioneína activa de oxidación-reducción con una afinidad disminuida por el metal. La invención también presenta métodos para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa). En una modalidad, el método incluye administrar una variante de tioneína identificada usando el método de la modalidad anterior, a un paciente en necesidad del mismo. En otra modalidad, el método incluye administrar al paciente un agente quelante, en donde el paciente tiene una enfermedad seleccionada de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, o colitis ulcerativa). Cualquiera de los métodos de la invención puede usar cualquier variante, fragmento, o derivado de metalotioneína (por ejemplo, los que se describen en la presente). En algunas modalidades, la variante de MT/T tiene un átomo de azufre sustituido por un átomo de selenio, por ejemplo una mutación de punto que comprende una sustitución de una o más cisteínas (por ejemplo, todas; por ejemplo las que se describen aquí) con selenocisteína. En cualquiera de las composiciones o métodos de la invención, la MT o T usada puede tener sustituciones de uno o más residuos que no son cisteína, por aminoácidos diferentes (por ejemplo, aminoácidos naturales o no naturales). Además, la MT o T usada puede tener sustituciones de uno o más átomos de azufre por selenio (por ejemplo, selenocisteína en lugar de los residuos de cisteína). Las variantes de MT/T útiles en los métodos y composiciones de la invención incluyen una o más repeticiones de la secuencia primaria del dominio a o ß de metalotioneína (por ejemplo, separadas por una secuencia espaciadora de uno o más aminoácidos). Además, las variantes de MT/T incluyen cualquier combinación de los dominios a (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, o más) o ß (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, o más) enlazados en cualquier orden, opcionalmente con uno o más espaciadores entre los dominios. Además, los dominios pueden contener sustituciones de cualquier aminoácido que no es cisteína, o la sustitución de un átomo de azufre por selenio (por ejemplo, selenocisteína en lugar de cisteína). Por "metalotioneína" se entiende una proteína que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o incluso 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 -4, u homólogos de las mismas, que tiene siete átomos de metal enlazados a la proteína. Por "tioneína" se entiende una proteína que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o incluso 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 -4, u homólogos de las mismas, y que tiene enlazados seis átomos de metal o menos. Por "tioneína libre de metal" se entiende tioneína que tiene cero átomos de metal enlazados. Por un compuesto que "aumenta la liberación de metal de la metalotioneína" se entiende un compuesto que aumenta la cantidad de tioneína (por ejemplo, tioneína libre de metal) por lo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%, en comparación con la ausencia del compuesto. Alternativamente, un compuesto que "aumenta la liberación de metal de la metalotioneína" puede aumentar la constante de unión (es decir, disminuir la afinidad) de MT/T con el zinc, en un factor de por lo menos 2, 5, 10, 50, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o I010. Por un compuesto que "sustancialmente no aumenta la cantidad de dicho aminoácido oxidado en dicho segundo polipéptido" se entiende un compuesto que aumenta la cantidad de los aminoácidos oxidados en menos de 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, o 500%, en comparación con la ausencia del compuesto. En algunas modalidades, el compuesto no altera la cantidad de aminoácidos oxidados, o más aún, puede disminuir la cantidad de aminoácidos oxidados. Por compuesto que "sustancialmente no aumenta el estado oxidativo" de una célula o lisado de célula significa que el compuesto no aumenta el potencial redox de la célula ni el lisado de célula en más de 0.01 , 0.05, 0.10, 0.20, 0.4, 0.5, 0.75, 1 , 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000, o 20,000 mV. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un conjunto de secuencias que incluyen las secuencias 1 , 2, 3 y 4 de metalotioneína humana (SEQ ID NOS: 1 -4). Las figuras 2A-2C son diagramas esquemáticos de racimos de zinc en el dominio a de metalotioneína (figura 2A), en el dominio ß de metalotioneína (figura 2B), y en la proteína GAL4 (figura 2C).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De las tres especies de metalotioneína/tioneína (esto es, metalotioneína, tioneína oxidada y tioneína reducida), actualmente los presentes autores creen que la tioneína reducida es una especie terapéuticamente importante en las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo. Por consiguiente, la invención presenta polipéptidos modificados de metalotioneína y tioneína, métodos para aumentar las concentraciones de tioneína reducida, métodos para generar variantes de tioneína que desfavorecen la unión de metal y además favorecen el estado reducido, y métodos para el tratamiento de las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo, que disminuyen la unión de metal a la tioneína y también aumentan la cantidad de tioneína reducida disponible en un sujeto. Los métodos de exploración de la invención pueden identificar compuestos útiles para el tratamiento de las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo (por ejemplo las que aquí se describen).
Metalotioneína y tioneína La tioneína es una proteína de más de 60 aminoácidos con aproximadamente 20 aminoácidos de cisteína. No contiene residuos aromáticos ni tampoco de histidina. La metalotioneína fue descubierta en 1957 (Margoshes y Vallee, J. Am. Chem. Soc. 79:4813-4814, 1957). Se identificaron dos formas muy similares, MT-1 y MT-2; más recientemente, se identificó una tercera forma, MT-3, en cerebros de pacientes de Alzheimer (Uchida y otros, Neuron 7:337-347, 1991 ) como un factor inhibitorio del crecimiento. También se encontró una cuarta variante, MT-4, expresada exclusivamente en el epitelio escamoso estratificado (Quaife y otros, Biochemistry 33:7250-9, 1994). También se han identificado los genes que codifican isoformas de MT adicionales (hasta diecisiete en total). La tioneína tiene dos dominios (ß y a). El dominio ß N-terminal contiene nueve cisternas que se pueden enlazar a tres átomos de metal (por ejemplo, zinc), y el dominio a C-terminal contiene 1 1 cisternas que se pueden enlazar a cuatro átomos de metal (por ejemplo, zinc), formando así metalotioneína (Maret y otros, Proc. Nati. Acad. Sci USA 94:2233-2237, 1997). Aunque las enzimas de zinc, tales como GAL4, se enlazan al metal en racimos de dos átomos de zinc (figura 2C), la metalotioneína se une al zinc de una manera inusual, por medio de un racimo de tres átomos de zinc (dominio ß; figura 2B), y un racimo de cuatro átomos de zinc (dominio a; figura 2A). Estas estructuras inusuales, que tienen una alta fragilidad cinética pero son termodinámicamente estables, probablemente están relacionadas con la función celular de MTVT en la regulación del zinc. En algunas modalidades de la invención, los racimos, ya sea como parte de un dominio o en porciones más pequeñas de cualquier dominio que comprenda un número suficiente de aminoácidos para unirse al metal (por ejemplo, cisternas), pueden ser evaluados por su capacidad para tomar o liberar metal (por ejemplo, como se describe en la presente), o se puede evaluar en equilibrio que gobierna su comportamiento. Los metales usados en dichas pruebas pueden incluir cualquiera de los aquí descritos. La unión se puede probar usando metales de transición o metales del grupo llb marcados con isótopos. Tales experimentos se pueden realizar con cualquiera de MT-I, MT-2, MT-3, MT-4, o cualquier otra variante, derivado o fragmento de MT (por ejemplo los que aquí se describen). Se pueden identificar variantes adicionales de MT, y su regulación, expresión o localización se puede