CN1127532A

CN1127532A - 通过测定gage肿瘤排斥抗原前体的表达来诊断疾病的方法

Info

Publication number: CN1127532A
Application number: CN94192843A
Authority: CN
Inventors: 贝努瓦·范登艾恩德; 蒂尔瑞·布恩-法勒尔
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1996-07-24
Anticipated expiration: 2014-07-13
Also published as: EP0711355B1; CA2167692A1; FI960268A; DE69431301D1; NZ269435A; WO1995003422A1; KR100281178B1; CA2167692C; FI960268A0; NO960158D0; DE69431301T2; TW498104B; AU7332294A; NO960158L; EP0711355A4; EP0711355A1; AU677687B2; CN1059465C; US5610013A; ATE223435T1

Abstract

公开了一个肿瘤排斥抗原前体新家族和编码他们的核酸分子。这些肿瘤排斥抗原前体被称为GAGE肿瘤排斥抗原前体、编码他们的核酸分子被称为GAGE编码分子。描述了编码序列、肿瘤排斥抗原以及他们的前体分子在诊断和治疗方面的各种应用。

Description

通过测定GAGE肿瘤排斥抗原前体的表达来诊断疾病的方法

相关申请

本申请是申请日为1993年7月22日、申请号为08/096,039的待批专利申请的部分继续申请。发明领域

本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。更具体地，本发明涉及一些基因，所述的基因的肿瘤排斥抗原前体被特别加工成至少一种由HLA-CW6分子呈递的肿瘤排斥抗原。所谈及的基因似乎不与其它已知的肿瘤排斥抗原前体编码序列相关。

背景技术和现有技术

晡乳动物的免疫系统对外来物或异物的识别和反应的过程是复杂的。该系统的一个重要的方面是T淋巴细胞或“T细胞”应答。这种应答要求T细胞识别被称为人类白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合体(“MHCs”)的细胞表面分子复合体和多肽并与其相互作用。多肽来源于由也呈递HLA/MHC分子的细胞加工的较大分子。详见Male等，Advanced mmunology(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是6-10章。T细胞和HLA/肽复合体的相互作用是受限制的，需要HLA分子和多肽的特定组合特异的T细胞。如果某种特异T细胞不存在，即使是它的配体复合体(partner complex)存在也将无T细胞应答。同样地，如果特异复合体不存在，即使T细胞存在也将无应答。这个机制涉及到免疫系统对外来物的应答、自身免疫病和对细胞异常的应答。许多工作集中在蛋白质被加工成HLA结合肽的机理。关于这一方面详见Barinaga，Science 257：880(1992)；Fremont et al.，Science 257：919(1992)；Matsumura et al.，Science 257：927(1992)；Latron et al.，Science 257：964(1992)。

T细胞识别细胞异常的机理也适用于癌。例如，在作为参考文献的PCT申请PCT/US92/04354(申请日为1992年5月22日、公布日为1992年11月26日)中，公开了一个被加工成肽，随后在细胞表面上表达的基因家族，通过特异CTLs溶细胞T淋巴细胞(或后文简称“CTLs”)，该基因能导致肿瘤细胞的溶解。这些基因被认为编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，由之而来的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。关于这个基因家族的详细信息可见Traversari，et al.，Immunogenetics 35：145(1992)；van der Bruggenet al.，Science 254：1643(1991)，也可见U.S.专利申请807,043，申请日为1991年12月12日，现在为U.S.专利________。

在作为参考文献的美国专利申请938,334中，解释了MAGE-1基因编码肿瘤排斥抗原前体，该前体被加工成由HLA-A1分子呈递的九肽。参考文献指出，如果给出特定肽对特定HLA分子的已知特异性，就可预期有一个特定肽结合到一个HLA分子，而不结合到其它分子。这一点非常重要，因为不同个体拥有不同的HLA表型。结果是，当确定某一特定肽是某特定HLA分子的配体具有诊断和治疗的分类时，他们仅与具有那个特定HLA表型的个体有关。需要在这领域中进一步的工作，因为细胞异常不局限在一个特定的HLA表型，定向治疗需要一些关于组织中异常细胞的表型的知识。

