KR102547389B1 - Ccn5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Ccn5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CCN5는 TGF-β, EEF 또는 anti-VEGF 약물에 의한 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형을 예방한다. 또한, 상기 CCN5는 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형에 의한 형태학적 또는 기능적인 손상을 정상세포의 수준으로 회복시킨다. 따라서, 상기 CCN5를 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING RETINAL DISEASES COMPRISING CCN5 AS EFFECTIVE INGREDIENT}
본 발명은 CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
망막은 안구 벽의 가장 안쪽에 위치하여 안구 속 유리체(vitreous body)와 접하고 있는 투명하고 얇은 막이다. 망막은 사물의 광학적 정보를 전기적 신호로 변환하여 시각신경(optic nerve)을 통해 뇌의 중추 시각영역으로 영상을 전달하는 일차 시각정보기관의 역할을 한다. 망막은 1억 개가 넘는 광수용체세포, 1백만 개가 넘는 시각신경세포인 신경절세포, 그리고 이들을 연결하는 전선 역할을 하는 수많은 신경세포로 이루어져 있는 정교한 조직이다. 색깔과 사물을 구별하고 시력을 나타내는 망막의 중심부분인 황반부(macular lutea)는 원뿔세포로 구성된 광수용체세포층과 신경절세포층으로 이루어져 있다. 황반부에서는 영상의 전기적 신호가 화학적 신호로 전환되어 신경절세포의 축삭인 시각신경을 타고 뇌로 전달된다. 황반부 이외의 망막은 주변부를 알아보고 어두울 때 주 역할을 담당한다.
노화 또는 외부적인 요인으로 인해 망막에 이상이 발생하게 되면, 시력과 시야에 문제가 생기며, 심한 경우에는 실명에 이르게 된다. 망막 질환은 신경망막이 망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포층으로부터 떨어지면서 망막이 안구 후면으로 분리되어 시력 장애를 유발하는 망막 박리(retinal detachment), 망막 주변 조직에 이상을 일으키는 주변부 망막 변성, 및 황반부에 이상이 생기는 황반변성(macular degeneration)이 있다. 망막이 색소상피층과 분리되면 영상에 대한 광학적 정보를 전달받을 수 없다. 또한, 맥락막으로부터의 영양 공급이 이루어지지 못하므로 신경세포가 기능을 못하게 된다. 이러한 상태가 지속되면 영구적인 망막 위축이 발생하여 실명에 이르게 된다(Yoo, 2015).
망막색소상피는 신경망막과 맥락막 사이에 위치하고 있으며 입방형의 분극화된 단일막으로 망막의 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 정상적인 망막색소상피는 형태학적 그리고 기능적으로 비대칭인 구조를 가진다. 망막색소상피 세포의 변형은 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy, PVR), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy, DR), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration, AMD) 등의 섬유증적 안질환으로 이어질 수 있다. 병리학적 조건에서 망막색소상피 세포는 변형되어 고유의 형태를 가지지 못할 뿐 아니라, 세포외배출 및 식균작용 기능을 상실하게 된다.
한편, 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형으로 인해 시력장애가 시작되면 이전의 시력으로 회복될 수 없기 때문에 조기에 발견하여 치료하는 것이 중요하다. 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형은 조기에 발견하여 치료하면 시력상실을 최소화할 수 있지만, 아직까지 확실한 치료법이 없는 실정이다.
Seung Hoon Yoo, et al., Unilateral Retinitis Pigmentosa: A Case Series and Literature Review. J Korean Ophthalmol Soc 2015; 56(4):559-566.
이에, 본 발명자들은 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형에 따른 질환의 치료제를 연구하던 중, CCN5가 TGF-β(transforming growth factor-β)에 의한 망막색소상피 세포의 형태학적 또는 기능적인 손상을 정상세포 수준으로 회복시켜 망막질환의 예방 또는 치료에 탁월한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCN5 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5 또는 이의 단편; 및 anti-VEGF 약물을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CCN5, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스는 망막색소상피 세포의 TGF-β, EEF (EGTA, EGF, 및 FGF2), 또는 anti-VEGF 약물에 의한 섬유증적 변형을 예방한다. 또한, 상기 CCN5, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스는 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형에 의한 형태학적 또는 기능적인 손상을 정상세포의 수준으로 회복시킬 수 있다. 따라서, 상기 CCN5, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 TGF-β에 의한 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 연구하는 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 1b는 ARPE-19 세포에 TGF-β를 농도별로 처리하였을 때 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 1c는 ARPE-19 세포에 TGF-β를 농도별로 처리하였을 때 변화되는 단백질의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 1d는 TGF-β를 처리한 후 ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 세포의 밀착연접을 관찰한 것이다.
도 2a는 TGF-β에 의해 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 AdCCN5가 억제하는 효과를 확인하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 2b는 AdLacZ 또는 AdCCN5를 처리한 후, TGF-β를 처리시 나타나는 ARPE-19 세포의 형태학적인 변형을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 2c는 AdLacZ 또는 AdCCN5를 처리한 후, TGF-β 처리시 나타나는 ARPE-19 세포의 CCN5, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 2d는 AdLacZ 또는 AdCCN5를 처리한 후, TGF-β 처리시 나타나는 ARPE-19 세포의 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 전사체의 발현 변화를 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 실험을 통해 확인한 것이다.
도 2e는 AdLacZ 또는 AdCCN5를 처리한 후, TGF-β 처리시 나타나는 ARPE-19 세포의 면역 형광 이미지를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 2f는 콜라겐 젤 수축력 분석을 통해, AdLacZ 또는 AdCCN5를 처리한 후, TGF-β 처리시 나타나는 ARPE-19 세포의 수축성의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 CCN5가 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 억제하는 효과를 TGF-β 수용체의 억제제인 A83-01의 효과와 비교한 것이다.
도 4a는 AdCCN5가 TGF-β 처리된 ARPE-19 세포의 이동 능력에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 4b는 AdCCN5가 TGF-β 처리된 ARPE-19 세포에서 RPE65 및 MerTK의 발현에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 4c는 AdCCN5가 TGF-β 처리된 ARPE-19 세포의 식균작용에 미치는 영향을 pHrodo Red BioParticles을 이용하여 확인한 것이다.
도 4d는 AdCCN5가 TGF-β 처리된 ARPE-19 세포의 식균작용에 미치는 영향을 TAMRA 표지된 세포 사멸 흉선세포를 이용하여 측정한 것이다.
도 5는 AdCCN5가 TGF-β-SMAD 신호전달 경로에 주는 영향을 확인한 것이다.
도 6a는 TGF-β로 인한 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 CCN5가 회복할 수 있는지를 확인하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 6b는 AdCCN5에 의해 ARPE-19 세포의 변형이 회복됨을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 6c는 TGF-β를 처리하고 AdCCN5를 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현의 변화를 관찰한 것이다.
도 6d는 TGF-β를 처리하고, AdCCN5를 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 6e는 콜라겐 젤 수축력 분석을 통해, AdCCN5에 의한 ARPE-19 세포의 수축성 정상화 효과를 확인한 것이다.
도 7a는 TGF-β를 처리하고, AdCCN5를 처리한 후, ARPE-19 세포의 이동 능력 정상화를 관찰한 것이다.