caracterizar usando cualquier método conocido. Regulación del zinc celular Una función atribuida a la metalotioneína y la tioneína es la regulación de las concentraciones celulares del zinc (Jacob y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3489-3494, 1998). El zinc es un cofactor crítico de muchas enzimas. Aunque la unión del zinc a MT/T es fuerte (constante de unión de 3.2 x 10"13 M a pH 7.4), se ha mostrado que MT/T puede donar zinc a enzimas de zinc tales como la fosfatasa alcalina de Esherichia coli y la carboxipeptidasa A bovina. Además para ser requerido para la actividad enzimática, el zinc inhibe la actividad de algunas enzimas que incluyen caspasa 3, fructosa 1 ,6-difosfatasa, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, aldehido deshidrogenasa, tirosina fosfatasa, y enolasa de levadura (Maret y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96:1936-1940, 1999). Las enzimas ¡nactivadas por zinc restablecen su actividad después de la adición de tioneína libre de metal. Oxidación celular Un trabajo previo ha mostrado que aunque el zinc por si solo es inerte en las reacciones de oxidación-reducción, la metalotioneína y la tioneína son activas (Maret y Vallee, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3478-3482, 1998). Se ha mostrado que los agentes oxidantes reducen a las cisteínas en MT/T, causando así una liberación concomitante de metal de la proteína. De esta manera, probablemente MT/T están implicadas en el mantenimiento del estado oxidativo en las células. Unión de trifosfato de nucleótido Los trifosfatos de nucleótido, que incluyen ATP, GTP y análogos de ATP tales como 5'[Y-tio]trifosfato de adenosina y AMP-PNP, se unen a MT/T y causan la liberación de metal de MT/T (Jiang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:9146-9149, 1998). Esta unión es mediada por ocho residuos de lisina conservados encontrados en metalotioneína y tioneína de mamífero. Identificación de tioneína no enlazada en las células Aunque la metalotioneína se observa generalmente en su forma enlazada a metal, se ha detectado y aislado tioneína de material biológico (Maret y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96:1936-1940, 1999), y actúa como un agente quelante endógeno. Aplicaciones adicionales de MT/T La metalotioneína o tioneína se pueden aislar, purificar o fraccionar de cualquier organismo que produce tioneína naturalmente, o de un organismo modificado para producir tioneína. En algunas modalidades, se puede aislar, purificar o fraccionar tioneína humana, bovina o equina. También se pueden evaluar las propiedades inmunológicas o reactivas de las metalotioneínas (por ejemplo, con cualquier metal descrito en la presente, con cualquier nucleótido, nucleósido, o cualquier otro compuesto o polipéptido).
En algunas modalidades, se estudian las interacciones de MT/T o cualquier variante aquí descrita con AMP, ADP, ATP, GSH, GSSG, o cualquier combinación de las mismas. También se puede analizar el estado de carga de metal de MT/T, por ejemplo usando los métodos descritos en Richarz AN. 2002, "Speziationsanalyse von proteingebundenen Elementen in Cytosolen ais biologische Marker für Lebensprozesse unter besonderer Berücksichtigung der Metallothioneine im Gehirn" (disertación), Universidad Tecnológica de Berlín, Matemáticas y Ciencias naturales: Berlín (Alemania). Además, las fracciones de MT/T en diferentes medios celulares se pueden detectar separando los organelos celulares, por ejemplo basándose en centrifugación de densidad. En particular, en los métodos de la invención se pueden analizar los lisosomas, peroxisomas, mitocondria, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, núcleos, o cualquier otra partícula subcelular. En otras modalidades, tales partículas subcelulares se pueden analizar del corazón, hígado, cerebro, riñon, o cualquier otro órgano. Se pueden analizar las interacciones de MT/T (por ejemplo cualquier variante como las que aquí se describen) con AMP, ADP, ATP, GSH, GSSG, o cualquier combinación de las mismas. Dichos métodos se pueden efectuar utilizando MT/T sustituida con selenocisteína, cualquier derivado de selenio de MT/T, o cualquier vanante o fragmento de MT/T aquí descrito.
MT/T sustituida con selenio En un aspecto, la invención presenta metalotioneína o tioneína en donde uno o más átomos de azufre han sido sustituidos por selenio. La metalotioneína o tioneína sustituida se puede enlazar a 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más átomos de metal. En algunas modalidades, las cisteínas se sustituyen por selenocisteínas (por ejemplo, cualquiera de las cisteínas aquí descritas o todas ellas). La selenocisteína tiene una distribución fisiológica conocida, es inocua y es bien tolerada. Así, las proteínas que contienen selenocisteína pueden ser útiles como agentes terapéuticos (por ejemplo en el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, como las que aquí se describen). Tales proteínas se pueden producir mediante cualquier método conocido. Por ejemplo, se puede usar una síntesis de péptidos para introducir selenocisteína en una secuencia de proteína, por ejemplo, como lo describen Oikawa y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:3057-3059, 1991 . En este ejemplo, los residuos de cisteína de metalotioneína de cobre de Neurospora crassa se sustituyeron por selenocisteína. En otras modalidades, una cisteína se puede sustituir por selenocisteína usando un método semisintético, por ejemplo como lo describen Hondal y otros, J. Am. Chem. Soc. 23:5140-5141 , 200 , o como lo describen Dawson y Kent, Annu. Rev. Biochem. 69:923-960, 2000. Otras propuestas incluyen modificar el ARNt en un organismo para sustituir un aminoácido por otro, por ejemplo, como lo describen Wang y Schutz, Chem. Commun. 1 -1 1 , 2002, y Wang y otros, Science 292:498-500, 2001. Cualquiera de estas propuestas, o cualquier otra propuesta conocida, se puede usar para generar derivados de selenocisteína de MT/T.
Otras variantes de MT/T La invención también presenta variantes de MT o T con sustituciones de uno o más residuos diferentes de cisteína con diferentes aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos naturales o no naturales). Además, la invención también presenta MT o T con sustituciones de uno o más átomos de azufre por selenio (por ejemplo, selenocisteína en lugar de cisteína). Las variantes de MT/T incluyen una o más repeticiones de la secuencia primaria del dominio a o ß de metalotioneína (por ejemplo separadas por una secuencia espaciadora de uno o más aminoácidos). Las variantes de MT/T pueden incluir cualquier combinación de dominios a (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, o más) o ß (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, o más), enlazados en cualquier orden, opcionalmente con uno o más espaciadores entre los dominios. Además, los dominios pueden contener sustituciones de cualquier aminoácido que no es cisteína, o sustitución de cisteína por un residuo que contiene selenio, tal como selenocisteína. Los dominios que incluyen cambios abarcados por la presente invención se describen en WO 00/50448, de la página 12, renglón 4, a la página 14, renglón 5, que se incorpora aquí como referencia. Similarmente, los cambios descritos en WO 00/50448 se pueden incorporar en la proteína metalotioneína de longitud completa, cualquier fragmento del misma, o cualquier otra variante aquí descrita.
Otras variantes incluyen fragmentos tales como cualquier fragmento de metalotioneína capaz de unirse a un átomo de metal, por ejemplo porciones del dominio ß o del dominio a en donde el fragmento carece de 1-25 aminoácidos del extremo C del dominio, del extremo N del dominio, o una mezcla de los mismos. Usando las técnicas de biología molecular conocidas se pueden identificar mutantes de supresión capaces de unirse al metal, y usando cualquier método (por ejemplo como el que aquí se describe) se puede analizar la unión del metal.