在作为参考文献的申请日为1993年1月22日的U.S.专利申请008,446中，公开了MAGE-1表达产物被加工成二级TRA的事实。该二级TRA通过HLA-C克隆10分子呈递。该公开物显示给定的TRAP能产生许多TRAs。

在作为参考文献的申请日为1992年12月22日的U.S.专利申请994,928中，指出由一些正常细胞(如黑色素细胞)产生的酪氨酸酶在肿瘤细胞中加工产生由HLA-A2分子呈递的肽。

在全文作为参考文献的申请日为1993年3月18日的U.S.专利申请08/032,978中，指出一种不是由酪氨酸酶衍生的二级TRA是由HLA-A2分子所呈递。该TRA来源于TRAP，但由一个非MAGE基因编码。该公开物显示特定HLA分子可以呈递不同来源的TRAs。

在作为参考文献的申请日为1993年6月17日、U.S.专利申请___中，描述了一个不相关的肿瘤排斥抗原前体，即所谓的“BAGE”前体，BAGE前体与MAGE家族不相关。

上述论文、专利和专利申请所显示的工作，大部分是关于MAGE基因家族基因和不相关的BAGE基因。然而，现在发现细胞还表达另外的肿瘤排斥抗原前体。这些肿瘤排斥抗原前体被称为“GAGE”肿瘤排斥抗原前体。他们既不显示与MAGE基因家族同源，也不显示与BAGE基因同源。因此，本发明涉及编码诸如TRAPs的基因、肿瘤排斥抗原前体本身，以及二者的应用。

以下将详细描述本发明。

附图的简要描述

图1表示用CTL克隆76/6进行溶解的研究。

图2显示来自不同转染子和对照组的肿瘤坏死因子(“TNF”)的释放分析。

优选实施方案的详细描述

实施例1

以标准方法学用来自患者MZ2的黑素瘤细胞建立一个黑素瘤细胞系，MZ2-MEL。在全文作为参考文献的申请日为1993年6月17日、公布日为92年11月26日的PCT申请PCT/US92/04354中，报道了这个细胞系。一旦细胞系建成，取自其中的一份样品被照射，以便使其不能增殖。这些照射后的细胞被用于分离特异的溶细胞T细胞克隆(“CTLs”)。

外周血单核细胞(“PBMCs”)的样品取自患者MZ2并与照射后的黑素瘤细胞接触。观察混合物中黑素瘤细胞的溶解，溶解现象预示样品中存在特异于由黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子复合体的CTLs。

采用的溶解试验是参照Herin et al在Int.J.Cancer 39：390-396(1987)所述的铬释放试验，所述的文献作为本文的参考文献。但是该试验如本文所述。体外培养靶黑素瘤细胞，然后以10⁷细胞/ml悬浮在补加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中，并与200μCi/ml Na(⁵¹Cr)O₄-起在37℃温育45分钟。用补加10mMHepes的DMEM洗标记细胞三次，然后悬浮在补加10mMHepes和10％FCS的DMEM中，随后将含10³细胞的100μl等份加到96孔微量滴定板中。加入溶于100μl相同培养基中的PBLs样品，检测共进行两份。在100g离心板4分钟，并在8％CO₂气氛中于37℃温育4小时。

再次离心板，收集100μl等份并计数。⁵¹Cr的释放百分比如下计算：

其中ER为测量的实验⁵¹Cr释放，SR是将10³标记细胞与200μl培养基单独温育所测得的自发释放，MR是通过向靶细胞中加入100μl 0.3％TritonX-100得到的最大释放。

通过有限稀释扩增和克隆显示高CTL活性的单核学样品，并用同样的方法再一次筛选，由此分离到CTL克隆MZ2-CTL76/6，以下称此克隆为“76/6”。

用同样的方法检测靶K562细胞和黑素瘤细胞系。图1显示这一CTL克隆识别并溶解黑素瘤细胞系即MZ2-MEL而不是K562。随后用上述同样的方式检测该克隆对其它黑素瘤细胞系以及自身EBV转化的B细胞的作用。图1显示用Epstein Barr病毒(“EBV”)转化的自身B细胞不被溶解，并且当MZ2-MEL 3.0被CTL克隆76/6溶解时，细胞系MZ2-MEL.4F-，一个不表达F抗原的变种，不被溶解。因此，该克隆似乎是该抗原特异的。