도 7b는 TGF-β를 처리하고 AdCCN5를 처리한 후, ARPE-19 세포에서 RPE65 및 MerTK의 발현의 회복을 관찰한 것이다.
도 7c는 TGF-β 처리 후, AdCCN5가 ARPE-19 세포의 식균작용에 미치는 영향을 pHrodo Red BioParticles을 이용하여 확인한 것이다.
도 7d는 TGF-β 처리 후 AdCCN5가 ARPE-19 세포의 식균작용에 미치는 영향을 TAMRA가 표지된 세포 사멸 흉선세포를 이용하여 측정한 것이다.
도 8a는 TGF-β를 처리한 ARPE-19 세포에서 A83-01 효과를 알아보기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 8b는 ARPE-19 세포에서 TGF-β에 의한 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 A83-01가 정상화시키지 못하는 것을 관찰한 것이다.
도 9a는 Ccl2 -/- 마우스에서 CCN5에 의한 RPE 변형이 회복되는 효과를 측정하는 과정을 도식화한 것이다.
도 9b는 AAV9-CCN5가 Ccl2 -/- 마우스의 RPE 세포에 미치는 영향을 CCN5, RPE65, MerTK, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 통해 확인한 것이다.
도 9c는 항-ZO-1 항체, 항-CCN5 항체, 항-RPE65 항체 또는 항-α-SMA 항체로 염색하여 AAV9-CCN5가 Ccl2 -/- 마우스의 RPE 세포의 밀착연접의 형성에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 10a는 EEF로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 AdCCN5에 의해 예방될 수 있는지를 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 10b는 EEF를 처리한 ARPE-19 세포의 형태학적인 변형을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 10c는 AdCCN5를 처리한 ARPE-19 세포에 EEF를 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 10d는 AdCCN5를 처리한 ARPE-19 세포에 EEF를 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 11a는 베바시주맙으로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 AdCCN5에 의해 예방되는지를 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 11b는 베바시주맙을 처리한 ARPE-19 세포의 형태학적인 변형을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 11c는 AdCCN5를 처리한 ARPE-19 세포에 베바시주맙을 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 11d는 AdCCN5를 처리한 ARPE-19 세포에 베바시주맙을 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 12a는 ARPE-19 세포에 TGF-β를 처리한 후 CCN5를 코딩하는 modified mRNA를 처리하여, TGF-β로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 회복되는지를 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 12b는 TGF-β를 처리한 ARPE-19 세포에 CCN5를 코딩하는 modified mRNA를 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 관찰한 것이다.
도 12c는 TGF-β를 처리한 ARPE-19 세포에 CCN5를 코딩하는 modified mRNA를 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 13a는 TGF-β에 의해 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 CCN5 단백질에 의해 회복되는지를 확인하기 위한 과정을 도식화한 것이다.
도 13b는 TGF-β가 처리된 ARPE-19 세포에 CCN5 단백질을 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현을 관찰한 것이다.
도 13c는 TGF-β가 처리된 ARPE-19 세포에 CCN5 단백질을 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 14a는 ARPE-19 세포에 anti-VEGF 약물(베바시주맙, 라니비주맙 및 애플리버셉트)과 CCN5 단백질을 동시에 처리하여, anti-VEGF 약물로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 CCN5 단백질에 의해 억제되는지를 측정하는 과정을 도식화한 것이다.
도 14b는 ARPE-19 세포에 anti-VEGF 약물(베바시주맙, 라니비주맙 및 애플리버셉트)과 CCN5 단백질을 동시에 처리한 후, ARPE-19 세포에서 CCN5, CCN2, 중간엽 세포 마커 단백질 및 상피세포 마커 단백질의 발현을 관찰한 것이다.
도 14c는 ARPE-19 세포에 anti-VEGF 약물(베바시주맙, 라니비주맙 및 애플리버셉트)과 CCN5 단백질을 동시에 처리한 후, ARPE-19 세포를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
도 15a는 iPSC 유래 RPE 세포에 AAV2-CCN5를 처리한 후 TGF-β를 처리하여, TGF-β로 유도되는 RPE 세포의 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 억제되는지를 확인하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 15b는 iPSC 유래 RPE 세포에 AAV2-CCN5를 처리한 후 TGF-β를 처리하고, RPE 세포의 이미지를 항-ZO-1 항체, 항-α-SMA 항체 및 Phalloidin을 사용하여 관찰한 것이다.
본 발명은 일 측면으로, CCN5 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CCN5"는 혈관계 질환, 혈관신생, 종양생성, 섬유증 질환 유발, 세포 분화 및 생존과 같은 세포기능 조절에 다양한 역할을 하는 CCN 계열(CCN1-6)에 속하는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)-관련 단백질을 의미한다. CCN5 단백질은 다른 CCN 족 단백질과 다르게 C-말단 도메인이 없으며, WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L 등으로도 불린다. 또한, CCN5 단백질은 250개의 아미노산 서열의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다.
본 발명의 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 망막색소상피 세포의 섬유증적 변형을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 섬유증적 변형은 TGF-β, EGTA, EGF, FGF-2 및 anti-VEGF 약물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 의해 유발될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, CCN5가 망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포를 변형시키는 유발인자로 알려져 있는 TGF-β에 의한 RPE 세포의 섬유증적 변형을 예방함을 확인하였다. 또한, 다른 일 실시예에서는, 상기 CCN5가 이미 섬유증적 변형이 일어난 RPE 세포를 정상적인 세포로 회복시킴을 확인하였다.
본 명세서에서 사용한 CCN5는 인간 또는 동물 유래일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, RPE 세포에서 마우스 또는 인간 유래의 CCN5의 섬유증적 변형 억제 효과를 확인하였다.
상기 마우스 유래 CCN5는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 마우스 유래 CCN5를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 마우스 유래 CCN5는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 마우스 유래 CCN5는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 시그널펩티드(signal peptide)에 해당하는 1번 내지 23번 위치의 아미노산을 제외한 24번 내지 251번의 아미노산 서열(서열번호 3)일 수 있다.
상기 인간 유래 CCN5는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 인간 유래 CCN5를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 인간 유래 CCN5는 성숙된 형태일 수 있다 구체적으로, 상기 인간 유래 CCN5는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 시그널펩티드에 해당하는 1번 내지 23번 위치의 아미노산을 제외한 24번 내지 250번의 아미노산 서열(서열번호 6)일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "망막질환"은 망막색소상피 세포의 변형 또는 기능 상실에 따른 질병을 의미한다. 구체적으로, 망막질환은 증식성 유리체망막병증, 당뇨망막병증, 황반변성, 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 망막색소상피(RPE)는 신경 망막과 맥락막 사이에 위치하고 있으며, 입방형의 분극화된 단일막으로 망막의 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한다.
상기 증식성 유리체망막병증은 당뇨망막병증의 악화나 망막박리 수술에서 구멍의 폐쇄가 불완전한 경우에, 섬유성 세포가 망막 표면이나 유리체 내에 증식해서 막을 형성하고 그 막이 줄어들어 망막박리를 일으키는 질환이다. 망막박리가 발생하게 되면 망막색소상피세포가 유리되어 섬유세포로 변형되고 망막 표면에 증식된 신경아교세포와 함께 얇은 막이나 견인대를 형성하게 된다. 이러한 막이나 견인대가 수축하면 망막 전체가 응축되면서 고정주름이 생기고, 심하면 시신경유두부를 제외한 망막 전체가 깔때기 모양으로 박리될 수 있다.