Métodos de exploración para identificar compuestos terapéuticos candidatos Basándose en la identificación de metalotioneína y tioneína como una proteína de unión y regulación de zinc, y en su función en la oxidación celular en conjunto con la unión de MT/T y zinc, los presentes autores buscan ahora separar la actividad de unión de zinc de MT/T de la oxidación de MT/T. Por consiguiente, la invención presenta métodos de exploración para identificar los compuestos que (i) disminuyen la unión de un metal a MT/T, y (ii) sustancialmente no aumentan la oxidación de MT/T o un segundo polipéptido. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden aumentar la disponibilidad de la tioneína disponible para la reducción de especies oxidativas potencialmente nocivas tales como metalotioneína o tioneína, que contienen residuos de sulfóxido de metionina. Los ejemplos específicos de enfermedades en donde los aminoácidos oxidados juegan una función en el avance de la enfermedad incluyen la enfermedad de Parkinson, en donde se ha identificado a-sinucleína oxidada que contiene sulfóxido de metionina (Glaser y otros, Biochim. Biophys. Acta. 1703:157-69, 2005), y la enfermedad de Alzheimer, en donde se ha identificado proteína ß-amiloide oxidada que contiene residuos de sulfóxido de metionina (Schoneich, Biochim. Biophys. Acta. 1703:111 -9, 2005). En la presente se describen otros ejemplos de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo. De esta manera, los compuestos identificados por los métodos de exploración de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Mediante los métodos estándares se pueden hacer pruebas de exploración para identificar compuestos que disminuyen la unión de metal a MT/T y sustancialmente no aumentan la oxidación de MT/T o un segundo polipéptido. Los métodos de exploración pueden implicar técnicas de alto rendimiento. Además, estas técnicas de exploración se pueden efectuar en celdas cultivadas o en organismos tales como gusanos, moscas o levadura. Metalotioneína Los métodos de exploración de la invención pueden incluir el uso de cualquier proteína MT/T, tal como proteínas homologas a las proteínas MT/T humanas (por ejemplo, proteínas MT de ratón, rata, o conejo). En los métodos de la invención se pueden usar cualquier forma de MT/T (por ejemplo, MT-3 y las aquí descritas). En modalidades particulares, la metalotioneína o tioneína usada en los métodos de exploración de la invención puede comprender selenio en lugar de uno o más átomos de azufre encontrados en la proteína de tipo silvestre (por ejemplo, selenocisteína en lugar de uno o más aminoácido de cisteína). En otras modalidades, los métodos de exploración que usan cualquier variante de metalotioneína o tioneína aquí descrita. En los métodos de exploración se puede usar cualquier concentración de MT/T que permita la detección de la liberación de metal. Se puede usar cualquier metal, que incluye los seleccionados del grupo que consiste en los metales del grupo principal, los metales de transición, lantánidos y actínidos, y los seleccionados del grupo que consiste en zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano, capaz de ser enlazado por la tioneína, para formar metalotioneína. En algunas modalidades, en los métodos de exploración se usan fragmentos de unión de metal (por ejemplo, de unión de zinc) de MT/T (por ejemplo, cualquiera descrito en la presente como un fragmento que comprende el dominio ß o el dominio a). En los métodos de la invención también se puede usar cualquier variante, derivado, o fragmento de MT/T aquí descrito. Detección de la disminución de la unión de metal a la metalotioneína Los métodos de exploración de la invención incluyen un paso que determina la liberación de metal de MT/T o cualquier fragmento o variante de la misma aquí descrito. Se puede usar cualquier método conocido para determinar la liberación de metal. En una modalidad se usa el método descrito por Maret y Vallee (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3478-3482, 1998). Brevemente, se puede usar un colorante de formación de complejo con zinc, tal como 4-(2-piridilazo)resorcinol (PAR) o 2-carboxi-2'-hidroxi-5'-sulfoformazil-benceno (zincon), para medir la liberación de zinc de MT T, ya que las propiedades espectrales de estos colorantes se alteran después de la unión con el zinc. En un ejemplo particular, una solución amortiguadora que contiene 100 µ? de PAR o zincon se incuba con 1 .3 µ? de zinc-MT. Se añade a la solución un compuesto de prueba; los cambios de absorbancia a 500 nm para PAR, o 620 nm para zincon, se pueden medir usando un espectrofotómetro, y se comparan con la absorbancia en ausencia del compuesto de prueba, en donde un aumento de la absorbancia indica la liberación de zinc de MT/T. Si es necesario, la absorbancia generada por el compuesto de prueba se puede corregir en la medición de absorbancia. Moléculas adicionales útiles para detectar el zinc celular libre incluye los análogos de Zinpyr- , que describen por ejemplo en Goldsmith y Lippard, Inorg. Chem. 45:555-561 , 2006 y Woodroofe y otros, Inorg. Chem. 44:31 12-3120, 2005. En otra modalidad, se usa cobre-MT en los métodos de exploración de la invención. Aquí, se pone en contacto cobre-MT con un compuesto de prueba, y la liberación del cobre se monitorea usando 4-(1 ,4,7,10-tetratio-13-aza-ciclopenta-13-decil)-benceno (CTAP-I). El CTAP-I exhibe un incremento en la emisión a 480 nm después de excitación a 365 nm en presencia de cobre, en comparación con la ausencia de cobre (Yang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 102: 1 1 179-1 1 184, 2005), y además es adecuado para usarse en métodos de exploración que utilizan células o extractos de células. También se pueden analizar los cambios de las cantidades relativas de metalotioneína y tioneína, y el número de átomos de metal enlazados a la tioneína, por ejemplo usando los métodos descritos por Richarz AN. 2002. "Speziationsanalyse von proteingebundenen Elementen in Cytosolen ais biologische Marker für Lebensprozesse unter besonderer Beriicksichtigung der Metallothioneine im Gehirn" (disertación), Universidad Tecnológica de Berlín, Matemáticas y Ciencias Naturales: Berlín (Alemania). La disminución del estado de carga de metal de metalotioneína o tioneína, o un aumento de la cantidad de tioneína libre de metal en un sistema biológico después de contacto de un compuesto de prueba, pueden indicar que el compuesto disminuye la capacidad de MT o T para unirse al metal, y se puede detectar usando los métodos descritos. Además, las fracciones de MT/T en diferentes medios celulares se pueden detectar separando los organelos celulares, por ejemplo basándose en centrifugación de densidad. En particular, en los métodos de la invención se pueden analizar los lisosomas, peroxisomas, mitocondria, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, núcleos, o cualquier otra partícula subcelular. En otras modalidades, tales partículas subcelulares se pueden analizar del corazón, hígado, cerebro, riñon, o cualquier otro órgano. Se pueden analizar las interacciones de MT/T (por ejemplo, cualquier variante como las que aquí se describen) con AMP, ADP, ATP, GSH, GSSG, o cualquier combinación de las mismas. Tales métodos se pueden efectuar utilizando MT/T sustituida con selenocisteína, o cualquier otro derivado de selenio de MT/T. Detección de la oxidación de aminoácido y estado de oxidación celular Los métodos de exploración de la invención también incluyen un paso para medir la oxidación de un aminoácido de un segundo polipéptido (por ejemplo, MT, T, o cualquier fragmento o variante aquí descrito), o para determinar si el compuesto de prueba aumenta sustancialmente el estado de oxidación de una célula (por ejemplo, la formación de aminoácidos oxidados o especies reactivas de oxígeno). En los métodos de exploración de la invención se puede usar cualquier método conocido para