CN112741856B - 牡丹药材抗前列腺增生有效部位的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牡丹药材抗前列腺增生有效部位的制备方法及其应用，该抗前列腺增生活性部位的方法包括如下步骤：(1)取牡丹药材，依次分别以95%的乙醇、50%的乙醇及水为提取溶剂进行连续逆流超声提取3次，得连续逆流超声提取物；(2)将所获得的提取物与固化5α‑还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠混合并孵育后，弃去上清液，再用解吸附溶剂解析附后，除去磁珠，回收溶剂得抗前列腺增生活性部位。本发明的方法通过连续逆流超声法与磁珠固化酶技术提取出抗前列腺增生的活性部位。该方法可供工业化生产，解决了中药中含有复杂成分却很难将其按作用机制进行提取分离的问题。

Description

牡丹药材抗前列腺增生有效部位的制备方法及其应用
技术领域：
本发明涉及牡丹药材中抗前列腺增生有效部位的制备方法及其在制备防治前列腺增生药物中的应用。
背景技术：
前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是我国中老年男性常见的泌尿外科疾病之一。患者多表现为尿频、尿急、尿失禁、排尿困难、血尿等症状，病情发展至一定程度还可引起膀胱结石或肾功能损害，威胁患者健康安全、影响其生活质量。研究发现30岁以下男性很少有前列腺增生，40岁以后发病率开始上升，50岁以上男性约有50％患有前列腺增生，80岁时约90％的男性都有前列腺增生症。截止2019年底，60岁以上的人口约2.5亿，男性约1.3亿，按50％的发病率计算，超过7000万的男性患有前列腺肥大疾病，巨大的人群承受着尿频、尿急、尿失禁等下尿路疾病的痛苦，严重者可有血尿、尿潴留，并发膀胱结石、尿路感染甚至肾功能不全。
目前，临床上用于前列腺增生的化学治疗药物主要采用：第一类，5α-还原酶抑制剂，如非那雄安、度他雄胺等药物，这类药物能够通过缩小前列腺体积而减少尿储留的发生，但容易引起勃起功能障碍、射精异常、男性乳房女性化、皮疹等副作用；第二类，α-肾上腺能受体阻制剂，研究发现膀胱颈与前列腺基质中有大量的α-肾上腺素能受体，当其受到阻断时，该部位松弛，压力下降，从而使排尿更加通畅。其主要作用机制是通过阻滞在膀胱颈、前列腺包膜、尿道及腺体平滑肌α受体，降低前列腺和尿道平滑肌的张力及前列腺尿道的压力，从而解除因BPH引起的膀胱出口梗阻(BOO)的动力学因素，改善梗阻症状，但可能引起头晕、头痛、乏力、困倦、体位性低血压、异常射精等副作用；第三类，磷酸二酯酶5型抑制剂(PDE5I)，它通过抑制PDE5的水解活性来起到治疗勃起功能障碍的作用。但近来临床研究发现，PDE5I还具有缓解LUTS的作用，机制是抑制Rho激酶活性，从而导致平滑肌收缩，缓解LUTS症状；也可能是缓解盆腔动脉粥样硬化，增加前列腺和膀胱动脉血供，缓解LUTS症状。磷酸二酯酶-5型抑制剂，可缓解膀胱逼尿肌收缩、降低膀胱颈部和前列腺张力，但可能出现头痛、颜面潮红、消化不良、视觉异常、肌无力等副作用。第四类，M受体拮抗剂主要用于缓解以尿频、尿急为主的储尿期症状，它是通过拮抗乙酰胆碱与M受体结合而发挥作用，缓解膀胱过度活动，但可能出现口干、便秘、头痛、视力模糊。前列腺增生的发病机制比较复杂，单一的化学药物很难解决问题，且副作用较大的，而中药的特点是多成分多靶点，可以解决复杂疾病的治疗，因此，从中药中寻找治疗前列腺增生的药物成为必然。
据文献报道，牡丹花粉中含有多种黄酮、植物甾醇、亚麻酸等多种成分，可以发挥多成分多靶点的优势，克服西药单一治疗机制，治疗复杂发病机制的BPH。因此，开发以牡丹花粉为原料的抗前列腺增生药物，可以达到多成分多靶点的综合治疗效果，对于减轻中国老龄化给国家和个人带来的负担具有积极的作用。本发明根据前列腺发病机理及治疗的途径，采用连续逆流超声提取技术与磁珠固化酶技术相结合，从牡丹花粉中提取制备抗前列腺增生的活性部位，从而为抗前列腺增生的临床应用药物提供依据。
发明内容：