상기 당뇨망막병증은 당뇨병에 의한 말초 순환 장애로 인해 눈의 망막에 발생한 합병증이다. 상기 질병은 초기에는 증상이 없다가 황반부의 침범이 일어나면서 시력저하의 증상을 나타낼 수 있다. 상기 당뇨망막병증은 진행 단계에 따라 단순망막증, 증식전망막증 및 증식망막증으로 나뉠 수 있다.
상기 황반변성은 노화가 진행함에 따라 황반 기능이 저하되어 시력이 떨어지거나 상실되는 질병으로서, 이 질병으로 인해 시력이 떨어지기 시작하면 이전의 시력으로 회복할 수 없다. 상기 질병은 노인성 황반변성으로 불리우며 노년기 시력상실의 주요 원인이다. 상기 황반변성은 건성 황반변성 및 습성 황반변성 두 종류로 구분된다. 황반변성을 앓고 있는 환자의 약 90%는 건성 황반변성이며, 이는 노화 퇴적물이 망막 아래에 쌓이거나 망막색소상피 위축과 같은 병변이 생긴 경우이다. 황반에 있는 시세포가 서서히 파괴되므로 시간이 지나면서 황반 기능이 떨어지고 중심부 시력이 감소하게 된다. 습성 황반변성은 황반부의 아래층을 구성하는 맥락막에 비정상적으로 새로운 혈관이 많이 생성되어 증상이 발생한다. 습성 황반변성은 건성 황반변성에 비해 진행이 빨라 시력이 급격히 떨어질 수 있고, 2개월 내지 3년 사이에 실명할 수 있다.
상기 맥락막 신생혈관증은 정상적이지 않은 혈관이 생겨남으로 인해 맥락막이 손상되어 시력장애가 발생하는 질병이다. 상기 맥락막 신생혈관증은 전 세계적으로 비가역적인 시력 손실의 주된 원인 중의 하나이며, 여러 가지의 치료 시도에도 불구하고 시력 예후는 대부분의 환자에서 좋지 않다.
상기 망막부종은 망막이 부었음을 의미한다. 여러 가지 이유로 인해 망막 또는 황반 내에 모세혈관과 같은 미세한 혈관에 변성 또는 이상이 발생함에 따라 출혈이 나타나게 되고 그 결과 망막부종이 발생할 수 있다. 망막에 부종이 발생하게 되면, 시력저하를 비롯한 다양한 증상이 나타날 수 있다.
상기 CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 CCN5 단백질을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 CCN5를 암호화하는 mRNA일 수 있다. 상기 CCN5를 암호화하는 mRNA는 CCN5를 암호화하는 폴리뉴클레오티드인 서열번호 2 또는 서열번호 5에 상보적인 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, CCN5를 코딩하는 modified mRNA가 RPE 세포를 변형시키는 유발인자로 알려져 있는 TGF-β 또는 EEF(EGTA, EGF 및 FGF-2)에 의한 RPE 세포의 섬유증적 변형을 정상적인 세포로 회복함을 확인하였다. Modified mRNA라 함은 다양한 형태로 변형된 mRNA로, 이러한 변형은 mRNA의 5'부분의 캡핑(capping), 3'부분의 poly-A tail 결합 (polyadenylation), 및 5-methylcytidine 및 2-thiouridine과 같은 수식 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 CCN5를 나타내는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 염기서열은 서열번호 2 또는 서열번호 5일 수 있다. 또한, CCN5를 발현하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "작동적으로 연결된"이란, 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
구체적으로, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 CCN5 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 상기 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터를 포함한다.
상기 프로모터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다.
상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 아데노-부속 바이러스는 특정 혈청형(serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9 중 어느 하나일 수 있다.
상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다.
상기 망막질환은 앞서 기술한 바와 같으며, 증식성 유리체망막병증, 당뇨망막병증, 황반변성, 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명에 따른 CCN5 또는 이의 단편; CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CCN5 또는 이의 단편; CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서는, 본 발명에 따른 CCN5를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 CCN5 단백질의 유효량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한 번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 1.0 x 105 내지 1.0 x 1015 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0 x 105 내지 1.0 x 1015, 1.0 x 107 내지 1.0 x 1013, 1.0 x 108 내지 1.0 x 1012 또는 1.0 x 109 내지 1.0 x 1010의 양으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 이를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 구체적으로 상기 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내, 유리체내 및 피내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, CCN5를 코딩하는 바이러스를 유리체내에 투여하였다.
본 발명은 또 다른 측면으로, CCN5 또는 이의 단편; 및 anti-VEGF 약물을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "anti-VEGF 약물"은 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 억제하는 용도로 사용되는 약물로서, 특정 암 또는 노인성 황반변성을 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 anti-VEFG 약물은 베바시주맙(Bevacizumab), 라니비주맙(Ranibizumab) 또는 애플리버셉트(Aflibercept)일 수 있다.
상기 베바시주맙의 상표명은 아바스틴(Avastin)으로서, 수많은 유형의 암과 특정 눈병을 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 상기 베바시주맙은 암의 경우 정맥에 천천히 주사함으로써 투여되며 대장암, 폐암, 교모세포종, 신세포암 등에 사용된다. 또한, 상기 베바시주맙은 황반변성의 경우 눈에 직접 주사함으로써 투여된다. 일반적인 부작용으로는 암에 대해 사용시, 코피, 두통, 고혈압, 발진 등이 포함된다. 다른 심각한 부작용으로는 위장관 천공, 출혈, 알레르기 반응, 혈전, 감염 위험 증가가 포함된다. 눈병에 사용시의 부작용으로는 시력 손실, 망막 박리가 포함된다. 베바시주맙은 혈관 생성 억제제이며 단클론항체 계열의 약물에 속한다. 혈관 형성 속도를 떨어뜨림으로써 동작한다.
상기 라니비주맙의 상표명은 루센티스(Lucentis)로서, 베바시주맙과 동일한 부모 마우스 항체로부터 생성된 단클론 항체 단편(Fab)이다. 상기 라니비주맙은 습성 노인성 황반변성을 치료하기 위해 승인된 항 혈관신생 약물로서, 이는 베바시주맙의 효과와 부작용 비율이 비슷하다.
상기 애플리버셉트의 상표명은 아일리아(Eylea)로서, 미국 및 유럽에서 습성 황반변성을 치료하기 위해 승인된 약물이다.
본 발명은 또 다른 측면으로, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
이때, 상기 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스, 및 anti-VEGF 약물은 상술한 바와 같다.
본 발명은 또 다른 측면으로, CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 세포는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 외래로부터 도입된 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 CCN5는 인간 유래일 수 있다.
또한, 상기 세포는 줄기세포 또는 망막색소상피 세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 또는 성체줄기세포세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs), 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 유래일 수 있다.
