CN112739370A - 包含nkx3.2及其片段作为活性成分的治疗视网膜疾病的药物组合物 - Google Patents

包含nkx3.2及其片段作为活性成分的治疗视网膜疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含Nkx3.2及其片段作为活性成分。根据本发明的Nkx3.2和/或其片段抑制由氧化应激引起的视网膜变性并维持视觉功能。此外，Nkx3.2和/或其片段抑制由视网膜色素上皮细胞的氧化应激引起的细胞死亡，并抑制脉络膜新血管形成和视网膜水肿。因此，包含Nkx3.2和/或其片段作为活性成分的组合物可以有效地用于预防或治疗视网膜疾病或黄斑变性。

Description

包含NKX3.2及其片段作为活性成分的治疗视网膜疾病的药物 组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含Nkx3.2及其片段作为活性成分。
背景技术
随着我们的社会进入老龄化社会，对与年龄有关的疾病及其治疗的兴趣正在增加。在各种老年性疾病中，黄斑变性是一种代表性的老年性眼病，它是一种由于位于眼内视网膜中心的黄斑变性导致视力障碍的疾病。
在黄斑变性中，由于机体衰老引起的黄斑功能降低导致视力下降或视力丧失。该疾病是随着年龄的增长视力丧失的主要原因。黄斑变性是一种通常在50多岁和60多岁发生的疾病，在年轻年龄组中可能很少发生。已知该疾病是由机体老化、心血管疾病、吸烟、高水平的血胆固醇、环境污染、暴露于阳光等引起的。
黄斑变性有两种类型：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。干性黄斑变性发生在视网膜中产生与衰老相关的一种称为玻璃疣的沉积物，或发生诸如视网膜色素上皮萎缩的病变的情况下。黄斑变性患者中约有90％患有干性黄斑变性。在干性黄斑变性中，黄斑中的视觉细胞缓慢萎缩，并因此导致视力随着时间逐渐下降。尽管干性黄斑变性不会引起严重的视力丧失，但它可能发展为湿性。对于湿性黄斑变性，脉络膜中异常地形成了新的血管，因此由于这些血管本身或血管的出血、渗出等，很可能导致严重的视觉损伤。湿性黄斑变性可能在发病后数月至数年内因盘样萎缩，严重出血等导致失明(Oh,M.J.&Lee,S.Y.,2012)。
另一方面，在由于黄斑变性而导致视力障碍的情况下，不能恢复到先前的视力。因此，重要的是及早发现和治疗黄斑变性。如果使用阿姆斯勒方格表(一种针对黄斑变性的自我评估测试)，则可以在早期发现黄斑变性。因此，对于黄斑变性，及早发现和治疗可将视力损失减至最小；但是，目前尚无可靠的治疗方法。
发明公开
技术问题
在研究用于黄斑变性的治疗剂时，本发明人发现Nkx3.2和/或其片段对预防或治疗视网膜营养不良具有优异的效果，例如抑制由氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡和视网膜变性，维持视觉功能，并抑制脉络膜新血管形成和视网膜水肿。基于该发现，本发明人完成了本发明。
本发明的目的是提供用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含Nkx3.2和/或其片段作为活性成分。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含Nkx3.2或其片段作为活性成分。
此外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其中Nkx3.2片段是由式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)
在式(I)中，所述核心结构域是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失1至42个氨基酸；和
所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失1至23个氨基酸。
此外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜营养不良的方法，包括将多肽施用于个体的步骤，其中所述多肽是Nkx3.2和/或其片段。
发明的效果
根据本发明的Nkx3.2和/或其片段抑制由氧化应激引起的视网膜变性并维持视觉功能。另外，Nkx3.2和/或其片段抑制由氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡，并抑制脉络膜新血管形成和视网膜水肿。因此，包含Nkx3.2和/或其片段作为活性成分的组合物可以有效地用于视网膜营养不良的预防或治疗。
附图的简要说明
图1显示了通过免疫组织化学染色检测到的Nkx3.2蛋白在C57BL/6小鼠的视网膜色素上皮细胞中的表达。此处，OS是氧化应激(oxidative stress)的缩写。
图2显示了通过免疫组织化学染色检测到的Nkx3.2蛋白在人视网膜色素上皮细胞中的表达。
图3显示了通过免疫印迹分析检测到的Nkx3.2蛋白在人视网膜色素上皮细胞中的表达。此处，WB abs是免疫印迹抗体(Western blot antibody)的缩写。
图4示显示了视网膜变性小鼠模型中的视网膜色素上皮病变，所述损伤是由氧化应激引起的。
图5显示了通过免疫组织化学染色检测到的Nkx3.2蛋白在视网膜变性小鼠模型中的表达。
图6显示了通过免疫印迹分析检测到的Nkx3.2蛋白在视网膜变性小鼠模型中的表达。
图7显示了产生Nkx3.2在视网膜色素上皮细胞中特异性过表达小鼠的方法的示意图。图7中所示的缩写具有以下含义：ci-Nkx3.2＝Cre诱导的Nkx3.2；ciTg-Nkx3.2＝Cre诱导的Nkx3.2转基因；和tpA＝转录终止。
图8显示了Nkx3.2蛋白在小鼠的视网膜色素上皮中的表达，其中通过免疫组织化学染色检测到Nkx3.2在视网膜色素上皮细胞中特异性过表达。
图9显示了通过视网膜铺片(flat mount)观察到的取决于Nkx3.2蛋白表达水平的视网膜变性的程度。
图10显示了通过眼底图像(fundus image)观察到的取决于Nkx3.2蛋白表达水平的视网膜变性的程度。
图11显示了通过光学相干断层成像(optical coherence tomography，OCT)观察到的取决于Nkx3.2蛋白表达水平的视网膜变性的程度。
图12显示了通过组织病理学分析观察到的取决于Nkx3.2蛋白表达水平的视网膜变性的程度。
图13显示了通过视网膜电图(electroretinography，ERG)观察到的取决于Nkx3.2蛋白表达水平的视觉功能维持效果。
图14显示了在人视网膜色素上皮细胞中取决于诱导氧化应激的H202浓度的细胞活性。
图15显示了在人视网膜色素上皮细胞中取决于诱导氧化应激的H202浓度的细胞死亡率。
图16显示了在人视网膜色素上皮细胞中Nkx3.2蛋白的表达水平和裂解的PARP蛋白(细胞死亡的标志物)的表达水平，取决于诱导氧化应激的H2O2的浓度，并且通过免疫印迹分析对其进行检测。
图17显示了在人视网膜色素上皮细胞中用表达Nkx3.2的病毒(Lenti-Nkx3.2)处理后由氧化应激引起的细胞死亡的程度。
图18显示了在人视网膜色素上皮细胞中用抑制Nkx3.2表达的病毒(sh-Nkx3.2)处理后由氧化应激引起的细胞死亡的程度。
图19显示了使用酶标仪设备观察到的全长Nkx3.2及其片段抑制由氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力。
图20a显示了使用免疫化学技术观察到的全长Nkx3.2及其片段的转染效率。
图20b和20c显示了通过计算转染的Nkx3.2蛋白的数目/DAPI染色的核的数目以获得平均值，然后通过表格(图20b)和图(图20c)表示平均值而获得的结果。
图21a显示了通过用激光照射Nkx3.2过表达的小鼠以诱导脉络膜新血管形成，然后通过眼底血管造影术拍摄视网膜血管而获得的图像。
图21b显示了基于眼底血管造影术拍摄的图像，通过比较野生型小鼠和Nkx3.2过表达的小鼠之间脉络膜新血管病变大小的差异而获得的结果。
图22a显示了通过用激光照射Nkx3.2过表达的小鼠以诱导脉络膜新血管形成，然后通过光学相干层析成像拍摄视网膜区域而获得的图像。
图22b显示了基于光学相干层析成像拍摄的图像，通过比较野生型小鼠和Nkx3.2过表达的小鼠之间视网膜水肿的差异而获得的结果。
实施发明的最佳方式
在下文中，将详细描述本发明。
在本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含作为活性成分的Nkx3.2或其片段。
如本文所用，术语“Nkx3.2”也称为NK3同源盒2，并且是属于NK-2同源盒家族的蛋白质之一。Nkx3.2在骨骼发育和器官分化中起重要作用。特别是，已知Nkx3.2可促进软骨分化，延缓软骨细胞肥大并抑制软骨细胞死亡。Nkx3.2可能是人类衍生的蛋白质。在此，Nkx3.2蛋白可以具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：8的核苷酸序列编码。