本发明解决的技术问题是：牡丹药材中除了含有治疗前列腺增生的植物甾醇、黄酮、脂肪酸等成分外，还含有过敏性成分。针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种提取牡丹药材中抗前列腺增生活性部位的方法。该方法通过连续逆流超声法与磁珠固化酶技术提取出抗前列腺增生的活性部位。
本发明的另一目的在于提供由述方法制备的抗前列腺增生活性部位。
本发明的又一目的在于提供上述的抗前列腺增生活性部位在制备防治前列腺增生药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种从牡丹药材中提取抗前列腺增生活性部位的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取牡丹药材，依次分别以95％的乙醇、50％的乙醇及水为提取溶剂进行连续逆流超声提取3次，得到提取液；将提取液过滤，滤液回收乙醇后，得连续逆流超声提取物；
(2)将所获得的提取物与固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠混合并孵育后，弃去上清液，再将固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠用解吸附溶剂解析附后，除去磁珠，回收溶剂得抗前列腺增生活性部位。
作为一种优选技术方案，所述的牡丹药材为破壁的牡丹花粉、牡丹籽和牡丹皮中的至少一种。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中所述的连续逆流超声提取的条件为：在20-50℃的温度下进行连续逆流超声提取10-120min，超声频率为20-80KHz。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中所述提取溶剂的添加量为牡丹药材重量的3-15倍。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中将所获得的提取物与固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠混合孵育的条件为：在20℃-37℃的恒温箱中孵育10- 50分钟。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中所述的解吸附溶剂为20％-90％乙醇或乙腈；所述解吸附的方法为在超声或磁力搅拌下解吸附5-30分钟。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中所述固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶-5磁珠和固化Rho激酶磁珠的制备过程中，酶的用量与磁珠的质量比为1:10-1:100，孵化的温度为34-37℃，时间为24-30h。
上述的方法制备的抗前列腺增生活性部位。
上述的抗前列腺增生活性部位在制备抗前列腺增生药物中的应用。
一种抗前列腺增生药物，该药物中包含上述的抗前列腺增生活性部位。以所述的活性部位作为药物活性成分制备成各种临床药物制剂，其中含有治疗有效量的牡丹药材活性部位及药学上可接受的载体；还可以是牡丹药材活性部位与其他中药或中药提取物或中药有效部位或化学成分或辅料共同制备的药物组合物，用于预防与治疗前列腺增生。
本发明的有益效果：
本发明的方法通过连续逆流超声法与磁珠固化酶技术提取出抗前列腺增生的活性部位。该方法可供工业化生产，解决了中药中含有复杂成分却很难将其按作用机制进行提取分离的问题。
具体实施方式
通过下面的实施例，可以进一步清楚的了解本发明，但他们不是对本发明的限定。
实施例1：
取牡丹花粉(破壁)30KG，从进料口进料，从溶剂入口加入8倍量95％(v/v)乙醇，进行连续逆流超声提取，超声频率为40KHz，超声温度27℃，连续逆流超声提取20min，抽滤，将残渣加入6倍量50％(v/v)乙醇溶液，进行连续逆流超声提取，超声频率为30KHz，超声温度30℃，连续逆流超声提取20min，抽滤，将残渣加入10倍量水，进行连续逆流超声提取，超声频率为50KHz，超声温度50℃，连续逆流超声提取20min，过滤，将各提取步骤的滤液混合，真空旋蒸回收溶剂，得浸膏为连续逆流超声提取物；