본 발명은 일 실시예에서, TGF-β로 섬유증적 변형이 유도된 인간 유도만능 줄기세포유래 RPE 세포에서 CCN5의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험 결과, TGF-β로 유도된 iPSC 유래 RPE 세포의 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 예방됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 RPE 세포의 섬유증적 변형을 예방 또는 치료하기 위한 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기와 같은 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 함유하는 세포치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에서, "세포치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가, 동종 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포치료제는 사용하는 세포의 종류와 분화 정도에 따라 체세포치료제 및 줄기세포치료제로 분류할 수 있으며, 상기 줄기세포치료제는 배아줄기세포치료제 및 성체줄기세포치료제로 분류할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
I. 실험 준비 및 실험 방법
실시예 1. 동물모델
Ccl2 -/- 마우스(Jackson Laboratories, USA)와 C57BL/6 야생형(WT) 마우스(Damul Sicence, Korea)를 10회 역교배 시켜 모델 마우스를 제작하였다. AAV9-VLP 혹은 AAV9-CCN5를 18개월령의 Ccl2 -/- 마우스에 주사하였다. 모든 동물 실험 방법 및 프로토콜은 광주과학기술원 생명과학부의 시설에서 동물 관리 사용 위원회에 의해 승인된 지침에 따라 실시 되었다(IACUC GIST-2015-24). 이때, 상기 VLP는 바이러스유사입자(Virus-Like Particles)를 의미한다.
AAV9-VLP를 투여한 같은 개월령의 WT 마우스를 대조군으로 사용하였다. 마우스에 Zoletil 50(Virvac, France) 및 Rumpun(Bayer Korea, Korea)를 3:1 비율로 복강 내 주사하여 마취하였다. 수술 후 마우스를 이틀에 한 번 모니터링하고 이상 반응이 있었는지 여부를 조사하였다. 모니터링 결과, 다른 장기에 유해한 임상 증상은 보이지 않았다. 12주 후 CO2를 이용하여 안락사 시키고 안구를 적출하였다.
실시예 2. 시약
재조합 TGF-β2는 PeproTech Korea(Korea)에서 구입하였고, 10 ng/ml로 ARPE-19 세포에 처리하였다. 재조합 EGF와 FGF-2는 Invitrogen(USA)에서 구입하였고, 1 mM EGTA, 10 ng/ml EGF 및 20 ng/ml FGF-2를 ARPE-19세포에 처리하였다. 또한, ARPE-19 세포에 세 가지의 anti-VEGF 약물인 베바시주맙(0.25 mg/ml, Genetech/Roche, USA), 라니비주맙(0.125 mg/ml, Norvatis Pharma Stein AG, Switzerland) 및 애플리버셉트(0.5 mg/ml, Bayer Pharma AG, Germany)을 처리하였다.
실시예 3. 아데노 -관련 바이러스 벡터( AAV ) 및 아데노바이러스 제작
미국 Virovek 회사를 통해, CMV 프로모터를 이용하여 인간 CCN5 유전자를 발현하는 AAV(serotype 2와 9)를 제작하고 정제하였다. 이를 통해 AAV2-CCN5와 AAV9-CCN5를 수득하였다. 또한, 아미노-말단 헤마글루티닌(HA)이 결합된 마우스 CCN5를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제작하고 정제하는 방법은 선행연구에 기술되어 있다(Yoon PO, et al. The opposing effects of CCN2 and CCN5 on the development of cardiac hypertrophy and fibrosis. J Mol Cell Cardiol. 2010;49(2):294-303.). 이와 같은 방법으로 LacZ 및 CCN5를 코딩하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스인 AdLacZ 및 AdCCN5를 제작하였다.
실시예 4. CCN5를 코딩하는 modified mRNA 제작
미국 Trilink 회사를 통해, CCN5를 코딩하는 modified mRNA를 제작하고 정제하였다. 이 modified mRNA는 CleanCap으로 5'말단이 캡핑되었고, 3'말단에는 polyA tail이 연결되어 있다. 또한 이 modified mRNA는 5-methylcytidine과 2-thiouridine을 포함하고 있다.
실시예 5. 세포배양
망막색소상피 세포주(ARPE-19; ATCC, USA)를 1% 항생제(Gibco, USA)와 10% 우태아혈청(FBS; HyClone, USA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's F12 Nutrient Mixture(DMEM/F12; Welgene, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2일에 한 번씩 새로운 배양액으로 갈아주었다. 세포가 배양 접시에 어느 정도 배양되면 0.25% 트립신/0.02% EDTA(Gibco, USA)를 이용하여 계대배양하였다.
인간 iPSC 유래 망막색소상피(RPE) 세포는 Axol Bioscience(USA)를 통해 수입하였다. 상기 세포는 2% B-27 보충제(Gibco, USA) 및 1% 항생제-항진균제 (Gibco, USA)를 7:3 비율로 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's F12 Nutrient Mixture(DMEM/F12; Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. Matrigel(Corning Life Science, USA) 코팅이 된 8-웰 챔버 슬라이드(Corning Life Science, USA)에 웰당 100,000 세포를 파종하였고, 매일 새로운 배양액으로 갈아주었다.
배양된 세포의 약물처리는, 망막색소상피 세포의 중간엽세포로의 분화유도를 억제하는 군과 중간엽세포로 분화 유도된 망막색소상피 세포를 다시 정상적인 망막색소상피 세포로 되돌리는 군으로 나누어 진행하였다. ARPE-19 세포들을 24시간 동안 혈청이 배제된 배양액에 키운 뒤, AdCCN5을 50 MOI(Multiplicity of infection)로 처리 후 10 ng/ml TGF-β2(PeproTech Korea, Korea)를 처리하거나, TGF-β2를 선처리 후 AdCCN5를 넣어주었다.
실시예 6. 웨스턴 블롯 분석
in vitro 실험을 위해, 배양된 ARPE-19 세포들을 인산염완충식염수(PBS)를 이용하여 세척하고, 차가운 RIPA 완충액(1% NP-40, 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 및 10 mM NaF) 및 프로테아제 억제 칵테일(Roche, Germany)을 혼합한 용액으로 세포를 현탁시켰다. 세포 현탁액을 초음파발생장치를 통해 5%의 진폭에서 2초/1초 점멸 사이클로 5분 동안 처리하였다.
in vivo 실험을 위해, Ccl2 -/- 마우스의 눈을 적출하여 망막/맥락막/공막 집합체만 떼어내고 차가운 RIPA 완충액에 담아 1/8 inch 미세팁을 이용한 초음파발생장치를 통해 5%의 진폭에서 2초/2초 점멸 사이클로 10초 동안 처리하였다. 세포 용해질을 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단백질이 녹아있는 상등액을 따서 bicinchoninic acid protein assay kit (BCA, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 농도를 측정하였다. 동량의 단백질 시료를 5 x SDS 완충액과 혼합하여 SDS-PAGE 전기영동한 후, polyvinylidene difluoride membrane(Millipore, USA)로 옮겼다. 5% 탈지분유를 함유하는 Tris-완충액에 1시간 블로킹 한 뒤, 1차 항체와 4℃에서 하룻동안 반응시켰다. 그 다음, 상기 막을 홀스래디쉬 페록시다제(HRP, Jackson ImmunoResearch)와 접합시킨 2차 항체와 반응시키고, 화학 발광 기질(Amersham)을 처리한 후, ImageQuant LAS 4,000 Mini imager(GE Healthcare)를 통해 현상하였다. 단백질 정량적 분석은 ImageJ 프로그램(NIH)을 이용하였다.