detectar aminoácidos oxidados. Los métodos de detección ejemplares se describen en Shacter, Drug Metab. Rev. 32:307-26, 2000. Los métodos específicos para la detección de aminoácidos dependerán del tipo particular del aminoácido oxidado que se quiere detectar. La oxidación de metionina puede dar como resultado la formación de sulfóxido de metionina y, en una modalidad, se detectan dichos residuos. La detección de sulfóxido de metionina es especialmente útil ya que virtualmente todas las proteínas, incluyendo tioneína y metalotioneína, poseen un residuo de metionina N-terminal. El sulfóxido de metionina puede ser detectado mediante el método descrito por Sochaski y otros (Anal. Chem. 73:4662-7, 2001 ). Aquí, se hidrolizan unas muestras con ácido metanosulfónico. Después, la muestra hidrolizada se separa en una columna de intercambio catiónico y los aminoácidos se modifican como sus ésteres de trimetilsililo. Después se detecta la presencia de sulfoxido de metionina en la muestra por medio de monitoreo iónico seleccionado por cromatografía de gases /espectrometría de masa, como es conocido. Los compuestos que disminuyen la unión de MT/T al metal (por ejemplo, zinc), pero no aumentan la formación de sulfoxido de metionina (por ejemplo, en la metionina N-terminal de MT/T), se consideran útiles en la invención. Usando cualquier método conocido también se pueden detectar los cambios de potencial redox en los métodos de la invención que usan células o un extracto celular. Por ejemplo, la presencia de especies reactivas de oxígeno se puede analizar usando los equipos disponibles comercialmente, por ejemplo, el equipo de detección de especies de oxígeno reactivo Image-¡T™ LIVE (Invitrogen). Métodos adicionales para medir los potenciales redox in situ se describen en Hanson y otros, J. Biol. Chem. 279:13044-13053, 2004. Aquí, la proteína fluorescente verde (GFP) se modifica para contener cisteínas. La formación de enlaces disulfuro en la GFP modificada produce cambios de florescencia en proteína en respuesta a los cambios del potencial redox; estos cambios se pueden usar para monitorear los cambios del potencial redox en un medio celular. Los compuestos que disminuyen la unión de metalotioneína o tioneína al metal (por ejemplo zinc), pero sustancialmente no disminuyen la capacidad de la metalotioneína o tioneína de participar en la química redox, se consideran útiles en la invención. Exploración en búsqueda del aumento de expresión de la tioneína Están disponibles varios métodos de exploración para identificar compuestos que aumenten la expresión de tioneína (por ejemplo, MT-3). De acuerdo con una propuesta, se añaden concentraciones variables de compuestos candidatos al medio de cultivo de células que expresan un polinucleótido que codifica metalotioneína. Después se mide la expresión génica, por ejemplo por medio de un análisis estándar de Northern blot (Ausubel y otros, "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, Nueva York, 1997), usando cualquier fragmento adecuado preparado a partir de la molécula de polinucleótido como una sonda de hibridación. El grado de expresión génica en presencia del compuesto candidato se compara con el grado de expresión medido en un medio de cultivo de control que carece de la molécula candidata. Un compuesto que promueve un aumento en la expresión de tioneína (por ejemplo, MT-3) se considera útil en la invención; dicha molécula se puede usar por ejemplo como un agente terapéutico para una enfermedad asociada con el estrés oxidativo (por ejemplo, las que se describen en la presente). Si se desea, alternativamente el efecto de los compuestos candidatos se puede medir contra el grado de producción de polipéptido usando la misma propuesta general y técnicas inmunológicas estándares, tales como Western blotting o inmunoprecipitacion con un anticuerpo específico para metalotioneína o tioneína. Por ejemplo, se pueden usar inmunoensayos para detectar o monitorear la expresión de metalotioneína o tioneína. Para medir la concentración de metalotioneína se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales que son capaces de unirse a dicho polipéptido en cualquier formato de inmunoensayo estándar (por ejemplo, ELISA, Western blot, o ensayo RIA). Un compuesto que promueve un aumento de la expresión de metalotioneína o tioneína se considera particularmente útil. Nuevamente, dicha molécula se puede usar, por ejemplo, como agente terapéutico para una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Compuestos de prueba y extractos En general, los compuestos capaces de tratar una enfermedad asociada con el estrés oxidativo se identifican de grandes colecciones de extractos tanto naturales como sintéticos (o semisintéticos) o colecciones químicas de acuerdo con los métodos conocidos. Los expertos en el área de descubrimiento y desarrollo de fármacos entenderán que la fuente precisa de los extractos de prueba o compuestos no es critica para los métodos de exploración de la invención. Por consiguiente, usando los métodos aquí descritos se puede explorar virtualmente cualquier número de extractos químicos o compuestos. Los ejemplos de dichos extractos o compuestos incluyen, sin limitación, extractos basados en plantas, hongos, procariotes o animales, caldos de fermentación, y compuestos sintéticos, así como también modificaciones de compuestos existentes. También están disponibles muchos métodos de síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, síntesis parcial o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos que incluyen, sin limitación, compuestos basados en sacárido, lípido, péptido y polinucleótido (por ejemplo, ARNci o microARN). Otros compuestos que se pueden usar en los métodos de exploración de la invención incluyen cualquier compuesto aquí descrito (por ejemplo, agentes quelantes, tioneína modificada y compuestos de selenio (por ejemplo, selenocistamina, cloruro de bencenoselenenilo, y ácido bencenoselenínico). Cualquiera de estos compuestos se puede modificar químicamente usando los métodos estándares de la técnica. Están disponibles comercialmente colecciones sintéticas de compuestos. Alternativamente, están disponibles comercialmente colecciones de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, si se desea, se producen colecciones naturales y sintéticas de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo por medio de métodos estándares de extracción y fraccionamiento. Además, si se desea, cualquier colección o compuesto se modifica fácilmente utilizando métodos estándares químicos, físicos, o bioquímicos. Además, los expertos en el área de descubrimiento y desarrollo de fármacos entenderán fácilmente que siempre que sea posible se deben usar métodos de anti-duplicación (por ejemplo, anti-duplicación taxonómica, anti-duplicación biológica y anti-duplicación química, o cualquier combinación de los mismos), o la eliminación de duplicaciones o repeticiones de materiales ya conocidos por su actividad en el tratamiento de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo. Cuando se encuentra que un extracto crudo tiene una actividad deseada, tal como la disminución de la unión de metalotioneína o tioneína al metal, o aumento de la expresión de tioneína, es necesario un fraccionamiento adicional del extracto guía positivo para aislar los constituyentes químicos responsables del efecto observado. De esta manera, la meta de la extracción, fraccionamiento y proceso de purificación es la caracterización e identificación de una entidad química que tiene actividad en el extracto crudo, que puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Los métodos de fraccionamiento y purificación de dichos extractos heterogéneos son conocidos. Si se desea, los compuestos que han mostrado ser agentes útiles para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, son modificados químicamente de acuerdo con los métodos conocidos.