上述结果不能指出哪个HLA分子呈递TRA。已知溶解细胞系即MZ2-MEL表达HLA-A1、HLA-A29、HLA-B37、HLA-B44、HLA-Cw6和HLA-C克隆10。在本文末报道但接着本实施例程序进行的实验中，检测了MZ2-MEL的亚系，该亚系不表达HLA分子A29、B44和C克隆10。该亚系被溶解，因此预示呈递分子应为A1、B37或Cw6中的一个。

实施例2

进行了进一步的研究以确定76/6在接触靶细胞时是否也能产生肿瘤坏死因子(“TNF”)。使用的方法描述于Travrsarl等，Immunogenetics 35：145-152(1992)，该文献作为本发明的参考文献。简单地，将CTL系的样品与在培养液中的感兴趣的靶细胞样品相结合。24小时后，除去培养物的上清，接着在TNF敏感的WEHI细胞上进行检测。细胞系MZ2-MEL 43，在上述以及引述的参考文献中所讨论的MZ2-MEL细胞系的一个亚克隆，产生很强的应答，并用于以下的实验。

实施例3

实施例2的结果表明MZ2.MEL.43呈递感兴趣的靶抗原。因此，其被作为总mRNA的来源而制备cDNA文库。

从细胞系中分离总RNA。mRNA用一寡dT结合试剂盒根据公知的技术分离。得到mRNA后，用包含NotI位点的寡dT引物通过反转录将其转录成cDNA，随后进行第二链的合成。cDANA之后同BstXI受体联结，经NotI消化，在一Sephacryl S-500HR柱进行大小分级，之后无定向地克隆进pcDNA-I-Amp的BstXI和NotI位点。重组质粒之后电穿孔进入E.coli DH5α。将100个重组细菌总共分为1500个库(pool)在微孔上种植。每个包含约100个cDNA，因为大约所有的细菌包含有一个插入子。

每个库扩增至饱和，质粒DNA经无酚抽提的碱裂解和醋酸钾沉淀而被提取。

实施例4

在实施例3制备文库后，将cDNA转染入真核细胞。本文描述的转染成对进行。COS-7细胞的样品以15,000细胞/孔被种植在含有补加10％胎牛血清的Dulbecco的改进的Eagles培养基(“DMEM”)的组织培养平底微孔中。细胞在37℃温育过夜，去除培养基，接着以50ul/孔加入含10％Nu血清，400ug/ml DEAE-葡聚糖，100μM氟喹的DMEM培养基和100ng的质粒。如上所述，溶解研究并不能确定哪个HLA分子呈递抗原。结果是分别使用呈递抗原的每个HLA分子(Al，B37，Cw6)的cDNA共转染细胞。具体地，用和在转染文库中相同的操作步骤，使用28ng克隆在pCD-SRα中的HLA-A1的cDNA，如同使用50ng在pcDNA-I-Apm中的HLA-B37的cDNA，或75ng在pcDNA-I-Amp中的HLA-Cw6的cDNA。

转染在成双份的孔中进行，但仅500个库的HLA-Cw6转染子能在单孔中检测。在37℃温育4小时后，去除培养基，加入50μl含10％DMSO的PBS。2分钟后除去这种培养基以200μl补加10％FCS的DMEM替代。

在培养基改变后，COS细胞在37℃温育24-48小时。之后去掉培养基，加入含在100μl含补加20-30U/ml IL-2的10％血库人血清的Iscove培养基中的1000-3000个CTL克隆76/6细胞。在24小时后除去上清，如Traversari等在Immunogenetics35：145-152(1992)所述在WEHI细胞上分析确定TNF的含量，该文献作为本发明的参考文献。

用HLA-A1转染的1500个库，及用HLA-B37转染的1500个库分别刺激TNF释放至浓度15-20pg/ml，或2-6pg/ml。大多数的HLA-Cw6转染子产生3-20pg/ml，只有一个库产生多于60pg/ml。这个库被选择用于进一步的研究。