如本文所用，Nkx3.2蛋白可包括显示出与SEQ ID NO：7的氨基酸序列基本同一性的氨基酸序列。Nkx3.2蛋白具有上述的基本同一性是指显示出80％、90％、95％、98％或99％的同源性的氨基酸序列。
另外，对于用于本发明的Nkx3.2蛋白，具有其野生型氨基酸序列及其氨基酸序列变体的蛋白也可以包括在本发明的范围内。此处，Nkx3.2蛋白的变体是指具有由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合而与Nkx3.2蛋白的野生型氨基酸序列不同的序列的蛋白。蛋白质和肽中不完全改变分子活性的的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，蛋白质，纽约学术出版社，1979)。最常见的交换是氨基酸残基Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly之间的交换。此外，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)等来修饰Nkx3.2蛋白。
Nkx3.2蛋白或其变体可以从天然来源提取或可以通过合成制备(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-2156，1963)或通过基于DNA序列的重组方法(Sambrook，J.等人，2001分子克隆实验室手册，第3版，冷泉港出版社)。
如本文所用，术语“Nkx3.2片段”可以是由式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)
在式(I)中，所述核心结构域是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；此外，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失1至42个氨基酸。此外，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失1至23个氨基酸。
如本文所用，术语“核心结构域”是指具有从全长Nkx3.2蛋白的166位至309位的氨基酸序列的多肽。所述全长Nkx3.2蛋白可以具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。所述核心结构域可以具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码。
如本文所用，术语“N末端延伸结构域”是指与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，所述结构域是具有从全长Nkx3.2蛋白的123位至165位的氨基酸序列的多肽。所述N末端延伸结构域可以具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：4的核苷酸序列编码。
所述N末端延伸结构域可以是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，或从多肽的第1位氨基酸开始，从N末端向C末端方向删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个氨基酸残基的相同多肽。
如本文所用，术语“C末端延伸结构域”是指与上述核心结构域的C-末端结合的结构域，所述结构域是具有从全长Nkx3.2蛋白的310位至333位的氨基酸序列的多肽。所述C末端延伸结构域可以具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：6的核苷酸序列编码。
所述C末端延伸结构域可以是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或从多肽的第24位氨基酸开始，从C末端向N末端方向删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基的相同多肽。
氨基酸残基的缺失可以在N末端延伸结构域和C末端延伸结构域的一个或两个结构域中发生。具体地，本发明中的多肽可具有SEQ ID NO：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
所述多肽是Nkx3.2蛋白的片段，不存在于体内。但是，所述多肽不易在体内降解，而具有与野生型Nkx3.2蛋白相同的活性。因此，与野生型Nkx3.2蛋白相比，所述多肽在体内存在时间更长，从而表现出优异的活性。
在一个实施方式中，本发明提供了具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽或其片段。所述片段可以是具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：20的第1位氨基酸开始连续缺失1至87个氨基酸。此外,所述片段可以是具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：20的第209位氨基酸开始连续缺失1至39个氨基酸。
氨基酸的缺失可以在SEQ ID NO：20的氨基酸序列的N-末端和C-末端中的一处或两处发生。
在本发明的一个实施方式中，为了评估全长Nkx3.2及其片段抑制由氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力，将针对每一个全长Nkx3.2及其片段的DNA质粒转染到视网膜色素上皮细胞系中，并在其中诱导氧化应激。结果，确定全长Nkx3.2及其片段均抑制视网膜色素上皮细胞死亡。
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸作为活性成分。
所述多核苷酸可以是DNA或RNA，其中RNA可以是mRNA。此外，可以将所述多核苷酸装载到非病毒载体中。非病毒载体可以是选自下组的任何一种：质粒、脂质体、阳离子聚合物、胶束、乳剂、固体脂质纳米颗粒或其组合。
此外，在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含重组病毒作为活性成分，所述重组病毒包含编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸。
所述Nkx3.2片段可以是由式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)
在式(I)中，所述核心结构域是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；此外，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失1至42个氨基酸。此外，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失1至23个氨基酸。此处，所述核心结构域、N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域如上所述，并且所述多核苷酸可以是编码SEQ ID No：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的核苷酸序列。
所述病毒可以是选自下组的任何一种：腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒。具体地，所述病毒可以是腺相关病毒(AAV)。所述腺相关病毒不限于特定的血清型，并且可以优选地是AAV1至AAV9中的任何一种。
腺相关病毒(AAV)适合作为本发明的基因递送系统，因为它能够感染未分裂的细胞并且具有感染各种类型的细胞的能力。关于AAV载体的构建和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中具体公开。
通常，可以通过共转染包含侧翼为两个AAV末端重复序列的目的基因序列的质粒和包含不具有末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒来生产AAV病毒。
如本文所用，术语“视网膜营养不良”是指由于诸如衰老和疾病之类的原因已经发生在视网膜上的损害所引起的疾病。所述视网膜营养不良可以是选自下组的任何一种：黄斑变性、糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成和视网膜水肿。
所述黄斑变性是一种疾病，其中黄斑功能随着衰老的进程而降低，从而导致视力降低或丧失。在由于该疾病而视力开始下降的情况下，无法恢复到原始视力。该疾病被称为与年龄有关的黄斑变性，并且是老年性视力丧失的主要原因。黄斑变性分为两种类型：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。大约90％的黄斑变性患者患有干性黄斑变性，这种干性黄斑变性发生在年龄相关的沉积物积聚在视网膜下或出现诸如视网膜色素上皮萎缩的病变的情况下。随着黄斑中的视觉细胞被缓慢破坏，黄斑功能降低，中心视力随时间而降低。对于湿性黄斑变性，由于构成黄斑底层的脉络膜中许多新的血管的异常形成而产生了症状。湿性黄斑变性的进展快于干性黄斑变性，这可能导致视力急剧下降并在2个月至3年内导致失明。