Tioneína modificada con unión de metal disminuida La invención también presenta métodos para generar tioneína modificada (T) con unión de metal disminuida (por ejemplo, zinc). En algunas modalidades, una tioneína modificada puede retener adicionalmente la capacidad de participar en reacciones redox en comparación con la tioneína de tipo silvestre. Tales moléculas de tioneína modificada pueden ser útiles en el tratamiento de las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo. Las modificaciones se pueden realizar mediante cualquier método conocido. Los métodos para introducir alteraciones de secuencia (por ejemplo, mutaciones de punto, inserciones, supresiones, o cualquier combinación de las mismas) son muy conocidos para los expertos en la materia. Modificaciones a la tioneína La tioneína se puede modificar en cualquier residuo (por ejemplo, por modificación química o mutación de punto), y se puede modificar mediante la inserción o supresión de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, o 20). En los métodos de la invención se puede usar cualquier modificación de la tioneína aquí descrita. Estas modificaciones se pueden efectuar, por ejemplo, usando las técnicas estándares de biología molecular. En algunas modalidades, se alteran los residuos de lisina para disminuir la unión de los metales (por ejemplo, zinc). Dichas alteraciones pueden incluir la adición o sustitución de una porción de tiol, ácido sulfénico, ácido sulfínico, ácido sulfónico, éster de sulfonato, sulfóxido o sulfona. Estos residuos de lisina incluyen los ocho residuos de lisina en las posiciones 20, 22, 25, 30, 31 , 43, 51 y 56 de MTI o MT2 (SEQ ID NOS:1 y 2), los residuos de lisina en las posiciones 21 , 26, 31 , 32, 44, 47, 52 y 63 de MT3 (SEQ ID NO:3), o los residuos de lisina en las posiciones 21 , 28, 32, 44, 52 o 57 de MT4 (SEQ ID NO:4), ya que estos residuos están implicados en la unión de ATP (véase Jiang y otros, supra) en un orden hasta ahora desconocido. Como se indicó arriba, la unión de ATP disminuye la afinidad de MT por el metal. De esta manera, la modificación de los residuos de lisina en la tioneína (por ejemplo, los indicados arriba), o los residuos adyacentes a los residuos de lisina, o los residuos que están, basándose en la estructura tridimensional de la tioneína, cerca de los residuos de lisina, se puede probar para verificar el aumento de la unión de AMP, ADP, ATP, GSH, o GSSG, o cualquier combinación de las mismas. Las modificaciones que aumentan la unión de ATP, o la unión de otros trifosfatos de nucleotidos o análogos de los mismos, pueden disminuir la afinidad de la tioneína por el metal (por ejemplo, zinc), y por lo tanto pueden ser especialmente útiles en los métodos de la invención. Modificaciones ejemplares adicionales pueden incluir la sustitución de cualquier átomo de azufre por selenio. Por ejemplo, cualquiera de los veinte residuos de cisteína en MT T puede ser sustituido por metionina o selenocisteína. Específicamente, se pueden modificar los residuos 5, 7, 13, 15, 19, 21 , 24, 26, 29, 33, 34, 36, 37, 41 , 44, 48, 50, 57, 59, o 60 en MTI o MT2, los residuos 6, 8, 14, 16, 20, 22, 25, 27, 30, 34, 35, 37, 38, 42, 45, 49, 51 , 64, 66, o 67 en MT3, o los residuos 6, 8, 4, 16, 20, 22, 25, 27, 30, 34, 35, 37, 38, 42, 45, 49, 51 , 58, 60, o 61 en MT4. Tales modificaciones pueden disminuir la afinidad de la tioneína por el metal, pero en algunas modalidades pueden permitir a la proteína tioneína modificada participar en las reacciones redox. En algunas modalidades, todos los residuos de cisteína se sustituyen por selenocisteína. Tales proteínas MT/T modificadas se pueden hacer usando síntesis de péptidos en fase sólida o usando cualquier técnica conocida, o como la que se describe más abajo. También, dichos métodos pueden usar cualquier variante de MT/T (por ejemplo, las que aquí se describen). Análisis de la unión de metal Las pruebas de afinidad y unión de metal se pueden realizar como se describe aquí o como se conoce en la técnica. Tales pruebas se pueden usar para determinar qué variantes de tioneína exhiben una disminución de la unión de metal, tal como zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano, en comparación con la tioneína no modificada. Prueba para la actividad redox En algunas modalidades, una tioneína modificada se analiza adicionalmente para evaluar su actividad redox. El método preciso utilizado no es crítico para la invención; tales mediciones se pueden hacer usando cualquier método conocido. El estado redox de la metionina N-terminal se puede determinar, por ejemplo, mediante los métodos anteriormente descritos que incluyen mediciones del potencial redox que usan GFPs modificadas, o equipos disponibles comercialmente, por ejemplo los que aquí se describen. En otras modalidades, el potencial redox de una proteína en solución se puede medir usando electrodos, por ejemplo, los disponibles comercialmente de Broadley James Corporation, Irvine, California.
Producción de polipéptido Los polipéptidos de tioneína modificados se pueden producir mediante la transformación en una célula hospedera adecuada de una parte o toda una molécula de polinucleótido que codifica la tioneína, o un fragmento de la misma, en un vehículo de expresión adecuado. Los expertos en el campo de la biología molecular entenderán que se puede usar cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para proveer el polipéptido de tioneína. La célula hospedera precisa no es crítica para la invención. La tioneína modificada puede ser producida en un hospedero procariótico (por ejemplo, E. coli) o en un hospedero eucariotico (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, células de insecto, por ejemplo células Sf21 o células de mamífero, por ejemplo, NIH 3T3, HeLa, o preferiblemente células COS). Tales células están disponibles de una amplia gama de fuentes (por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockland, Maryland; véase también por ejemplo, Ausubel y otros, supra). El método de transformación o transfeccion y la elección del vehículo de expresión dependerán del sistema hospedero seleccionado. Los métodos de transformación y transfeccion se describen por ejemplo en Ausubel y otros {supra); los vehículos de expresión se pueden elegir de los provistos por ejemplo en "Cloning Vectors: A Laboratory Manual" (Pouwels, P. H. y otros, 1985, Sup. 1987). También se pueden producir mediante síntesis química tioneína y fragmentos de tioneína, especialmente los que contienen aminoácidos tales como selenocisteína (por ejemplo, mediante los métodos descritos en "Solid Phase Peptide Synthesis", 2a ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Las tioneínas modificadas con propiedades particulares (por ejemplo aumento de la unión con ATP o disminución de la afinidad por el metal (por ejemplo, zinc)) pueden incluir también modificaciones químicas tales como la modificación de grupos de cadena lateral, como es conocido en la técnica.
Tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo La invención presenta métodos de tratamiento de un sujeto con una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Los compuestos usados en los métodos de tratamiento de la invención pueden ser por ejemplo, los compuestos identificados usando un método de exploración aquí descrito, una tioneína modificada (por ejemplo, como se describe aquí), o un agente quelante. Enfermedades asociadas con el estrés oxidativo Las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa.