实施例5

选定的库的细菌被克隆，并检测了600个克隆。从克隆中抽提质粒DNA，以如上所述相同的方法转染入一新的COS细胞样品，再次检测该细胞对CTL克隆76/6的刺激。发现了94个阳性克隆。对其中一个称之为cDNA克隆2D6进行了进一步的检查。在一比较检测中，COS细胞同cDNA克隆2D6和HLA-Cw6、单独的HLA-Cw6、或单独的2D6转染。也使用了对照细胞系MZ2-MELF-和MZ2-MEL F⁺。如上所述，用在WEHI细胞上的检测而确定释放进入CTL上清的TNF。存活的WEHI细胞的最佳浓度用MTT测定。图2显示转染HLA-Cw6和cDNA-2D6的COS细胞，及细胞系MZ2-MEL F⁺刺激TNF从CTL克隆76/6的释放，表明HLA-Cw6呈递本发明的TRA。

实施例6

cDNA 2D6用本领域已知的技术测序。序列检索发现质粒插入片段同已知基因或蛋白无同源性。序列ID号：1给出已鉴定基因，下文称为“GAGE”的cDNA核苷酸信息。推定的开放阅读框架定位于分子的51-467为碱基。

实施例7

在如实施例6的cDNA测序后，进行实验确定正常组织的细胞是否表达基因，为了确定之，如下所示在组织和肿瘤细胞系上进行Northern印迹分析。印迹分析实验用SEQ ID NO：1的完整序列的cDNA。接着使用PCR证实结果。

表1.基因GAGE的表达正常组织PHA激活的T细胞 -CTL克隆82/30 -肝 -肌肉 -肺 -脑 -肾 -胎盘 -心 -皮肤 -睾丸 +肿瘤细胞系黑素瘤 7/16肺癌 1/6肉瘤 0/1甲状腺髓样癌 0/1肿瘤样品黑素瘤 1/1

实施例8

正常组织和肿瘤的详细分析通过用多聚酶链反应(“PCR”)和上述的GAGE基因信息而进行。

首先，总RNA来自特定的样品，用本领域公知技术。总RNA用于制备cDNA。用于制备cDNA的操作步骤包括4μl的5×逆转录缓冲液，1μl的每种dNTP(10mM)，2μl的DTT(100mM)，2μl的dT-15引物(20μM)，0.5μl的RNasin(40单位/μl)和IμlM-MLV逆转录酶(200单位/μl)的混合物。接着，加入6.5μl的模板RNA(1μg/3.25μl水或2μg总模板RNA)。混物合的总体积是20μl。在42℃混合和温育60分钟后，放在冰上。之后加入总量为80μl的水至总体积为100μl。混合物在20℃保存至在PCR中使用。

为进行PCR，使用SED ID NO分别为2和3的引物

5′-AGA CGC TAC GTA GAG CCT-3′

(正义)

和

5′-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3′

(反义)反应剂包括30.5μl水、5μl 10×PCR缓冲液、1μl每种dNTP(10μM)、2.5μl每种引物(20μM)，和0.5μl的多聚酶“Dynazyme”(2单位/μl)。总体积为45μl。加入总量为5μl的cDNA(相当于100ng总RNA)。将混合物合并，加入一滴矿物油，将混合物转移至预热至94℃的热循环仪，扩增进行30个循环，每个循环由以下所组成：

第一次变性： 94℃，4分钟

变性： 94℃，1分钟

退火： 55℃，2分钟

延伸： 72℃，3分钟

最后的变性： 72℃，15分钟循环后，10μl等份在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色。

用以上引物进行的cDNA扩增产生—238碱基对片段。无污染的基因组DNA(如果存在)的扩增。

表2显示了以下的结果。结果证实正常的组织只有睾丸表达GAGE，而许多肿瘤，包括黑素瘤，肺，乳腺，咽，喉，肉瘤，睾丸精细胞瘤，膀胱和直肠均表达该基因。因此可通过检测GAGE基因的表达而检测任一种这些肿瘤。