取30kg磁珠，用0.1M PBS缓冲液清洗两次，再加入2L缓冲液，和2L含有5α-还原酶、磷酸二酯酶-5和Rho激酶各600g的生理盐水溶液，混合均匀，加入2L 3M的硫酸铵溶液，在37℃下孵育24小时，孵育后将磁珠放于磁铁上2min后，用缓冲液和tween 20反复清洗磁珠后，重新用2L缓冲液分散磁珠。
取1kg连续逆流超声提物的水溶液2L与2L固定酶磁珠缓冲液混合，在37℃的恒温箱中孵育30min后，移去上清液，磁珠用缓冲液清洗后，用50％(v/v)的乙醇水溶液洗脱，上清液回收溶剂即得所需提取物(有效部位组)。
实施例2：
取牡丹皮30KG粉碎后，从进料口进料，从溶剂入口加入10倍量95％(v/v)乙醇，进行连续逆流超声提取，超声频率为50KHz，超声温度30℃，连续逆流超声提取30min，抽滤，将残渣加入8倍量50％(v/v)乙醇溶液，进行连续逆流超声提取，超声频率为40KHz，超声温度35℃，连续逆流超声提取40min，抽滤，将残渣加入15倍量水，进行连续逆流超声提取，超声频率为60KHz，超声温度50℃，连续逆流超声提取35min，过滤，将各提取步骤的滤液混合，真空旋蒸回收溶剂，得浸膏为连续逆流超声提取物；
取30kg磁珠，用0.1M PBS缓冲液清洗两次，再加入2L缓冲液，和2L含有5α-还原酶、磷酸二酯酶-5和Rho激酶各600g的生理盐水溶液，混合均匀，加入2L 3M的硫酸铵溶液，在37℃下孵育24小时，孵育后将磁珠放于磁铁上2min后，用缓冲液和tween 20反复清洗磁珠后，重新用2L缓冲液分散磁珠。
取1kg连续逆流超声提物的水溶液2L与2L固定酶磁珠缓冲液混合，在37℃的恒温箱中孵育30min后，移去上清液，磁珠用缓冲液清洗后，用50％(v/v)的乙醇水溶液洗脱，上清液回收溶剂即得所需提取物(有效部位组)。
实施例3：
取牡丹花粉(破壁)30KG，从进料口进料，从溶剂入口加入8倍量95％(v/v)乙醇，进行连续逆流超声提取，超声频率为40KHz，超声温度27℃，连续逆流超声提取20min，收集乙醇超声提取溶剂，回收溶剂，得浸膏。
取30kg磁珠，用0.1M PBS缓冲液清洗两次，再加入2L缓冲液，和2L含有5α-还原酶、磷酸二酯酶-5和Rho激酶各600g的生理盐水溶液，混合均匀，加入2L 3M的硫酸铵溶液，在37℃下孵育24小时，孵育后将磁珠放于磁铁上2min后，用缓冲液和tween 20反复清洗磁珠后，重新用2L缓冲液分散磁珠。取1kg连续逆流超声提物的水溶液2L 与2L固定酶磁珠缓冲液混合，在37℃的恒温箱中孵育30min后，移去上清液，磁珠用缓冲液清洗后，用50％(v/v)乙腈-水或乙醇-水洗脱，上清液回收溶剂即得所需提取物 (95％醇提物组)。
实施例4：
取牡丹花粉(破壁)30KG，从进料口进料，从溶剂入口加入6倍量50％(v/v)乙醇，进行连续逆流超声提取，超声频率为40KHz，超声温度27℃，连续逆流超声提取20min，收集乙醇超声提取溶剂，回收溶剂，得浸膏。
取30kg磁珠，用0.1M PBS缓冲液清洗两次，再加入2L缓冲液，和2L含有5α-还原酶、磷酸二酯酶-5和Rho激酶各600g的生理盐水溶液，混合均匀，加入2L 3M的硫酸铵溶液，在37℃下孵育24小时，孵育后将磁珠放于磁铁上2min后，用缓冲液和tween 20反复清洗磁珠后，重新用2L缓冲液分散磁珠。
取1kg连续逆流超声提物的水溶液2L与2L固定酶磁珠缓冲液混合，在37℃的恒温箱中孵育30min后，移去上清液，磁珠用缓冲液清洗后，用50％(v/v)乙腈-水或乙醇-水洗脱，上清液回收溶剂即得所需提取物(50％醇提物组)。
实施例5：
取牡丹花粉(破壁)30KG，从进料口进料，从溶剂入口加入10倍量水，进行连续逆流超声提取，超声频率为50KHz，超声温度50℃，连续逆流超声提取20min，收集乙醇超声提取溶剂，回收溶剂，得浸膏。