Tioneína modificada Se puede administrar a un sujeto una proteína tioneína modificada (por ejemplo, identificada mediante los métodos de la invención o descrita en la presente) para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. La provisión de la tioneína modificada a un sujeto, al reducir los efectos del estrés oxidativo, puede tratar dicha enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Terapia génica Además de la administración de una proteína tioneína modificada, también se puede inducir la expresión de un polinucleótido que codifica tioneína (por ejemplo, una tioneína modificada que aquí se describe) por introducción de un vector de gen en un sujeto, para tratar una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. Para dicha administración se puede usar cualquier vector y metodología estándar de terapia génica. Unión de metal/agentes quelantes También se pueden usar agentes quelantes capaces de remover un metal tal como zinc de MT para el tratamiento de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo, tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia y colitis ulcerativa. Tales agentes removerán el metal de MT, permitiendo así que la apoproteína T participe en las reacciones redox y alivie el estrés oxidativo. En los métodos de tratamiento de la invención se puede usar cualquier agente quelante, que incluye EDTA, EGTA, 1 ,10-fenantrolina, N,N,N',N'-tetrakis(2-piridilmetil)etilendiamina (TPEN), dietilditiocarbamato (DEDTC), 1 ,10-fenantrolina, 8-hidroxiquinolina, sulfonato de 8-hidroxiquinolina, dietilditiocarbamato de sodio, y 2,2'-bipiridilo. Agentes quelantes adicionales (por ejemplo, agentes que se unen al zinc o cobre) incluyen los de la familia de Zinpyr, y se describen por ejemplo en Goldsmith y Lippard, Inorg. Chem. 45:555-561 , 2006; Woodroofe y otros, Inorg. Chem. 44:31 12-3120, 2005; Woodroofe y Lippard, J. Am. Chem. Soc. 125:1 1458-1 1459, 2003; Burdette y otros, J. Am. Chem. Soc. 125:1778-1787, 2003; Boerzel y otros, Inorg. Chem. 42: 604-1615, 2003; Nolan y Lippard, Inorg. Chem. 43:8310-8317; 2004; Nolan y otros, Inorg. Chem. 43:2624-2635, 2004; y Kuzelka y otros, Inorg. Chem. 43:1751 -1761 , 2004. También se pueden usar en los métodos de la invención los agentes de bis(tiosemicarbazona) (por ejemplo, diacetilbis(4-pirrolidinil-3-tiosemicarbazona))( que forma complejos con el zinc. Estos reactivos se describen en mayor detalle, por ejemplo, en Cowley y otros (Chem. Commun. (Camb). 2005(7):845- 847, 2005). Formulación de composiciones farmacéuticas La administración de cualquier compuesto aquí descrito, o identificado usando los métodos de exploración de la invención, puede ser cualquier medio adecuado que de como resultado la concentración del compuesto para tratar una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. El compuesto puede estar contenido en una cantidad apropiada en una sustancia vehículo adecuada, y generalmente está presente en una cantidad de 1 -95% en peso del peso total de la composición. La composición se puede proveer en una forma de dosis adecuada para su administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intracraneal, ¡ntratecal), rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhalación, por la piel (parche), ocular o intracraneal. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véase, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, 2000, ed. A.R. Gennaro; Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia; y "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para liberar el compuesto activo inmediatamente después de la administración, o a cualquier tiempo o período predeterminado después de la administración. Estos últimos tipos de composiciones se conocen generalmente como formulaciones de liberación controlada e incluyen: (i) formulaciones que crean concentraciones sustancialmente constantes de los agentes de la invención dentro del cuerpo durante un período prolongado; (ii) formulaciones que después de un período de retraso predeterminado crean concentraciones sustancialmente constantes de los agentes de la invención dentro del cuerpo durante un período prolongado; (iii) formulaciones que sostienen la acción de los agentes durante un período predeterminado, manteniendo en el cuerpo una concentración eficaz relativamente constante de los agentes, con la minimización concomitante de los efectos secundarios indeseables asociados con las fluctuaciones de concentración plasmática de los agentes (patrón de cinética de dientes de sierra); (iv) formulaciones que localizan la acción de los agentes, por ejemplo la colocación espacial de una composición de liberación controlada en el tejido u órgano deseado o junto al mismo; (v) formulaciones que logran una conveniencia de dosificación, administrando la composición una vez a la semana o una vez cada dos semanas; y (vi) formulaciones que dirigen la acción de los agentes usando vehículos o derivados químicos para suministrar el compuesto a un tipo de célula objetivo particular. La administración del compuesto en forma de una formulación de liberación controlada se prefiere especialmente para compuestos que tienen una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal, o una vida media biológica relativamente corta. Cualquier estrategia de muchas se puede ajustar para obtener una liberación controlada en la cual la velocidad de liberación sea mayor que la velocidad de metabolismo del compuesto en cuestión. En un ejemplo, la liberación controlada se obtiene mediante la selección adecuada de varios parámetros de formulación e ingredientes, que incluyen por ejemplo varios tipos de composiciones y recubrimientos de liberación controlada. De esta manera, el compuesto se formula con los excipientes adecuados en una composición farmacéutica que, después de su administración, libera el compuesto de manera controlada. Los ejemplos incluyen composiciones unitarias de tableta o cápsula, individuales o múltiples, soluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, complejos moleculares, microesferas, nanopartículas, parches y liposomas. Composiciones parenterales La composición que contiene los compuestos aquí descritos, o identificados usando los métodos de la invención, se puede administrar por vía parenteral por medio de inyección, infusión o implante (subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracraneal, intratecal, etcétera), en formas de dosis, formulaciones, o mediante dispositivos de suministro o implantes adecuados que contienen vehículos y adyuvantes inocuos farmacéuticamente aceptables convencionales. La formulación y preparación de dichas composiciones es bien conocida para los expertos en el área de las formulaciones farmacéuticas. Las composiciones parenterales usadas en los métodos de la invención pueden estar en una forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, los agentes activos adecuados se disuelven o se suspenden en un vehículo líquido aceptable para uso parenteral. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se puede usar están el agua, agua ajustada a un pH adecuado mediante la adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, o un amortiguador adecuado, 1 ,3-butanodiol, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución isotónica de cloruro de sodio. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo, o n-propilo).