表2

GAGE基因表达的RT-PCR分析

正常组织

心 -

脑 -

肝 -

肾 -

脾 -

淋巴细胞 -

骨髓 -

皮肤 -

痣 -

黑色素细胞 -

成纤维细胞 -

前列腺 -

睾丸 +

卵巢 -

乳腺 -

肾上腺 -

肌肉 -

胎盘 -

腰椎 -

肿瘤

细胞系肿瘤样品黑素瘤 40/63 46/146(32％)肺癌上皮样癌 10/41(24％)腺癌 4/18小细胞肺癌 6/23 0/2乳腺癌 15/146(10％)头部和颈部肿瘤咽 6/15(40％)喉 3/13肉瘤 1/4 6/18(33％)睾丸精细胞瘤 6/6(100％)膀胱癌 5/37(14％)前列腺癌 2/20直肠癌 5/13 0/38肾癌 0/6 0/45白血病 3/6 0/19

以上的实施例显示了编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的分离。这“TRAP”编码分子，却是同以上文献中描述的任何以前发现的MAGE和BAGE编码序列不同源。因此，本发明的一个方面是包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的分离的核酸分子。该序列不是MAGE或BAGE编码序列，这一点在将其与上述文献所述的任何这些基因的序列相比可以看出。本发明的另一部分是编码非MAGE和非BAGE肿瘤排斥抗原前体、但在严格条件下同包含上述核苷酸序列的核酸分子杂交的核苷酸序列。本文的“严格条件”指的是本领域熟悉的参数。更具体地，本文的严格条件指的是在1M NaCl，1％SDS和10％的硫酸葡聚糖中杂交，之后滤膜在室温在2×SSC中5分钟洗二次，并在2×SSC，0.1％SDS中洗30分钟。还可使用其它能产生相同或更高程度的严格性的条件、试剂等。本领域的技术人员熟悉这些条件，因此本文没有给出。

在这些实施例中还能看出本发明包括在表达载体中的序列的使用，以及转染宿主细胞和细胞系，包括那些原核细胞(如：E.coli)或真核细胞(如CHO或COS细胞)。表达载体需要相关序列，即上述的那些序列，同启动子有效相联。因为已经发现人白细胞抗原HLA-Cw6呈递一来源于这些基因的肿瘤排斥抗原，所以表达载体也可包括编码HLA-Cw6的核酸序列。在载体包含两种编码序列的情况下，其可被使用去转染正常下不表达二个序列中任何一个的细胞。在例如宿主细胞已表达HLA-Cw6时，可仅使用肿瘤排斥抗原编码序列。当然对可使用的具体的宿主细胞没有限制。正如如果需要的话，包含二个编码序列的载体能在HLA-Cw6呈递细胞中使用，肿瘤排斥抗原的基因能在不表达HLA-Cw6的宿主细胞中使用。

本发明还包括所谓的表达试剂盒，其可允许研究人员制备需要的表达载体。这些表达试剂盒至少包括独立的每个上述编码序列的部分。如果需要，可加入其它成分，只要所需的上述序列被包括在内。

为了将本发明的核酸分子和TRAPs与以前所述的MAGE和BAGE物质区分，本发明被称之为GAGE家族基因和TRAPs。因此，本文使用的“GAGE”指的是通过上述序列编码的肿瘤排斥抗原。“GAGE编码分子”和相似术语是用于描述核酸分子本身。

本文中描述的发明有许多应用，本文描述了其中的一些应用。首先，本发明允许本领域技术人员诊断以TRAP表达为特征的疾疾。这些方法包括测定TRAP基因的表达，和/或由其产生的TRAs如HLA-Cw6呈递的TRA。在前者的情况下，这些测定可经任何标准的核酸测定方法，包括多聚酶反应或用放射性杂交的探针分析法而实现。在后者的情况下，特别优选的是用TRA和HLA复合体的配体，如抗体进行的分析。另一种测定方法是上述的TNF释放检测。为进行这种检测，最好确定睾丸细胞是不存在的，因为它们正常表达GAGE。然而，这一点不是重要的，因为常规能区分开睾丸和其它细胞类型。而且，在非睾丸样品中实际上不可能有睾丸细胞。