取30kg磁珠，用0.1M PBS缓冲液清洗两次，再加入2L缓冲液，和2L含有5α-还原酶、磷酸二酯酶-5和Rho激酶各600g的生理盐水溶液，混合均匀，加入2L 3M的硫酸铵溶液，在37℃下孵育24小时，孵育后将磁珠放于磁铁上2min后，用缓冲液和tween 20反复清洗磁珠后，重新用2L缓冲液分散磁珠。
取1kg连续逆流超声提物的水溶液2L与2L固定酶磁珠缓冲液混合，在37℃的恒温箱中孵育30min后，移去上清液，磁珠用缓冲液清洗后，用50％(v/v)乙腈-水或乙醇-水洗脱，上清液回收溶剂即得所需提取物(水提取物组)。
实施例6牡丹花粉活性部位抗前列腺增生的药效研究
采用随机法将220-250g雄性SD大鼠适应性饲养7天，分成8组，每组8只，分为空白组、模型组、西阳对照组(非难雄安)、牡丹花粉组、95％醇提物组、50％醇提物组、水提取物组、有效部位组(以实施例1为例)。模型组和治疗组大鼠每天皮下注射丙酸睾酮5 mg/kg，连续30天，建立大鼠BPH模型。正常对照组大鼠每日皮下注射等体积无菌生理盐水。造模成功后，空白对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，西阳对照组(非难雄安)、阳性对照组牡丹花粉2.0g/kg，95％醇提物组0.38g/kg(对应于2.0g/kg的每日花粉剂量)，50％醇提物组0.45g/kg(对应于2.0g/kg的每日花粉剂量) ， 水提物组0.27g/kg，有效部位组0.37g/kg，最后一次给药后二十四小时，取大鼠静脉血测定二氢睾酮、睾酮，之后处死并取前列腺和精囊。结果见附表表1和表2，结果显示，有效部位组与模型组相比，可明显降低血清及前列腺中的睾酮含量及二氢睾酮的含量，可明显降低前列腺指数 (PI)、前列腺体积指数(PVI)和精囊指数(SVI)，且有效部位组的各值均为最低，说明有效部位组的治疗效果最优。
Figure BDA0002941208990000061

Claims (5)

1.一种从牡丹药材中提取抗前列腺增生活性部位的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)取牡丹药材，依次分别以95%的乙醇、50%的乙醇及水为提取溶剂进行连续逆流超声提取3次，得到提取液；将提取液过滤，滤液回收乙醇后，得连续逆流超声提取物；
(2)将所获得的提取物与固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠混合并孵育后，弃去上清液，再将固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠用解吸附溶剂解析附后，除去磁珠，回收溶剂得抗前列腺增生活性部位；
将所获得的提取物与固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠混合孵育的条件为：在20℃-37℃的恒温箱中孵育10-50分钟；
所述的解吸附溶剂为20%-90%乙醇或乙腈；
所述的牡丹药材为破壁的牡丹花粉、牡丹籽和牡丹皮中的至少一种；
步骤 (1)中所述提取溶剂的添加量为牡丹药材重量的3-15倍；
步骤(2)中所述解吸附的方法为在超声或磁力搅拌下解吸附5-30分钟；
步骤(2)中所述固化5α-还原酶磁珠、固化磷酸二酯酶5磁珠和固化Rho激酶磁珠的制备过程中，酶的用量与磁珠的质量比为1:10-1:100，孵化的温度为34-37℃，时间为24-30h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤 (1)中所述的连续逆流超声提取的条件为：在20-50℃的温度下进行连续逆流超声提取10-120min，超声频率为20-80KHz。
3.权利要求 1或2所述的方法制备的抗前列腺增生活性部位。
4.权利要求3所述的抗前列腺增生活性部位在制备抗前列腺增生药物中的应用。
5.一种抗前列腺增生药物，其特征在于，该药物中包含权利要求3所述的抗前列腺增生活性部位。
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