糖尿病性视网膜病是由于糖尿病引起的外周循环障碍而在眼睛的视网膜中发生的并发症。该疾病最初可能没有症状，并且可能会随着侵袭进入黄斑而出现视力下降的症状。根据进展阶段，糖尿病性视网膜病可分为单纯性视网膜病，增生前视网膜病和增生性视网膜病。
脉络膜新血管形成是由于异常血管的形成而使脉络膜受损从而导致视力障碍的疾病。脉络膜新血管形成是全世界不可逆视力丧失的主要原因之一。对于脉络膜新血管形成，尽管进行了各种治疗尝试，但大多数患者的视力预后较差。
视网膜水肿意指视网膜肿胀。由于各种原因在诸如视网膜或黄斑中的毛细血管之类的细血管中发生变性或异常时，可能会发生出血，从而导致视网膜水肿。在视网膜中发生水肿的情况下，可能会出现各种症状，包括视力下降。
在包含Nkx3.2或其片段的药物组合物中，根据本发明的Nkx3.2或其片段的多肽的含量相对于药物组合物的总重量可以为10％至95％重量。另外，除活性成分外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种表现出相同或相似功能的活性成分。除上述活性成分外，根据本发明的药物组合物还可以包含一种或多种用于给药的药学上可接受的载体。
此外，包含含有编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸的重组病毒作为活性成分的药物组合物的剂量可以根据多种因素而变化，包括疾病的类型，疾病的严重性，药物组合物中所含活性成分和其他成分的类型和量，剂型以及患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、治疗时间和同时使用的药物。
本发明的药物组合物中所含的重组病毒可以在成人基础上以每天1.0×105至1.0×1015病毒基因组的量给药，以使药物组合物表现出理想的效果。具体地，以一定剂量的本发明药物组合物，所述病毒可以在成人基础上每天以1.0×105至1.0×1015、1.0×107至1.0×1013、1.0×108至1.0×1012或1.0×109至1.0×1010的量给药。
此外，本发明提供了一种预防或治疗视网膜营养不良的方法，该方法包括以下步骤：对个体施用药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的Nkx3.2或其片段；或含有编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸的重组病毒。
根据本发明的Nkx3.2多肽或其片段；或含有编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸的重组病毒的剂量可以根据各种因素而变化，包括疾病类型，疾病严重程度，药物组合物中所含活性成分和其他成分的类型和量，剂型以及患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、治疗时间和同时使用的药物。
在根据本发明的用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物中，其包含Nkx3.2或其片段作为活性成分，可以包含0.0001至100mg/kg的有效量的Nkx3.2或其片段的多肽，使药物组合物表现出理想的效果。在此，一天可进行一次或多次给药。
此外，在本发明的用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物中，包含含有编码Nkx3.2的多核苷酸或其片段的重组病毒作为有效成分，所述重组病毒可以在成人基础上以每天1.0×105至1.0×1015病毒基因组的量给药，从而使药物组合物表现出理想的效果。具体地，在本发明的药物组合物中，所述病毒可以在成人基础上每天以1.0×105至1.0×1015、1.0×107至1.0×1013、1.0×108至1.0×1012、或1.0×109至1.0×1010的量给药。
此外，本发明的药物组合物可以通过本领域已知的各种方法给予需要其的个体。所述个体可以是哺乳动物，特别是人类。给药途径可通过本领域技术人员在考虑给药方法，身体流体体积，粘度等进行适当选择。具体地，可以通过选自下组的任一种途径给药：静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、透皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内和皮内途径。
在本发明的又一方面，提供了一种制备具有增加的体内稳定性的Nkx3.2片段的方法，其包括从具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽中删除选自下组的任一区域的步骤：N末端区、C末端区、或其组合。
N末端区的缺失可以通过从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：7的第1位氨基酸开始连续删除1至199个氨基酸。在一个实施方式中，N末端区的缺失可以通过从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：7的第1位氨基酸开始连续删除例如41、98、111或122个氨基酸。通过从具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽删除N末端区获得的Nkx3.2片段可以具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸序列。具体地，所述缺失可以通过从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：7的第100位氨基酸开始连续删除1至99个氨基酸。
C末端区的缺失可以通过从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：7的第333位氨基酸开始连续删除1至52个氨基酸。在一个实施方式中，C末端区的缺失可以通过从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：7的第333位氨基酸开始连续删除例如13或26个氨基酸。通过从具有SEQID NO：7的氨基酸序列的多肽删除C末端区获得的Nkx3.2片段可以具有SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列。具体地，所述缺失可以通过从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：7的第320位氨基酸开始连续删除1至39个氨基酸。
氨基酸的缺失可发生在N末端区和C末端区中的一处或两处。在一个实施方式中，氨基酸的缺失可以通过从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：7的第1位氨基酸开始连续删除98至164个氨基酸，特别是98、104、109、111、122、129、149、152、155、158、161或164个氨基酸，同时，从C末端方向到N末端方向从SEQ ID NO：7的第333位氨基酸开始连续缺失3至23个氨基酸，特别是3、6、9、13、15、17、19、21或23个氨基酸。
通过删除N末端区和C末端区中的氨基酸而获得的Nkx3.2片段可以具有SEQ IDNO：15至28的任何一个氨基酸序列。N末端区和C末端区中的氨基酸残基的缺失可以由本领域技术人员使用适当的方法进行。
发明的实施方式
在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明不限于此。
制备实施例1.实验眼组织的制备
购买C57BL/6小鼠，并在特定的无菌条件下保存在已批准的动物设施中。根据预定的实验方案，切除正常的C57BL/6小鼠的眼睛，并从中分离组织。
此外，购买了人眼组织并在特定的无菌条件下保存在已批准的设施中。
实验实施例1.Nkx3.2在视网膜色素上皮细胞中的表达鉴定
由于从未报道过Nkx3.2蛋白在眼视网膜色素上皮中的表达，因此使用免疫组织化学(IHC)染色和蛋白质印迹分析对其进行了验证。
在制备实施例1中制备的C57BL/6小鼠眼组织和人眼组织中，使用免疫组织化学染色鉴定了Nkx3.2蛋白的表达。结果在图1和2中显示。
此外，从制备实施例1中制备的人眼组织中分离出角膜和视网膜色素上皮(RPE)，并从中提取蛋白质。通过蛋白质印迹分析鉴定了Nkx3.2蛋白的表达。结果在图3中显示。
如图1和图2所示，在C57BL/6小鼠和人眼组织中鉴定出Nkx3.2蛋白与RPE65蛋白(在视网膜色素上皮细胞中特异性表达)的表达。此外，如图3所示，可以确定在RPE65高表达的眼睛的后(H)部分中，Nkx3.2蛋白的表达高于在眼睛的额(F)部分中的表达。
实验实施例2.Nkx3.2在氧化应激诱导的视网膜变性模型中的表达鉴定