TRAP基因的分离使得能分离TRAP分子本身，特别是包含经SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列的TRAP分子。这些分离的分子当作为TRA或TRA和HLA复合体如HLA-Cw6呈递时，能同如助剂等材料合并以生产用于治疗以TRAP分子表达为特征的疾病的疫苗。而且，疫苗可以从在其表面呈递TRA/HLA复合体的细胞如非增殖癌细胞，非增殖转染体等中制备。在所有细胞用作疫苗的情况下，这些细胞可以是被提供CTL应答所必需的一个或二个成分的编码序列所转染的细胞，或是表达二个没有转染的分子的细胞。另外，用本领域熟悉的标准的技术，TRAP分子，它的相关的TRAs，以及TRA和HLA的复合体能用于产生抗体。

本文的“疾病”指的是任何肿瘤排斥抗前体表达的病变。这种疾病的一个例子是癌，尤其是黑素瘤。黑素瘤是公知的色素产生细胞癌。

基于本发明的治疗方法是以导致TRA呈递细胞，如HLA-Cw6细胞的溶解的病人免疫系统的应答为前提。一个方法是给予在组织中有核型异常细胞的病人以特异于复合体的CTLs。在体外发生这样的CTLs属于本领域技术范围之内。具体地，将细胞的样品，如血细胞，与呈递复合体并能激发特异CTL增殖的细胞接触。靶细胞可以是一个转染子，如上述类型的COS细胞。这些转染子在其表面上呈递所需的复合体，并且在与感兴趣的CTL结合时，刺激它的增殖。本文中所用的COS细胞与其它合适的宿主细胞一样可很容易地得到。

为详细说明治疗法，参见过继转移(Greenberg，J.Immunol，136(5)：1917(1986)；Riddel et al.，Science 257：238(7-10-92)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.21：1403-1410(1991)；Kast et al.，Cell59：603-614(11-17-89))，其中呈递所需复合体的细胞是同导致特异于该复合体的CTLs增殖的CTLS结合。增殖的CTLs随后给予以呈递特定复合物的异常细胞为特征的细胞异常的患者，复合体包含了有关的HLA分子。CTLs溶解异常的细胞，因此得到所需的治疗目的。

以上的治疗假定至少有一些患者的异常细胞呈递有关的HLA/TRA复合体。这能很容易被确定，因为本领域人员很熟悉鉴定呈递特定HLA分子的细胞的方法，以及如何鉴定表达有关序列(本例中为GAGE序列)DNA的细胞的方法。一旦经过现有的筛选方法鉴定了呈递有关复合体的细胞，他们可以与包含CTLs的来自患者的样品结合。如果复合体呈递细胞被混合的CTL样品溶解，随后就可以推测GAGE来源的肿瘤排斥抗原被呈递，患者是上述治疗的合适人选。

过继转移不只是根据本发明的有效的治疗唯一类型。CTLs也可用许多方法在体内被激活。一种方法，如表达复合体的非增殖细胞的使用，以如上所述。在此方法中所用的细胞可以是那些正常表达复合体的细胞，如被照射的黑素瘤细胞或用一或二个呈递复合体所需的基因转染的细胞。Chen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：110-114(1991年1月)介绍了这项技术，显示在治疗方法中使用了表达HPV E7肽的转染细胞。可采用不同类型的细胞。相似地，可使用携带一个或二个感兴趣基因的载体。病毒或细菌载体是特别优选的。在这些系统中，感兴趣的基因被例如Vaccinia病毒或细菌BCG以及事实上“感染”宿主细胞的物质携带。得到的细胞呈递感兴趣的复合体，并被增殖的自身CTLs所识别。将肿瘤排斥抗原或前体与促进掺入到HLA-Cw6呈递细胞(该细胞随后能呈递感兴趣的HLA/肽复合体)的助剂合并能获得相似的效果。TRAP被加工产生HLA分子的肽配体，而TRA呈递不需要进行一步的处理。