En los casos en los que los compuestos son moderadamente o escasamente solubles en agua, se puede añadir un agente solubilizante o fomentador de disolución, o el disolvente puede incluir 10-60% p/p de propilenglicol o similar. Administración en el sistema nervioso En muchos casos, es deseable que el compuesto sea administrado limitadamente al tejido o tejidos afectados por la enfermedad particular que sufre el sujeto. En el caso de enfermedades que afectan el sistema nervioso, tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, el suministro a las áreas afectadas del sistema nervioso se puede lograr, por ejemplo, mediante los métodos que se indican más abajo. El tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa puede verse obstaculizado por la incapacidad de un compuesto terapéutico activo para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). La estrategia para suministrar los compuestos de la invención en dichos trastornos y enfermedades (por ejemplo, proteínas tioneínas modificadas), incluyen estrategias para esquivar la BHE (por ejemplo, administración intracraneal por medio de craneotomía y administración intratecal), y estrategias para atravesar la BHE (por ejemplo, el uso de compuestos que aumentan la permeabilidad de la BHE, en conjunto con la administración sistémica de composiciones terapéuticas, y la modificación de los compuestos para aumentar su permeabilidad o transporte a través de la barrera hematoencefálica. La craneotomía, un procedimiento conocido, se puede usar para el suministro de composiciones terapéuticas al cerebro. En esta propuesta, se hace una abertura en el cráneo del sujeto y se suministra un compuesto por medio de un catéter. Esta propuesta se puede usar para dirigir un compuesto a un área específica del cerebro (por ejemplo, la sustancia negra para tratar la enfermedad de Parkinson, o la corteza para tratar la enfermedad de Alzheimer). La administración intratecal provee otro medio para esquivar la barrera hematoencefálica para el suministro de fármacos. Brevemente, los fármacos se administran a la médula espinal, por ejemplo por medio de punción lumbar o usando dispositivos tales como bombas. La punción lumbar es preferible para administración única o infrecuente, mientras que la administración constante o crónica se puede lograr usando cualquier bomba disponible comercialmente, unida a un catéter intraespinal, por ejemplo una bomba y catéter hechos por Medtronic (Mineapolis, Minnesota). Para permitir el suministro a través de la BHE, las composiciones de la invención se pueden administrar junto con un compuesto o compuestos que inducen un aumento transitorio de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Tales compuestos incluyen manitol, Cereport (RMP-7), y KB-R7943, un bloqueador del intercambio de Na+/Ca++. En otras modalidades, los compuestos (por ejemplo, los compuestos identificados usando los métodos de exploración de la invención) se pueden modificar (por ejemplo, por lipidacion, acetilacion), para aumentar su transporte a través de la barrera hematoencefálica después de su administración sistémica (por ejemplo, parenteral), usando las modificaciones químicas estándares de la técnica. En una modalidad, los compuestos de la invención se conjugan con vectores de péptido que son transportados a través de la BHE. Por ejemplo, los compuestos se pueden conjugar con un anticuerpo monoclonal para el receptor de insulina humano como lo describe Partridge {Jpn. J. Pharmacol. 87:97-103, 2001 ), permitiendo así que el compuesto sea transportado a través de la BHE después de su administración sistémica. Los compuestos (por ejemplo los identificados usando los métodos de exploración aquí descritos) se pueden conjugar con dichos vectores de péptido, por ejemplo, usando tecnología de biotina-estreptavidina. En el caso de tratamientos que usan un vector de terapia génica, en lugar de, o además de, localizar el suministro del vector, se pueden usar promotores que restringen la expresión a subpoblaciones particulares de neuronas. Por ejemplo, la expresión de un vector de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson se puede limitar a las neuronas dopaminérgicas usando un promotor de tirosina hidroxilasa. Dosis La dosis de cualquier compuesto aquí descrito o identificado usando los métodos aquí descritos, depende de varios factores que incluyen: el modo de administración, la enfermedad tratada, la severidad del trastorno o enfermedad, si el trastorno o enfermedad se va a tratar o a prevenir, y la edad, peso y salud del sujeto tratado. Con respecto a los métodos de tratamiento de la invención, se considera que la administración de un compuesto a un sujeto no se limita a un modo de administración, dosis o frecuencia de dosis particular; la invención contempla todos los modos de administración, incluyendo intracraneal, intratecal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intravesicular, intraarticular, subcutánea, o cualquier otra vía adecuada para proveer una dosis eficaz para tratar la enfermedad asociada con el estrés oxidativo. El compuesto se puede administrar al sujeto en una sola dosis o en múltiples dosis. Por ejemplo, un compuesto aquí descrito o identificado usando los métodos de exploración de la invención, se puede administrar una vez a la semana, por ejemplo durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, o 20 semanas, o más. Se entiende que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosis específicos se deben ajustar con el tiempo de acuerdo con las necesidades del individuo y según el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración del compuesto. Por ejemplo, la dosis de un compuesto se puede aumentar si la dosis más baja no provee un tratamiento eficiente. Por el contrario, la dosis del compuesto se puede disminuir si la enfermedad disminuye o se elimina. Aunque finalmente el médico encargado decidirá la cantidad y régimen de dosificación adecuados, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto aquí descrito (por ejemplo una tioneína modificada con unión de zinc reducida), o identificado usando los métodos de exploración de la invención, puede estar, por ejemplo, en la escala de 0.0035 pg a 20 pg/kg de peso corporal /día, o 0.010 pg a 140 pg/kg de peso corporal /semana. Convenientemente, una cantidad terapéuticamente efectiva está en la escala de 0.025 pg a 10 pg/kg, por ejemplo por lo menos 0.025, 0.035, 0.05, 0.075, 0.1 , 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, o 9.0 pg/kg de peso corporal, administrados diariamente, cada tercer día, o dos veces a la semana. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva puede estar en la escala de 0.05 pg a 20 pg/kg, por ejemplo, por lo menos 0.05, 0.7, 0.15, 0.2, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, o 18.0 pg/kg de peso corporal, administrados cada semana, cada dos semanas, o una vez al mes. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto puede estar, por ejemplo, en la escala de 100 pg/m2 a 100,000 pg/m2, administrados cada tercer día, cada semana, o cada dos semanas. En una modalidad deseable, la cantidad terapéuticamente efectiva está en la escala de 1000 pg/m2 a 20,000 pg/m2, por ejemplo, por lo menos 1000, 1500, 4000, o 14,000 pg/m2 del compuesto administrado diariamente, cada tercer día, dos veces a la semana, cada semana, o cada dos semanas. El siguiente ejemplo tiene la finalidad de ilustrar la invención, mas no limitarla.