실시예 7. 면역형광 염색법
커버슬립이 담겨있는 12-웰 배양 접시에 파종하여 키운 세포를 4% 포름알데하이드로 고정시키고 0.2% Triton X-100을 10분간 처리하였다. PBS에 5% 우혈청 알부민이 희석된 용액으로 블로킹한 뒤, 항-ZO-1, 항-α-SMA 항체를 사용하여 4℃에서 하룻동안 반응시켰다. 2차 항체는 FITC- 혹은 Alexa Fluor 594와 f-액틴을 염색하는 Texas Red-conjugated phalloidin(Invitrogen, USA)과 핵 염색을 위한 Hoechst 33342(Invitrogen, USA)을 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. Epifluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 결과를 관찰하였다. 망막 평면 마운트 실험을 위해 마우스의 안구를 적출하여 4% 포름알데하이드에서 24시간 동안 고정시켰다. RPE/choroid/sclera 복합체를 반투과성 용액과 블록킹 용액이 함유된 용액으로 실온에서 각각 2시간, 1시간 동안 처리한 뒤, 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시키고, PBS로 세척 후 DAPI(Sigma Aldrich, USA)로 핵 염색을 하였다. 다시 PBS로 세척하고 RPE/choroid/sclera 복합체를 Fluoromount (Sigma Aldrich, USA)로 마운팅하고 형광 현미경으로 관찰하였다.
한편, 본 발명에서 사용한 1차 항체 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
항체 회사 희석비율 수행실험 유래
ZO-1 Invitrogen 1:1000 WB, ICC Rabbit
ZO-1 Invitrogen 1:200 IHC Mouse
Occludin Invitrogen 1:1000 WB Rabbit
Fibronectin Sigma-Aldrich 1:1000 WB Rabbit
α-SMA Sigma-Aldrich 1:1000 WB, ICC Mouse
Vimentin Santa Cruz 1:1000 WB Mouse
HA Roche 1:1000 WB Mouse
Type I collagen Abcam 1:1000 WB Mouse
CCN5 GenScript 1:1000 WB Mouse
CCN5 OriGene 1:200 IHC Rabbit
MerTK R&D systems 1:1000 WB Goat
RPE65 Abcam 1:1000 WB Mouse
GAPDH Abcam 1:1000 WB Rabbit
실시예 8. RNA 추출 및 정량적 실시간 중합효소연쇄반응Trizol(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 키트(Promega, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, SYBR green(TAKARA, Japan)을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 증폭 반응의 반응 곡선을 분석하여 RNA의 양을 분석하였고, 3회 또는 4회 수행하였다. 18s rRNA로 표준화하여 유전자들의 상대적인 발현량을 정량화하였다.
실시예 9. 콜라겐 젤 수축 분석
콜라겐 젤 수축 분석은 기존의 논문과 같이 수행하였다(Liu Y, et al. Induction by latanoprost of collagen gel contraction mediated by human tenon fibroblasts: role of intracellular signaling molecules, Investigative ophthalmology & visual science, 2008;49(4):1429-36.). 구체적으로, 배양한 ARPE-19 세포들을 1.2 mg/ml의 콜라겐 용액(Invitrogen, USA)과 섞고 1N NaOH를 넣어 콜라겐 용액의 pH를 중성화시켰다. 24-웰 배양접시에 콜라겐 젤 현탁액(1 x 105 cells/well, 500 μL)을 넣고 37℃에서 1시간 동안 중합반응시켰다. 콜라겐 젤이 형성되면 파이펫 팁으로 가장자리를 떼어 젤을 배지에 부유 시킨 후 다양한 시약들을 처리하고 콜라겐 젤의 수축 정도를 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정 및 분석하였다.
실시예 10. 시험관 세포이동 능력 분석
세포의 이동 능력을 측정하기 위해, 커버슬립이 들어있는 12-웰 배양접시에 ARPE-19 세포를 깔고 배양세포가 커버슬립 전체 면적을 덮을 때까지 배양하였다. 실험 계획에 따라 시약을 처리한 뒤, 200 μL의 팁을 이용하여 세포에 스크래치를 만들었다. 24시간 후, 세포를 DAPI로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 이후, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 세포가 이동한 거리를 측정하였다.
실시예 11. 식균작용 분석
ARPE-19 세포를 웰당 5 x 104 세포의 밀도로 24-웰 배양 접시에 파종하고 AdLacZ 또는 AdCCN5, 및 TGF-β로 처리하였다. TAMRA 염색된 세포 사멸 흉선세포 또는 1 mg/ml pHrodo Red BioParticles(Invitrogen, USA)를 37℃, 5% CO2 배양기에서 각각 6시간, 4시간 동안 처리하여 식세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
TAMRA 표지된 세포 사멸 흉선세포(apoptotic thymocyte)를 생성하기 위해, 5 내지 6주된 C57BL/6 마우스로부터 흉선을 획득하고, 5 ml 주사기 피스톤 및 세포 여과기를 사용하여 단일 흉선 세포를 분리하여 해리시켰다. 흉선 세포를 50 μM TAMRA-SE(Invitrogen, USA)로 37℃ 세포 배양기에서 30분 동안 염색하였다. 이후, 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민을 함유하는 RPMI에서 37℃의 조건으로 20분 동안 배양하여 탈색하고, 완전한 RPMI로 1회 세척하였다. 세포 사멸 흉선세포는 50 μM dexamethasone(Calbiochem, Germany)를 37℃ CO2 세포 배양기에서 4시간 동안 처리하여 유도하였다. 그 후, 세포를 완전한 RPMI로 3회 세척하고, 2 Х 105 세포 사멸 흉선세포를 식세포 배양 배지 300 ㎕에 재현탁하였다.
세포 사멸 흉선세포 현탁액을 ARPE-19 세포와 함께 세포 배양기에서 배양하였다. 그 후, 식세포를 차가운 PBS로 5회 세척한 후 트립신을 처리하고 완전한 배양 배지에 현탁시킨 뒤, FACSCantoTM II 유동 세포 계측기(BD, USA)를 사용하여 분석하였다.
식균작용을 한 군과 하지 않은 ARPE-19 세포를 구별하기 위해 전방 산란/측면 산란 플롯에 따라 게이팅 하였다. 마커 M1을 사용하여 게이팅 한 후, 샘플당 20,000개의 살아있는 세포로부터 형광-양성 반응의 백분율을 계산하였으며, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
실시예 12. 유리체강 내 AAV9-CCN5 및 AAV9-VLP 주입
33G 바늘을 이용해 현미경 (Leica Microsystems Ltd, Germany)으로 관찰하며 유리체 내에 AAV9-CCN5를 주사하였다. 반대쪽 눈은 AAV9-VLP 대조군으로서 역할을 하였다.
실시예 13. 통계분석
정량적 유전자 발현 분석은 3회 이상 반복하여 실시하였다. 실험 결과는 평균±표준편차 형태로 나타내고 통계적인 분석은 Student's t-test를 이용하였다. 통계적인 유의성이 있는 것은 별표(*, p<0.05 혹은 **, p<0.01)로 표기하였다.
II. ARPE-19 세포에서 CCN5 효과 확인
실험예 1. CCN5의 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형 억제 효과 확인
ARPE-19는 인간 RPE에서 자연적으로 분화 유도된 세포주다. 성숙한 ARPE-19 세포들은 조약돌 모양으로 단일층을 이루며 상피세포 특이적인 마커 단백질을 발현한다. 배양한 ARPE-19 세포에 TGF-β를 5 ng/ml 또는 10 ng/ml로 2일 동안 처리하였다(도 1a). 그 결과를 도 1b 내지 도 1d에 나타내었다.