本发明的其它方面对本领域技术人员是清楚的而不需要在这里重复。

采用的术语和表达法是作为描述术语而不是局限性的，使用这些术语和表达法不意味排除任何所示或所述的特征的等同术语或其部分，应理解的是在本发明的范围内可做出各种改进。

(1)一般信息(i)申请人：Boon-Falleur，Thierry；Van den Eynede，Benoit(ii)发明名称：通过测定GAGE肿瘤排斥抗原前体的表达来诊断疾病的方法(iii)序列数目：1(iv)联系地址：

(A)收信人：Felfe &Lynch

(B)街道：805 Third Avenue

(C)城市：New York City

(D)州：New York

(E)国家：美国

(F)邮编：10022(v)计算机可读形式：

(A)媒介类型：5.25寸软盘，360kb存储

(B)计算机：IBM PS/2

(C)操作系统：PC-DOS

(D)软件：Wordperfect(vi)当前申请资料：

(A)申请号：08/250,162

(B)申请日：1994年5月27日

(C)分类(vii)在先申请资料

(A)申请号：08/096,039

(B)申请日：1993年7月22日

(C)分类(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Hanson，Norman D.

(B)注册号：30,946

(C)文献/档案号：LUD323.1(ix)通讯联系信息：

(A)电话：(212)688-9200

(B)传真：(212)838-3884SED ID NO：1的信息：序列特征：

(A)长度：648碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性序列的描述：SEQ ID NO：1AGCTGCCGTC CGGACTCTTT TTCCTCTACT GAGATTCATC TGTGTGAAAT ATGAGTTGGC 60GAGGAAGATC GACCTATCGG CCTAGACCAA GACGCTACGT AGAGCCTCCT GAAATGATTG 120GGCCTATGCG GCCCGAGCAG TTCAGTGATG AAGTGGAACC AGCAACACCT GAAGAAGGGG 180AACCAGCAAC TCAACGTCAG GATCCTGCAG CTGCTCAGGA GGGAGAGGAT GAGGGAGCAT 240CTGCAGGTCA AGGGCCGAAG CCTGAAGCTG ATAGCCAGGA ACAGGGTCAC CCACAGACTG 300GGTGTGAGTG TGAAGATGGT CCTGATGGGC AGGAGATGGA CCCGCCAAAT CCAGAGGAGG 360TGAAAACGCC TGAAGAAGAG ATGAGGTCTC ACTATGTTGC CCAGACTGGG ATTCTCTGGC 420TTTTAATGAA CAATTGCTTC TTAAATCTTT CCCCACGGAA ACCTTGAGTG ACTGAAATAT 480CAAATGGCGA GAGACCGTTT AGTTCCTATC ATCTGTGGCA TGTGAAGGGC AATCACAGTG 540TTAAAAGAAG ACATGCTGAA ATGTTGCAGG CTGCTCCTAT GTTGGAAAAT TCTTCATTGA 600AGTTCTCCCA ATAAAGCTTT ACAGCCTTCT GCAAAGAAAA AAAAAAAA 648SED ID NO：2的信息：序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性序列的描述：SEQ ID NO：2AGA CGC TAC GTA GAG CCT 18SED ID NO：3的信息：序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性序列的描述：SEQ ID NO：3CCA TCA GGA CCA TCT TCA 18

Claims

1、一种分离的核酸分子，由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

2、一种分离的核酸分子，其在严格条件下与SEQID NO：1的核苷酸序列杂交，并编码肿瘤排斥抗原的前体，条件是分离的核酸分子不编码MAGE肿瘤排斥抗原前体或BAGE肿瘤排斥抗原前体。

3、一种分离的核酸分子，由SEQ ID NO：1的51-467位核苷酸组成。

4、一种与权利要求1的核酸分子互补的分离的mRNA分子。

5、一种用权利要求1的核酸分子转染的宿主细胞。

6、一种用权利要求2的核酸分子转染的宿主细胞。

7、一种用权利要求3的核酸分子转染的宿主细胞。

8、一种表达载体，包括可操作地与启动子相连的权利要求1的分离的核酸分子。

9、一种表达载体，包括可操作地与启动子相连的权利要求2的分离的核酸分子。

10、一种表达载体，包括可操作地与启动子相连的权利要求3的分离的核酸分子。

11、权利要求5的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是一种表达HLA-Cw6的哺乳动物细胞。