免疫组织化学(IHC)染色和免疫印迹分析用于鉴定在氧化应激诱导的视网膜变性模型中Nkx3.2蛋白的表达。
通过使用碘酸钠(NaIO3)在制备实施例1中制备的C57BL/6小鼠的眼中通过诱导氧化应激来构建视网膜变性小鼠模型。然后，使用显微镜观察视网膜变性小鼠模型中的病变。此外，使用免疫组织化学染色鉴定了Nkx3.2蛋白在视网膜变性小鼠模型中的表达。结果在图4和5中显示。
此外，从视网膜变性小鼠模型的组织中提取蛋白质，并进行蛋白质印迹分析，以鉴定Nkx3.2蛋白的表达。结果在图6中显示。
如图4所示，在通过使用NaIO3诱导氧化应激而构建的视网膜变性小鼠模型中鉴定出视网膜色素上皮病变。此外，如图5所示，鉴定出在视网膜色素变性上皮病变的视网膜变性小鼠模型中，Nkx3.2蛋白降低。
此外，如图6所示，在由氧化应激诱导的视网膜变性模型中，Nkx3.2蛋白的表达显著降低，该降低是作为视网膜色素上皮标记的RPE65降低之前的初始变化。
实验实施例3.视网膜色素上皮细胞中过表达Nkx3.2的小鼠的产生
在以前的论文中，本研究小组报告了Cre依赖性Nkx3.2过表达的小鼠(Jeong，Da-Un，Ch Je-Yong Choi和Dae-Won Kim,“特定于软骨和Cre的Nkx3.2体内过表达会延迟软骨肥大从而导致骨骼侏儒症(Cartilage-Specific and Cre-DependentNkx3.2Overexpression In Vivo Causes Skeletal Dwarfism by Delaying CartilageHypertrophy)”细胞生理学杂志232.1(2017)：78-90)。基于此，对在视网膜色素上皮细胞中特异性表达Cre的BEST1-Cre小鼠进行了工程改造，使得Cre基因重组酶使Nkx3.2的过表达仅在视网膜色素上皮细胞中发生。在图7中示意性地显示了相应小鼠的生产策略。
此外，通过免疫组织化学染色鉴定了在产生的过表达Nkx3.2的小鼠的视网膜色素上皮细胞中Nkx3.2的表达，结果在图8中显示。
如图8所示，对于通过Cre基因重组酶产生的Nkx3.2过表达仅在视网膜色素上皮细胞中发生的小鼠，验证了Nkx3.2蛋白在视网膜色素上皮细胞中的过表达。
实验实施例4.Nkx3.2过表达引起的视网膜色素上皮细胞抑制作用的鉴定
对于在实验实施例3中产生的Nkx3.2在视网膜色素上皮细胞中特异性过表达的小鼠，通过使用NaIO3产生的氧化应激诱导视网膜变性。
实验实施例4.1.视网膜铺片
对于氧化应激引起视网膜变性的小鼠，将半球形视网膜铺片以鉴定视网膜变性病变。结果在图9中显示。
如图9所示，在不过度表达Nkx3.2的蛋白(ci-Nkx3.2)小鼠中，清楚地观察到了由氧化应激引起的视网膜变性。另一方面，在过表达Nkx3.2的(ciTg-Nkx3.2)小鼠中，未观察到由氧化应激引起的视网膜变性。
实验实施例4.2.眼底图像
通过眼底图像分析了小鼠的眼部视网膜结构，其中氧化应激引起视网膜变性。结果在图10中显示。
如图10所示，正常对照组(Norm)在视神经周围表现出均匀的视网膜弯曲形态，并表现出正常的视网膜反射。另一方面，Nkx3.2非过度表达小鼠(AMD)的视网膜变性组显示视网膜色素上皮裂开并表现出低反射模式。相反，过表达Nkx3.2的小鼠的视网膜变性组(AMD+Nkx3.2)表现出与正常对照组相似的视网膜结构。
实验实施例4.3.光学相干断层扫描
使用光学相干断层扫描技术分析了氧化应激引起视网膜变性的小鼠的视网膜结构。结果在图11中显示。
如图11所示，正常对照组(Norm)良好地表现出视网膜的多层结构，而Nkx3.2-非过表达小鼠(AMD)的视网膜变性组具有严重的视网膜变性并且表现出严重受损的视网膜多层结构。相反，过表达Nkx3.2的小鼠的视网膜变性组(AMD+Nkx3.2)表现出与正常对照组相似的视网膜结构。
实验实施例4.4.组织病理学分析
组织学分析了通过氧化应激诱导视网膜变性的小鼠的眼视网膜结构。结果在图12中显示。
如图12所示，正常对照组(Norm)的视网膜表现出正常结构，并且视网膜色素上皮表现出正常的膜结构。另一方面，Nkx3.2非过表达小鼠(AMD)的视网膜变性组表现出严重受损和丢失的视网膜色素上皮。相反，过表达Nkx3.2的小鼠的视网膜变性组(AMD+Nkx3.2)表现出与正常对照组相似的视网膜结构和视网膜色素上皮模式。
实验实施例5.过表达Nkx3.2引起的视觉功能维持作用的鉴定
通过视网膜电图(ERG)鉴定了由Nkx3.2的过表达引起的视觉功能维持作用。
对于实验实施例4中的由氧化应激诱导的视网膜变性并且在视网膜色素上皮细胞中特异性地过表达Nkx3.2的小鼠，通过ERG分析了它们的视觉功能。结果在图13中显示。
如图13所示，正常对照组(Normal)响应施加到视网膜的外部光刺激而表现出正常的视网膜电势变化。另一方面，Nkx3.2非过表达小鼠(AMD)的视网膜变性组具有完全消失的响应外部光刺激而发生的视网膜电位变化。相反，过表达Nkx3.2小鼠的视网膜变性组(AMD+Nkx3.2)表现出与正常对照组相似的视网膜电位变化。
实验实施例6.根据诱导氧化应激的H2O2浓度，鉴定细胞活力、细胞死亡率和Nkx3.2蛋白的表达
将人视网膜色素上皮细胞分别用400μM、600μM、800μM和1mM过氧化氢(H2O2)处理，以诱导氧化应激。之后，使用水溶性四唑盐测定法(WST)测量了细胞活力，这取决于诱导氧化应激的H2O2浓度。结果在图14中显示。
此外，使用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡试剂盒(西格玛奥德里奇)测量了人视网膜色素上皮细胞的细胞死亡率，其通过用上述各H202浓度处理诱导了氧化应激。此外，通过Western印迹分析测量了Nkx3.2蛋白表达水平的变化，这取决于增加的细胞死亡率。结果在图15和16中显示。
如图14所示，随着H2O2浓度的增加，细胞活力降低。此外，如图15所示，随着H2O2浓度的增加，细胞死亡率升高。如图16所示，裂解的PARP蛋白的表达是细胞凋亡的标记物，其随着H2O2浓度的增加而增加。即，在蛋白质水平上已验证了作为凋亡标志物的裂解的PARP蛋白的表达增加导致细胞死亡。此外，已经确定Nkx3.2蛋白的表达随着裂解的PARP蛋白的表达增加而降低。
实验实施例7.施用表达Nkx3.2蛋白的病毒后细胞死亡率的测量
用800μM的H2O2处理人视网膜色素上皮细胞，以诱导氧化应激。氧化应激诱导的细胞被分为两组。一组施用表达Nkx3.2的病毒(Lenti-Nkx3.2)，另一组施用具有抑制Nkx3.2表达的病毒(sh-Nkx3.2)。然后，使用膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒，根据每种病毒的施用，测量了人视网膜色素上皮细胞中由氧化应激引起的细胞死亡率。结果在图17和18中显示。
如图17所示，与施用对照病毒(Lenti-Ctrl)组相比，在向人视网膜色素上皮细胞施用表达Nkx3.2的病毒(Lenti-Nkx3.2)的情况下，由H2O2引起的细胞死亡率降低。此外，如图18所示，与施用对照病毒(sh-Ctrl)组相比，在向人视网膜色素上皮细胞施用抑制Nkx3.2表达的病毒(sh-Nkx3.2)的情况下，由H2O2引起的细胞死亡率升高。
实验实施例8.Nkx3.2蛋白及其片段抑制氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力评估
实验实施例8.1.评估全长Nkx3.2蛋白及其片段抑制氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力。
为了评估全长Nkx3.2及其片段是否具有抑制由H2O2(氧化应激)引起的视网膜色素上皮细胞死亡的功能，将ARPE19细胞接种在12孔板中(3E+4细胞/孔)，然后用0.6μg编码以下各项的DNA质粒进行转染：全长hNkx3.2(SEQ ID NO：7)，以及分别具有SEQ ID NO：9(全长hNkx3.2序列的1-320氨基酸)，SEQ ID NO：10(全长hNkx3.2序列的1-307氨基酸)，SEQ IDNO：12(全长hNkx3.2序列的99-333氨基酸)，SEQ ID NO：13(全长hNkx3.2序列的112-333氨基酸)，SEQ ID NO：20(全长hNkx3.2序列的112-320氨基酸)，SEQ ID NO：21(全长hNkx3.2序列的123-320氨基酸)，SEQ ID NO：23(全长hNkx3.2序列的150-320氨基酸)，以及SEQ IDNO：28(全长hNkx3.2序列的165-310氨基酸)的hNkx3.2的片段。
转染后36小时，与0.3mM H2O2的反应在CO2培养箱中于37℃进行15小时。向每个孔中加入50μl水溶性四唑盐，然后使反应在CO2培养箱中于37℃进行90分钟。从每个孔中取出150ul上清液，并转移到96孔板中。使用微孔板读取器设备在450nm的波长处测量吸光度。结果在图19中显示。
如图19所示，与对照组相比，包括全长Nkx3.2的Nkx3.2片段，抑制了由H2O2引起的ARPE19细胞死亡，从最低8％到最高17％。