도 1b에 나타난 바와 같이, TGF-β를 처리한 후, ARPE-19 세포는 섬유아세포의 형태로 변형이 나타났다. 특히, 도 1c에 나타난 바와 같이, TGF-β를 처리한 경우, 인간 유래 CCN5 단백질 발현 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이와 함께, 중간엽 세포 마커 단백질인 α-SMA, vimentin, fibronectin 및 type I collagen의 발현은 증가한 반면, 상피세포 마커 단백질인 ZO-1 및 occludin의 발현이 유의하게 감소하였다. 또한, 면역 형광염색법을 통해, TGF-β를 처리한 경우, α-SMA 및 f-액틴의 발현이 증가하고, 밀착연접 (tight junction)의 형성이 저해되는 것을 확인하였다(도 1d). 이를 통해, TGF-β 처리가 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이후의 실험에서 ARPE-19 세포를 10 ng/ml의 TGF-β로 48시간 동안 처리하여 섬유증적 변형을 유도하였다.
ARPE-19 세포를 마우스 유래 CCN5를 발현하는 재조합 아데노 바이러스(AdCCN5) 또는 대조군인 AdLacZ로 감염시켰다. 감염 후 2일 째에 세포를 TGF-β로 처리하였다(도 2a). 그 결과를 도 2b 내지 2d에 나타내었다.
도 2b에 나타난 바와 같이, AdCCN5는 TGF-β에 의해 유도되는 형태학적 변화를 유의하게 억제하였다. 또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블로팅을 통해, AdCCN5가 TGF-β에 의해 유도되는 중간엽 세포 마커 단백질과 상피세포 마커 단백질의 발현 변화를 정상화 시키는 것을 확인하였다. 이러한 변화는 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 실험을 통해서도 확인하였다(도 2d). 또한, TGF-β에 의해 밀착연접이 망가지는 현상이 마우스 유래 AdCCN5에 의해 억제된다는 것을 ZO-1에 대한 면역형광 염색법을 통해 알 수 있었고, TGF-β에 의해 유도되는 α-SMA 의 발현 증가와 f-액틴의 형성이 AdCCN5에 의해 억제됨을 확인하였다(도 2e).
한편, α-SMA의 발현 증가로 인한 수축능력의 증가는 상피세포의 섬유증적 변형의 두드러진 특성이다. 콜라겐 젤 수축력 분석을 통해, TGF-β에 의해 증가된 세포의 수축성이 마우스 유래 AdCCN5에 의해 유의미하게 감소되었음을 확인하였고, 이를 도 2f에 나타내었다.
A83-01은 ALK-5 억제제와 구조적으로 유사한, TGF-β 수용체의 억제제이다. 웨스턴 블로팅을 통해 인간 유래 CCN5는 A83-01과 동일한 수준으로 TGF-β에 의해 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 억제하는 것을 관찰하였다(도 3).
상기 결과들을 통해, TGF-β에 의한 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 CCN5가 예방함을 알 수 있었다.
실험예 2. CCN5의 ARPE-19 세포의 기능 저하 예방 확인
TGF-β는 ARPE-19 세포의 형태학적 변이 뿐만 아니라 기능적 저하를 유발한다. ARPE-19 세포를 마우스 유래 AdCCN5 혹은 AdLacZ로 2일 동안 감염시킨 후, TGF-β를 다시 2일 동안 처리하였다. 세포 단층에 스크래치를 준 뒤, 24시간 후에 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, TGF-β는 ARPE-19 세포의 이동 능력을 증가시켰으나, AdCCN5에 의해 ARPE-19 세포의 이동이 유의하게 억제되었다.
RPE65 효소는 정상적인 시야에 필수적인 요소로 all-trans retinal을 11-cis retinal로 변환시키는 역할을 한다. 또한, MerTK 단백질은 RPE 세포의 식균 작용 활성에 중요한 역할을 한다. 웨스턴 블로팅을 통해, RPE65 효소와 MerTK 단백질의 발현 수준이 TGF-β 처리시 유의하게 감소하고, 이것이 마우스 유래 AdCCN5에 의해 억제됨을 확인하였다. 이를 도 4b에 나타내었다.
pH에 민감한 형광 표지물질인 pHrodo Red-표지 BioParticle과 TAMRA-표지 세포 사멸 흉선세포를 이용하여, RPE 세포의 식균 작용 기능을 관찰하였다. 상기 형광물질은 산성 환경의 포식소체로 둘러싸이게 되면 활성을 띄게 된다. RPE 세포를 상기 형광 물질과 배양한 뒤 유동 세포 계측기로 분석하였다. 그 결과를 도 4c 및 도 4d에 나타내었다.
도 4c 및 도 4d에 나타난 바와 같이, TGF-β에 의해 RPE 세포의 식균 작용 활성이 현저하게 감소되었고, 이러한 현상이 마우스 유래 AdCCN5에 의해 크게 저해되었다. 상기 결과를 통해, AdCCN5가 TGF-β로 인한 ARPE-19 세포의 기능 저하를 예방함을 알 수 있었다.
실험예 3. CCN5의 TGF-β-SMAD 신호전달 경로 억제 효과 확인
웨스턴 블로팅을 이용하여, 인간 유래 CCN5가 TGF-β-SMAD 신호전달 경로에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, TGF-β는 TGF-β 수용체인 TGF-βRII와, TGF-β에 의해 유도되는 EMT(epithelial-mesenchymal transition)에 관여하는 전사 인자인 SNAI1 및 SNAI2의 발현 수준을 상향 조절하였다. 그러나, 이러한 전사 인자의 발현은 AdCCN5에 의해 크게 감소되었다. 또한, AdCCN5 처리시, TGF-β에 의한 SMAD2 의 인산화의 증가가 억제되었고, TGF-β에 의한 SMAD4 발현의 증가가 억제되었다. 또한 TGF-β에 의한 SMAD7 발현의 감소가 억제되었다. CCN2는 RPE 세포의 섬유증적 변형에 관여하는 섬유화 촉진 분자이며, TGF-β 신호의 하류 표적이다. TGF-β에 의해 CCN2의 발현 수준이 증가하고 이는 AdCCN5에 의해 저해되었다. 상기 결과를 통해, CCN5가 TGF-β-SMAD 신호전달 경로를 억제함을 알 수 있었다.
실험예 4. CCN5의 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형 회복 효과 확인
TGF-β로 인해 이미 형성된 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 인간 유래 CCN5가 회복시킬 수 있는지에 대한 실험을 수행하였다. 이를 위해, ARPE-19 세포에 TGF-β를 2일 동안 처리한 후, AdCCN5 또는 AdLacZ를 감염시켰다 (도 6a). 그 결과를 도 6b 내지 도 6e에 나타내었다.