12、权利要求6的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是一种表达HLA-Cw6的哺乳动物细胞。

13、权利要求7的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是一种表达HLA-Cw6的哺乳动物细胞。

14、权利要求8的表达载体，进一步包括编码HLA-Cw6的核酸分子。

15、权利要求9的表达载体，进一步包括编码HLA-Cw6的核酸分子。

16、权利要求10的表达载体，进一步包括编码HLA-Cw6的核酸分子。

17、表达试剂盒，包括下列每个分开的部分：

(i)权利要求1的分离的核酸分子，和

(ii)编码HLA-Cw6的核酸分子。

18、表达试剂盒，包括下列每个分开的部分：

(i)权利要求2的分离的核酸分子，和

(ii)编码HLA-Cw6的核酸分子。

19、表达试剂盒，包括下列每个分开的部分：

(i)权利要求3的分离的核酸分子，和

(ii)编码HLA-Cw6的核酸分子。

20、一种由权利要求1，2或3的核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体。

21、用于治疗以表达GAGE)肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病患者的方法，所述的前体被加工成由HLA-Cw6分子呈递的肿瘤排斥抗原，该方法包括：给予所述患者足以改善所述疾病的量的溶细胞性T细胞，该细胞对所述的GAGE衍生的肿瘤排斥抗原与HLA-Cw6分子的复合体是特异的，并能溶解呈递所述复合体的细胞。

22、用于治疗以表达由包含SEQ ID NO：1的51-476位核苷酸序列的核酸分子编码的肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病患者的方法，该方法包括：给予所述患者足以改善所述疾病的量的溶细胞性T细胞，该细胞对HLA分子和由所述的肿瘤排斥抗原前体衍生的肿瘤排斥抗原的复合体是特异的。

23、用于治疗以表达GAGE肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病患者的方法，所述的前体被加工成由HLA-Cw6分子呈递的肿瘤排斥抗原，该方法包括：给予所述患者一定量的能激活对所述的GAGE衍生的肿瘤排斥抗原与HLA-Cw6分子的复合体的免疫应答的制剂，所述的一定量为足以激活对呈递所述复合体的细胞的所述应答的量。

24、用于治疗以表达由包含SEQ ID NO：1的51-476位核苷酸序列的核酸分子编码的肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病患者的方法，该方法包括：给予所述患者一定量的能激活对HLA分子和肿瘤排斥抗原前体的复合体的免疫应答的制剂，所述的一定量为足以激活对呈递所述复合体的细胞的所述免疫应答的量。

25、用于确定一种疾病的方法，包括将一种不含正常睾丸细胞的样品与一种和编码GAGE的核酸分子杂交的探针核酸分子接触，并确定所述探针与所述核酸分子的杂交，以确定所述疾病。

26、用于诊断以表达由包含SEQ ID NO：1的51-476位核苷酸序列的核酸分子编码的肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的方法，包括将来自患者的样品与对所述序列或其表达产物特异的制剂接触，并确定所述制剂与所述序列或表达产物之间的相互作用，以确定所述疾病。

27、权利要求25的方法，其中所述的疾病是黑素瘤。

28、权利要求26的方法，其中所述的疾病是黑素瘤。

29、权利要求25的方法，其中所述的疾病是乳腺癌。

30、权利要求26的方法，其中所述的疾病是乳腺癌。

31、权利要求25的方法，其中所述的疾病是咽癌或喉癌。

32、权利要求26的方法，其中所述的疾病是咽癌或喉癌。

33、权利要求25的方法，其中所述的疾病是肉瘤。

34、权利要求26的方法，其中所述的疾病是肉瘤。

35、权利要求25的方法，其中所述的疾病是睾丸精细胞瘤。

36、权利要求26的方法，其中所述的疾病是睾丸精细胞瘤。

37、权利要求25的方法，其中所述的疾病是膀胱癌。

38、权利要求26的方法，其中所述的疾病是膀胱癌。

39、权利要求25的方法，其中所述的疾病是直肠癌。

40、权利要求26的方法，其中所述的疾病是直肠癌。

41、选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3组成的一组中的分离的核酸分子。