EJEMPLO Síntesis de metalotioneína o tioneína En un ejemplo, la metalotioneína sustituida con selenocisteína se sintetiza esencialmente como se describe en WO 00/50448. Brevemente, este método incluye los siguientes pasos: (a) sintetizar MT o T usando un soporte sólido y por lo menos dos alfa-aminoácidos que tienen grupos amino alfa seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo alifático (por ejemplo, hidrógeno o alquilo), aminoácidos con cadenas laterales que contienen grupos aromáticos, aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo azufre (por ejemplo, un tiol o un tioéter), aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo hidroxilo, aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo amino, aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo guanidinio, aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo carboxilato, y aminoácidos con cadenas laterales que contienen un grupo amido. Los grupos amino alfa se protegen con Fmoc, t-Boc o CBZ. Loas grupos carboxilato se protegen con un éster de t-butilo o un éster de bencilo. Los grupos hidroxilo se protegen con un éter de t-butilo o un éster de dimetilfosfato. Los grupos amino se protegen con un t-BOC o CBZ. Los grupos tiol se protegen con un grupo acetimidometilo. Después del paso (a), el paso (b) del método incluye separar del soporte sólido el péptido sintetizado en el paso (a) y después remover los grupos protectores no acetimidometilo. El paso (c) incluye purificar el péptido obtenido en el paso (b), y el paso (d) incluye precipitar el péptido obtenido en el paso (c). El paso (e) incluye remover el grupo protector acetimidometilo con una solución que comprende una sal de plata (I). La secuencia primaria de aminoácidos de MT o T puede diferir de la secuencia de tipo silvestre. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede contener la sustitución de uno o más residuos no cisteínicos por cualquier aminoácido natural o no natural. En algunas modalidades, uno o más residuos de cisteína se sustituyen por selenocisteína. Otras modificaciones incluyen la adición de una o más repeticiones de la secuencia primaria del dominio alfa o beta de MT. Estas repeticiones se pueden fusionar entre sí en orden o en cualquier disposición de dominios alfa y beta. Los dominios se pueden separar con una secuencia espaciadora de uno o más aminoácidos. En un dominio repetido, uno o más residuos de cisteína se pueden sustituir por selenocisteína. El paso (a) del método se puede realizar usando un sintetizador automático de fase sólida. Los grupos amino alfa se pueden proteger con un grupo protector Fmoc, los grupos carboxilato se pueden proteger con un grupo protector éster ter-butílico, los grupos hidroxilo se pueden proteger con un grupo protector éter ter-butílico, y los grupos amino se pueden proteger con un grupo protector t-Boc. El paso de separación (b) se puede realizar usando una solución que comprende aproximadamente 75 partes en peso de fenol, aproximadamente 28 partes en peso de etanoditiol, aproximadamente 53 partes en peso de tioanisol, aproximadamente 50 partes en peso de agua, y aproximadamente 142 partes en peso de ácido trifluoroacético; y el paso de purificación (c) se realiza por cromatografía de filtración en gel usando un gel preparado de glóbulos que comprenden dextrano, que ha sido entrelazado con epiclorhidrina bajo condiciones alcalinas, en donde los glóbulos secos tienen un diámetro en la escala de aproximadamente 20 mieras a aproximadamente 150 mieras, y en donde el gel se prepara y se eluye con una solución acuosa que comprende ácido trifluoroacético al 0.1%. El paso de remoción (e) se puede realizar con una solución que comprende nitrato de plata (I) en ácido acético. La metalotioneína o tioneína producida puede contener un metal o puede estar libre de metal. Cuando contiene metal, el metal se puede seleccionar del grupo que consiste en los metales del grupo principal, metales de transición, lantánidos y actínidos. El metal también puede ser zinc, cobre, oro, cadmio, hierro, cobalto, calcio, selenio, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, lantano, o una combinación de los mismos. Todas las patentes, solicitudes de patente que incluyen las solicitudes de patente de EE. UU. Nos. 60/787,400, presentada el 30 de marzo de 2006, y 60/838,582, presentada el 23 de agosto de 2006, y las publicaciones mencionadas en esta especificación, se incorporan como referencia como si se indicara individual y específicamente que se incorporan por referencia.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la metalotioneína o tioneína, en donde por lo menos un átomo de azufre está sustituido por uno de selenio. 2. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho átomo de azufre está en un residuo de cisteína de dicho polipéptido. 3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque diez residuos de cisteína de dicho polipéptido están sustituidos por selenocisteína. 4. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque todos los residuos de cisteína de dicho polipéptido están sustituidos por selenocisteína. 5. - Un polipéptido que comprende un fragmento de metalotioneína o tioneína, en donde por lo menos un átomo de azufre está sustituido por selenio y dicho fragmento es capaz de unirse a un metal. 6.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho azufre está en un residuo de cisteína de dicho polipéptido. 7.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque todos los residuos de cisteína de dicho polipéptido están sustituidos por selenocisteína. 8.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho fragmento comprende un dominio a o un dominio ß de metalotioneína o tioneína. 5 9.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho metal es el zinc. 10. - Un método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, dicho método comprendiendo los siguientes pasos: (a) poner en contacto un '10 compuesto con metalotioneína y un segundo polipéptido que comprende un aminoácido capaz de oxidarse; y (b) medir la cantidad de metal liberado de dicha metalotioneína y la formación de un aminoácido oxidado sobre dicho segundo polipéptido en presencia de dicho compuesto, en donde un compuesto que (i) aumenta la liberación de metal de la metalotioneína, y (ii) 15 no aumenta sustancialmente la cantidad de dicho aminoácido oxidado en dicho segundo polipéptido en comparación con la misma prueba en ausencia de dicho compuesto, indica que dicho compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, 20 caracterizado además porque dicho compuesto se selecciona de una colección química. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho aminoácido oxidado es sulfóxido de metionina. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho metal es zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, 5 manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho metal es el zinc. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 10, •10 caracterizado además porque dicho segundo polipéptido es metalotioneína o tioneína. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho aminoácido oxidado es sulfóxido de metionina. 15 17.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, 20 progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa. 18.- Un método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto; y (b) medir la cantidad de metalotioneína o tioneína y el estado de oxidación de dicha célula o extracto celular, en donde un compuesto que (i) aumenta la cantidad de tioneína o disminuye la cantidad de metalotioneína, y (ii) sustancialmente no aumenta el estado de oxidación de dicha célula o extracto celular, en comparación con una célula o extracto celular que no se puso en contacto con dicho compuesto, indica que dicho compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho compuesto se selecciona de una colección química. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha medición del estado de oxidación comprende detectar la presencia de un aminoácido oxidado. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho aminoácido oxidado es el sulfóxido de metionina. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Wemer, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ¡leitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa. 5 23.- Un método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto con una célula o extracto celular que comprende un polinucleótido que codifica tioneína; y (b) medir la expresión de tioneína en dicha célula o extracto celular, • 10 en donde un aumento de la expresión de tioneína en presencia de dicho compuesto, en comparación con su ausencia, indica que dicho compuesto es un compuesto candidato para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, 15 caracterizado además porque dicho compuesto se selecciona de una colección química. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la 20 enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Wemer, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa. 26. - Un método para identificar una variante de tioneína con afinidad disminuida por un metal, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) introducir una mutación de punto, inserción o supresión en la tioneína, o 5 alterar químicamente la tioneína, creando así una tioneína modificada; y (b) determinar la afinidad de dicha tioneína modificada por dicho metal, en donde una afinidad disminuida por dicho metal indica que dicha tioneína modificada es una variante de tioneína con afinidad disminuida por el metal. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, • 10 caracterizado además porque dicho paso (b) de determinación también comprende medir la actividad reductora de dicha tioneína modificada, en donde una disminución no sustancial de la actividad reductora de dicha tioneína modificada indica que dicha tioneína modificada es una variante de tioneína activa de oxidación-reducción con una afinidad disminuida por un 15 metal. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha mutación de punto comprende una mutación de punto de cisteína a selenocisteína. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 26, 20 caracterizado además porque dicho metal es el zinc, cobre, cadmio, plomo, plata, gadolinio, cobalto, calcio, oro, selenio, arsénico, tungsteno, aluminio, manganeso, hierro, cromo, níquel, molibdeno, bario, estroncio, bismuto, hafnio, tecnecio, o lantano. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho metal es el zinc. 31. - El uso de una variante de tioneína identificada usando el método de la reivindicación 26 en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una enfermedad asociada con el estrés oxidativo en un paciente. 32. - El uso como el que se reclama en reivindicación 31 , en donde dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia muscular, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa. 33.- El uso de un agente quelante en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de un paciente con una enfermedad asociada con el estrés oxidativo, en donde dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de dificultad respiratoria, distrofia, cataratogénesis, artritis reumatoide, progeria, síndrome de Werner, aterosclerosis, diabetes, hipertensión esencial, fibrosis quística, ileitis regional (enfermedad de Crohn), degeneración macular, ataque cerebral, isquemia, y colitis ulcerativa.
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