도 6b에 나타난 바와 같이, TGF-β로 유도된 ARPE-19 세포의 형태학적 변형이 AdCCN5에 의해 원래의 모양으로 회복되었다. 또한, 웨스턴 블로팅을 통해, AdCCN5가 TGF-β에 의해 유도된 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현 증가와 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현 감소를 유의하게 정상화시킴을 확인하였다(도 6c). 또한, 면역 형광염색법을 통해, TGF-β에 의해 망가진 밀착연접이 AdCCN5에 의해 현저하게 회복되는 것을 확인하였고, TGF-β에 의해 증가된 α-SMA의 발현을 정상화 시킴을 확인하였다. 또한, Phalloidin 염색을 통해, TGF-β로 인한 f-액틴의 증가를 AdCCN5가 정상화시키는 것을 확인하였다(도 6d). 또한, 콜라겐 젤 수축 분석을 통해, TGF-β로 증가된 세포의 수축력이 AdCCN5에 의해 유의하게 감소됨을 확인하였다(도 6e). 상기 결과를 통해, CCN5가 TGF-β에 의해 유도된 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. CCN5의 ARPE-19 세포의 기능 저하 회복 효과 확인
ARPE-19 세포에 TGF-β를 2일 동안 처리한 후, 인간 유래 AdCCN5 또는 AdLacZ를 감염시켰다. 이후, ARPE-19 세포의 기능에 대한 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 7a 내지 도 7d에 나타내었다.
도 7a에 나타난 바와 같이, TGF-β에 의해 유도된 ARPE-19 세포의 이동 능력의 향상이 AdCCN5에 의해 유의하게 감소하였다. 도 7b에 나타난 바와 같이, AdCCN5는 TGF-β로 감소되는 RPE65와 MerTK 단백질의 발현을 유의하게 정상화 시켰다. 또한, 유동 세포 계측법 분석을 통해, TGF-β에 의해 감소되는 식균 작용 활성이 AdCCN5에 의해 현저하게 회복되는 것을 확인하였다(도 7c 및 도 7d). 상기 결과를 통해, CCN5가 TGF-β로 유도된 ARPE-19 세포의 기능적 결함을 정상적으로 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다.
ARPE-19 세포에 TGF-β를 처리한 뒤 2일 후, TGF-β 억제제인 하기 화학식 1의 A83-01(Sigma-Aldrich, USA)을 처리하였다(도 8a):
[화학식 1]
Figure 112020059891211-pat00001
.
그 결과를 도 8b에 나타내었다. 도 8b에 나타난 바와 같이, CCN5와 달리 A83-01은 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)과 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 비정상적인 발현 변화를 정상화하지 못했다(도 8b). 상기 결과를 통해, TGF-β 신호 전달의 억제가 ARPE-19 세포에서 TGF-β로 유도된 섬유증적 변형을 방지할 수는 있지만, 이미 형성된 섬유증적 변형을 회복시킬 수 없다는 것을 알 수 있었다.
실험예 6. 생체 내에서 CCN5에 의한 RPE 섬유증적 변형 회복 효과 확인
노화된 Ccl2 -/- 마우스는 RPE의 섬유증적 변형을 포함한 건성 노인성 황반변성의 특성을 가지고 있다. 18개월 된 Ccl2 -/- 마우스의 우안에 인간 유래 CCN5를 발현하는 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV9-CCN5)를, 좌안에 대조군 바이러스(AAV9-VLP)를 유리체강내 주입술로 주사하였다. 주사한지 12주 뒤에 안구를 적출하여 RPE 층을 수득하여 분석하였다(도 9a). 그 결과를 도 9b 및 도 9c에 나타내었다.
도 9b에 나타난 바와 같이, Ccl2 -/- 마우스의 안구의 RPE 층에서 정상(WT) 마우스의 안구의 RPE 층에 비해 CCN5의 발현이 현저하게 감소하였고, 이것이 AAV9-CCN5에 의해 회복되었다. 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현은 Ccl2 -/- 마우스의 RPE에서 현저하게 증가한 반면, 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현과 RPE 기능과 관련된 마커 단백질(RPE65 및 MerTK)의 발현은 크게 감소하였고, 상기 변화들이 AAV9-CCN5에 의해 정상적으로 회복되었다.
또한, RPE 세포의 밀착연접의 고유한 특성을 확인하기 위해 RPE/choroid/sclera 복합체를 조사하였다. 그 결과를 도 9c에 나타내었다.
도 9c에 나타난 바와 같이, AAV9-VLP를 주사한 18개월 된 정상 마우스의 RPE에서 보여지는 잘 정돈된 육각형 모형의 밀착연접의 구조가, 컨트롤 바이러스를 넣어준 연령이 일치하는 Ccl2 -/- 마우스의 RPE에서는 불규칙한 모양으로 변형되어 있는 것이 관찰되었다. 반면, AAV9-CCN5를 유리체강 내에 주입한 연령이 일치하는 Ccl2 -/- 마우스의 RPE 세포에서는 밀착연접이 정상적인 형태로 회복된 것을 확인하였다. 또한 이와 동시에 RPE65 단백질 발현의 감소가 정상화 되었고, α-SMA의 발현도 감소하였다(도 9c). 상기 결과를 통해, 노화된 Ccl2 -/- 마우스의 RPE에서 나타나는 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 회복됨을 알 수 있었다.
실험예 7. CCN5의 밀착연접 파괴로 인한 ARPE -19 세포의 섬유증적 변형 예방
세포의 밀착연접은 RPE 기능에 중요하며, 밀착연접의 파괴는 다양한 안질환과 밀접한 상관관계가 있다. RPE 세포에 EGTA, EGF 및 FGF-2(이하, EEF)의 조합을 처리하면, RPE 세포의 밀착연접이 파괴되어 정상적인 RPE의 형태 및 기능을 상실하게 된다.
ARPE-19 세포에 인간 유래 AdCCN5 또는 AdLacZ로 2일 동안 감염시킨 후, 다시 EEF로 2일 간 처리하였다(도 10a). 그 결과를 도 10b 내지 도 10d에 나타내었다. 도 10b에 나타난 바와 같이, AdCCN5는 EEF 처리에 의해 유도된 형태학적 변화를 유의하게 억제하였다. 웨스턴 블롯팅을 통해, AdCCN5가 EEF 조합으로 유도된 CCN2 및 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현 증가를 억제하고, 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현 감소를 억제함을 확인하였다(도 10c). CCN5의 발현이 EEF에 의해 감소되는 것은 주목할만한 결과이다. 또한, 면역 형광염색법을 통해, AdCCN5가 EEF로 유도된 밀착연접의 파괴 현상을 억제하고, EEF로 유도된 α-SMA의 발현 증가를 억제함을 확인하였다. Phalloidin 염색을 통해, AdCCN5가 EEF로 형성되는 f-액틴을 억제함을 확인하였다(도 10d). 상기 결과를 통해, CCN5가 EEF로 유도된 밀착연접의 파괴로 인한 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 예방함을 알 수 있었다.
실험예 8. CCN5의 베바시주맙에 의한 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형 예방
신생 혈관을 저해하는 anti-VEGF 약물은 습성 노인성 황반변성을 치료하는 데 널리 사용되는 방법이다. 그러나, 상기 방법은 RPE 세포의 형태학적 및 기능적 변형을 일으키는 부작용이 있다. 베바시주맙은 다양한 암이나 습성 노인성 황반변성 치료에 일반적으로 사용되는 첫 세대의 anti-VEGF 약물이다. 본 실험예에서는 베바시주맙이 ARPE-19 세포에서 섬유증적 변형을 유도하는지, 그리고 이런 유해한 결과가 인간 유래 CCN5에 의해 예방 되는지 여부를 조사하였다. 구체적인 실험 과정은 실시예 2에 나타내었으며, 상기 실험 과정을 도 11a에 도식화하여 나타내었다. 상기 실험 결과를 도 11b 내지 도 11d에 나타내었다.