实验实施例8.2.全长Nkx3.2及其片段的转染效率评估
考虑到转染的特性，由于没有表现出100％的效率，因此在上述实验实施例中进行的细胞生存力分析中，全长Nkx3.2及其片段抑制H2O2引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力有可能被低估了。在这一方面，使用免疫细胞化学技术评估了全长Nkx3.2及其片段的转染效率。首先，将AREP19细胞接种到含有载玻片的12孔板中，该载玻片具有2E+4个细胞/孔。用0.6μg编码每个全长hNkx3.2或其片段的DNA质粒进行转染。48小时后，向每个孔中加入2％的多聚甲醛，并使反应在室温下进行15分钟，从而固定细胞。此后，将0.1％柠檬酸钠中的0.1％Triton X-100溶液加入每个孔中，并使反应在室温下进行30分钟，从而将细胞制备成抗体容易渗透细胞的状态。然后，用PBS洗涤两次。
向每个孔中加入在5％山羊血清中的0.1％Triton X-100溶液，并使反应在室温下进行30分钟，从而减少了抗体的非特异性染色。然后，用0.05％吐温20的PBS溶液(PBST)洗涤两次。将第一抗体(Nkx3.2-兔)以1：500的比例稀释并添加到其中。使反应在4℃下进行16小时，并用PBST洗涤5次。将第二抗体(FITC-抗兔)以1：300的比例稀释并添加到其中。使反应在室温下进行30分钟，并用PBST洗涤5次。将DAPI以1：500的比例稀释并添加到其中。使反应在室温下进行10分钟，并用PBST洗涤两次。用70％的乙醇擦拭载玻片。然后，用防褪色的封片溶液进行封片，并在暗室中干燥24小时。然后，用立式显微镜拍摄每个样品。每个样品都在其柱截面拍照。计数每个DAPI染色的Nkx3.2蛋白的转染数，并计算平均值。结果在图20a至20c中显示。
图20a显示了使用免疫细胞化学技术观察到的转染的Nkx3.2和DAPI染色的细胞核。如图20b和20c所示，全长Nkx3.2及其片段相对于ARPE19细胞的转染效率在15％至31％之间。
实验实施例8.3.根据它们的转染效率，重新评估全长Nkx3.2及其片段抑制氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞死亡的能力
考虑到全长Nkx3.2及其片段的转染效率，对它们是否可以抑制由H2O2引起的ARPE19细胞死亡进行了重新评估。结果显示在下表1中。
[表1]
Figure BDA0002984695480000161
如表1所示，与对照组相比，Nkx3.2片段以及全长Nkx3.2抑制了H2O2引起的ARPE19细胞死亡，从最低30％至最高75％。
实验实施例9.Nkx3.2过表达引起的脉络膜新生血管抑制作用的鉴定
Nkx3.2在视网膜色素上皮细胞中特异性过表达的小鼠用激光照射以诱导脉络膜新血管形成(CNV)。9天后，给小鼠腹膜内注射造影剂，并在视网膜血管上进行眼底荧光血管造影(FAA)。基于从眼底荧光血管造影获得的图像，测量脉络膜新生血管病变的CTF。在野生型小鼠和过表达Nkx3.2的小鼠之间，根据脉络膜新血管病变的大小差异进行了比较。结果在图21A和21B中显示。
如图21A和21B所示，与野生型小鼠(G1)相比(124942.3±91743.74)，在过表达Nkx3.2的小鼠(G2)中观察到脉络膜新生血管病变的CTF值显著降低(29414.8±43200.47)(P＜0.05)。从这些结果，发现Nkx3.2在抑制脉络膜新血管形成中起重要作用。
实验实施例10.Nkx3.2过表达引起的视网膜水肿抑制作用的鉴定
用激光照射在视网膜色素上皮细胞中过表达Nkx3.2的小鼠，以诱导脉络膜新生血管形成。然后，在第9天，对脉络膜新血管形成诱发的视网膜区域进行光学相干断层扫描。根据从光学相干断层扫描获得的图像，就野生型小鼠和过表达Nkx3.2的小鼠之间脉络膜新生血管病变引起的视网膜水肿模式的差异进行了比较。结果在图22A和22B中显示。
如图22A和22B所示，与野生型小鼠(G1)相比(259.8±13.08微米)，在过表达Nkx3.2的小鼠(G2)中观察到脉络膜新生血管病变的CTF值显著降低(29414.8±43200.47微米)(P＜0.01)。从这些结果发现，与野生型小鼠相比，在过度表达Nkx3.2的小鼠中，由于在诱导脉络膜新血管形成的过程中血液视网膜屏障破坏而继发的视网膜水肿明显减少。
<110> ICM株式会社
<120> 包含NKX3.2及其片段作为活性成分的治疗视网膜疾病的药物组合物
<130> PCB810117ICM
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的166-309氨基酸片段
<400> 1
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
35 40 45
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
50 55 60
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
65 70 75 80
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
85 90 95
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
115 120 125
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
130 135 140
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的编码166-309氨基酸片段的核酸序列
<400> 2
ggtgttggcc ccagaggtgc acacgtgtcc gcgctgtgca gcggggccgg cggcgggggc 60
ggcagcgggc cggcaggcgt cgcggaggag gaggaggagc cggcggcgcc caagccacgc 120
aagaagcgct cgcgggccgc tttctcccac gcgcaggtct tcgagctgga gcgccgcttt 180
aaccaccagc gctacctgtc cgggcccgag cgcgcagacc tggccgcgtc gctgaagctc 240
accgagacgc aggtgaaaat ctggttccag aaccgtcgct acaagacaaa gcgccggcag 300
atggcagccg acctgctggc ctcggcgccc gccgccaaga aggtggccgt aaaggtgctg 360
gtgcgcgacg accagagaca atacctgccc ggcgaagtgc tgcggccacc ctcgcttctg 420
ccactgcagc cc 432
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的123-165氨基酸片段
<400> 3
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
35 40
<210> 4
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的编码123-165氨基酸片段的核酸序列
<400> 4
ttgagcctcg gccagccggt ctgtgagctg gccgcttcca aagacctaga ggaggaagcc 60
gcgggccgga gcgacagcga gatgtccgcc agcgtctcag gcgaccgcag cccaaggacc 120
gaggacgac 129
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的310-333氨基酸片段
<400> 5
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
20
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的编码310-333氨基酸片段的核酸序列
<400> 6
tcctactatt acccgtacta ctgcctccca ggctgggcgc tctccacctg cgcagctgcc 60
gcaggcaccc ag 72
<210> 7
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2
<400> 7
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
325 330
<210> 8
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2
<400> 8
atggctgtgc gcggcgccaa caccttgacg tccttctcca tccaggcgat cctcaacaag 60
aaagaggagc gcggcgggct ggccgcgcca gaggggcgcc cggcgcccgg gggcacagcg 120
gcatcggtgg ccgcggctcc cgctgtctgc tgttggcggc tctttgggga gagggacgcg 180
ggcgcgttgg ggggcgccga ggactctctg ctggcgtctc ctgccggtac cagaacagct 240
gcggggcgga ctgcggagag cccggaaggc tgggactcgg actccgcgct cagcgaggag 300
aacgagagca ggcggcgctg cgcggacgcg cggggggcca gcggggccgg ccttgcgggg 360
ggatccttga gcctcggcca gccggtctgt gagctggccg cttccaaaga cctagaggag 420
gaagccgcgg gccggagcga cagcgagatg tccgccagcg tctcaggcga ccgcagccca 480
aggaccgagg acgacggtgt tggccccaga ggtgcacacg tgtccgcgct gtgcagcggg 540
gccggcggcg ggggcggcag cgggccggca ggcgtcgcgg aggaggagga ggagccggcg 600
gcgcccaagc cacgcaagaa gcgctcgcgg gccgctttct cccacgcgca ggtcttcgag 660
ctggagcgcc gctttaacca ccagcgctac ctgtccgggc ccgagcgcgc agacctggcc 720
gcgtcgctga agctcaccga gacgcaggtg aaaatctggt tccagaaccg tcgctacaag 780
acaaagcgcc ggcagatggc agccgacctg ctggcctcgg cgcccgccgc caagaaggtg 840
gccgtaaagg tgctggtgcg cgacgaccag agacaatacc tgcccggcga agtgctgcgg 900
ccaccctcgc ttctgccact gcagccctcc tactattacc cgtactactg cctcccaggc 960
tgggcgctct ccacctgcgc agctgccgca ggcacccagt ga 1002
<210> 9
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的1-320氨基酸片段
<400> 9
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
<210> 10
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的1-307氨基酸片段
<400> 10
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu
305
<210> 11
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的42-333氨基酸片段
<400> 11
Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu
1 5 10 15
Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu
35 40 45
Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg
50 55 60
Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp
85 90 95
Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser
100 105 110
Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro
115 120 125
Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln
165 170 175
Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly
180 185 190
Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln
195 200 205
Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln
210 215 220
Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala
225 230 235 240
Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu
245 250 255
Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr
260 265 270
Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Gly Thr Gln
290
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的99-333氨基酸片段
<400> 12
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
225 230 235
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的112-333氨基酸片段
<400> 13
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
210 215 220
<210> 14
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的123-333氨基酸片段
<400> 14
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Gly Thr Gln
210
<210> 15
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的99-330氨基酸片段
<400> 15
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
225 230
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的99-327氨基酸片段
<400> 16
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala
225
<210> 17
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的99-320氨基酸片段
<400> 17
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
210 215 220
<210> 18
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的105-327氨基酸片段
<400> 18
Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys
20 25 30
Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala
35 40 45
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
50 55 60
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
100 105 110
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
130 135 140
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
145 150 155 160
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
165 170 175
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
180 185 190
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