도 11b에 나타난 바와 같이, 베바시주맙을 ARPE-19 세포에 처리한 경우, 세포의 형태가 변화되었고, 이러한 현상은 AdCCN5에 의해 억제되었다. 웨스턴 블롯팅을 통해, AdCCN5가 베바시주맙으로 유도된 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현 증가와, 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현 감소를 억제하는 것을 확인하였다(도 11c). CCN5의 발현이 베바시주맙에 의해 감소되는 것은 주목할만한 결과이다. 또한, 면역 형광염색법을 통해, AdCCN5가 베바시주맙으로 유도된 밀착연접의 파괴 현상을 억제함을 확인하였다(도 11d). 상기 결과를 통해, CCN5가 베바시주맙으로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 예방함을 알 수 있었다.
실험예 9. CCN5를 코딩하는 modified mRNA 및 CCN5 단백질의 효과
인간 유래 CCN5를 코딩하는 modified mRNA(이하 modRNA-CCN5라 함) 또는 정제된 인간 유래 CCN5 단백질을 이용하여, 도 12a 및 도 13a로 도식화되어 있는 실험과정에 따라 실험을 진행하였다. 그 결과를 도 12b 내지 도 12c, 및 도 13b 내지 도 13c에 나타내었다.
웨스턴 블롯팅을 통해, modRNA-CCN5와 정제된 CCN5 단백질이 ARPE-19 세포에서 TGF-β로 유도된 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현 증가를 억제하고, 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현 감소를 정상 수준으로 회복시켜 주는 것을 확인하였다(도 12b 및 도 13b). 또한, 면역 형광염색법을 통해, modRNA-CCN5와 정제된 CCN5 단백질이 TGF-β로 파괴된 밀착연접을 정상적으로 회복시키는 것을 확인하였다(도 12c 및 도 13c). 상기 결과는 CCN5가 modified mRNA 형태 및 정제된 단백질 형태로 전달된 경우에도, TGF-β로 유도된 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형을 회복하는데 탁월한 효과가 있음을 보여준다.
실험예 10. CCN5의 anti- VEGF 약물( 베바시주맙 , 라니비주맙 및 애플리버셉트 )로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형 예방
anti-VEGF 약물인 베바시주맙, 라니비주맙 및 애플리버셉트가 ARPE-19 세포에서 동일하게 섬유증적 변형을 유도하는지, 그리고 이 변형이 인간 유래 CCN5에 의해 예방이 되는지 조사하였다(도 14a). 실험 과정을 도 14a에 도식화하여 나타내었고, 실험 결과를 도 14b 및 도 14c에 나타내었다.
도 14b에 나타난 바와 같이, anti-VEGF 약물인 베바시주맙, 라니비주맙 및 애플리버셉트가 동일하게 CCN5의 발현을 감소시키고 CCN2 발현을 증가시켰으며, 이러한 현상은 CCN5 단백질에 의해 억제되었다. 웨스턴 블롯팅을 통해, CCN5가 anti-VEGF 약물로 유도된 중간엽 세포 마커 단백질(α-SMA, vimentin 및 fibronectin)의 발현 증가와 상피세포 마커 단백질(ZO-1 및 occludin)의 발현 감소를 억제함을 확인하였다(도 14c). 또한, 면역 형광염색법을 통해, CCN5가 anti-VEGF 약물로 유도되는 밀착연접의 파괴, α-SMA의 발현 증가, 그리고 f-액틴의 형성을 억제함을 확인하였다(도 14c). 상기 결과는 anti-VEGF 약물로 유도되는 ARPE-19 세포의 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 예방됨을 보여준다.
실험예 11. CCN5의 TGF -β로 유도되는 iPSC 유래 RPE 세포의 섬유증적 변형 예방
TGF-β로 유도되는 RPE 세포의 섬유증적 변형을 막아주는 인간 유래 CCN5의 효과를 인간 iPSC 유래 RPE 세포에서 확인하는 실험을 수행하였다. iPSC 유래 RPE 세포를 파종하고 2주 뒤 AAV2-CCN5를 감염시킨 후 25일 동안 배양한 뒤 TGF-β를 3일 동안 처리하였다(도 15a). 세포를 파종한지 2주 안에 iPSC 유래 RPE 세포는 조밀한 조약돌 모양의 형태를 보인다. 그리고 1개월 후, RPE 세포 특유의 색소(pigmentation)가 나타나기 시작하면서 돔 형태의 모양을 형성하게 되었다. 그 결과를 도 15b에 나타내었다.
면역 형광염색법을 통해, AAV2-CCN5가 TGF-β로 유도되는 밀착연접의 파괴, α-SMA 의 발현 증기 및 f-액틴의 형성을 억제함을 확인하였다(도 15b). 상기 결과는 TGF-β로 유도되는 iPSC 유래 RPE 세포의 섬유증적 변형이 CCN5에 의해 예방됨을 보여준다.
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aacccaattg cagggttttg 360 tgccgctgtg atgacggtgg tttcacctgc ctgccgctgt gcagtgagga tgtgcggctg 420 cccagctggg actgcccacg ccccaggaga atacaggtgc caggaaggtg ctgccccgag 480 tgggtgtgtg accaggcagt gatgcagccg gcaatccagc cctcctcagc ccaaggacac 540 caactttctg cccttgtcac tcctgcatct gccgatggcc cctgtccaaa ctggagcaca 600 gcctggggcc cctgctcaac cacctgtggg ttgggcatag ccacccgagt atccaaccag 660 aaccgattct gccaactgga gatccagcgt cgcctgtgtc tgtccagacc ctgcctggca 720 tccaggagcc acggctcatg gaacagtgcc ttctag 756 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCN5(except signal peptide, mouse) <400> 3 Gln Leu Cys Pro Ala Pro Cys Ala Cys Pro Trp Thr Pro Pro Gln Cys 1 5 10 15 Pro Pro Gly Val Pro Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val 20 25 30 Cys Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ser Cys Asp His Leu His Val Cys Asp 35 40 45 Pro Ser Gln Gly Leu Val Cys Gln Pro Gly Ala Gly Pro Ser Gly Arg 50 55 60 Gly Ala Val Cys Leu Phe Glu Glu Asp Asp Gly Ser Cys Glu Val Asn 65 70 75 80 Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Gly Glu 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  11. CCN5 및 anti-VEGF 약물을 유효성분으로 포함하는 습성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 anti-VEGF 약물은 베바시주맙, 라니비주맙 또는 애플리버셉트인 것인, 약학 조성물.
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  13. CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 습성 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 anti-VEGF 약물은 베바시주맙, 라니비주맙 또는 애플리버셉트인 것인, 약학 조성물.
  14. CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCN5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스; 및 anti-VEGF 약물을 유효 성분으로 포함하는 습성 황반변성 예방 또는 치료용 키트로서, 상기 anti-VEGF 약물은 베바시주맙, 라니비주맙 또는 애플리버셉트인 것인, 키트.
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