195 200 205
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala
210 215 220
<210> 19
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的110-324氨基酸片段
<400> 19
Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp
35 40 45
Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His
50 55 60
Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
65 70 75 80
Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg
85 90 95
Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu
100 105 110
Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala
115 120 125
Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp
130 135 140
Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp
145 150 155 160
Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu
165 170 175
Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser
210 215
<210> 20
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的112-320氨基酸片段
<400> 20
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly
<210> 21
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的123-320氨基酸片段
<400> 21
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
195
<210> 22
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的130-320氨基酸片段
<400> 22
Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg
1 5 10 15
Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg
20 25 30
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
35 40 45
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
50 55 60
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
65 70 75 80
Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe
85 90 95
Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
115 120 125
Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp
145 150 155 160
Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu
165 170 175
Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
180 185 190
<210> 23
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的150-320氨基酸片段
<400> 23
Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
1 5 10 15
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
35 40 45
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
50 55 60
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
100 105 110
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
130 135 140
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
165 170
<210> 24
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的153-318氨基酸片段
<400> 24
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
50 55 60
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
85 90 95
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
100 105 110
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
115 120 125
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
130 135 140
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu
165
<210> 25
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的156-316氨基酸片段
<400> 25
Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe
50 55 60
Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu
65 70 75 80
Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys
85 90 95
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala
100 105 110
Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys
115 120 125
Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu
130 135 140
Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr
145 150 155 160
Tyr
<210> 26
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的159-314氨基酸片段
<400> 26
Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala
20 25 30
Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys
35 40 45
Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu
50 55 60
Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp
65 70 75 80
Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe
85 90 95
Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu
100 105 110
Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val
115 120 125
Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro
130 135 140
Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
145 150 155
<210> 27
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的162-312多肽片段
<400> 27
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
1 5 10 15
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
35 40 45
Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe
50 55 60
Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
85 90 95
Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp
115 120 125
Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
145 150
<210> 28
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nkx3.2的165-310多肽片段
<400> 28
Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala
35 40 45
Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln
50 55 60
Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys
65 70 75 80
Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys
85 90 95
Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln
115 120 125
Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Ser
145

Claims (28)

1.一种用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含活性成分：Nkx3.2或其片段。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述Nkx3.2片段是如式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中在式(I)中，所述核心结构域是具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽；
所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失1至42个氨基酸；和
所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失1至23个氨基酸。
4.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失7个氨基酸。
5.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失27个氨基酸。
6.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失30个氨基酸。
7.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失33个氨基酸。
8.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失36个氨基酸。
9.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失39个氨基酸。
10.如权利要求2所述的药物组合物，所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失42个氨基酸。
11.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失13个氨基酸。
12.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失15个氨基酸。
13.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失17个氨基酸。
14.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失19个氨基酸。
15.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失21个氨基酸。
16.如权利要求2所述的药物组合物，所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失23个氨基酸。
17.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述多肽可具有SEQ ID NO：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
18.如权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述视网膜营养不良是选自下组的任意一种：黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成和视网膜水肿。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其中，所述黄斑变性是干性黄斑变性或湿性黄斑变性。
20.一种用于预防或治疗视网膜营养不良的药物组合物，其包含重组病毒作为活性成分，所述重组病毒包含编码Nkx3.2或其片段的多核苷酸。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中，所述Nkx3.2片段是如式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中在式(I)中，所述核心结构域是具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽；
所述N末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中可从N末端至C末端方向从SEQ ID NO：3的第1位氨基酸开始连续缺失1至42个氨基酸；和
所述C末端延伸结构域是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中可从C末端至N末端方向从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始连续缺失1至23个氨基酸。
23.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述多核苷酸是编码SEQ ID NO：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的核苷酸序列。
24.如权利要求20所述的药物组合物，其中，所述病毒是选自下组的任何一种：腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒。
25.如权利要求20至24中任一项所述的药物组合物，其中所述视网膜营养不良是选自下组的任意一种：黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成和视网膜水肿。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中，所述黄斑变性是干性黄斑变性或湿性黄斑变性。
27.一种预防或治疗视网膜营养不良的方法，包括：对个体施用权利要求1或20的药物组合物的步骤。
28.如权利要求27所述的方法，其中通过选自下组的任一种途径进行给药：静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、透皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内和皮内途径。
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GR01 Patent grant
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