CN112724196A - 一种放射性核素标记cd206受体靶向肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于放射标记物技术领域，涉及一种放射性核素标记CD206受体靶向肽及其制备方法。所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的结构如式(I)所示，其中M为放射性核素原子。利用本发明的放射性核素标记CD206受体靶向肽及其制备方法，能够高标记率和高放化纯的制备如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽，制备所得放射性核素标记CD206受体靶向肽能够通过放射性核素成像来探测M2‑TAMs，从而可用于肿瘤和转移病灶的准确定位、早期预测肿瘤复发和淋巴结转移等，并能够对肿瘤进行有效的靶向放射性核素治疗。
Description
技术领域
本发明属于放射标记物技术领域，涉及一种放射性核素标记CD206受体靶向肽及其制备方法。
背景技术
M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演重要角色，是肿瘤诊断和治疗的重要靶点。M2-TAMs能促进肿瘤免疫逃逸，诱导肿瘤产生耐药性，还能促进肿瘤转移，诱导化疗后肿瘤复发，而化疗药物还会进一步诱导肿瘤中M2-TAMs的增多，形成恶性循环。因此，M2-TAMs导致某些肿瘤的化疗和免疫治疗效果较差。靶向消除或减少M2-TAMs，能抑制肿瘤的生长和转移，还能增强化疗和免疫治疗的效果。
目前，多项关于消除或减少M2-TAMs的临床试验正在进行。例如靶向CSF1R的抑制剂，通过调控CSF1/CSF1R信号通路，从而减少了M2-TAMs的生成，然而同时也能减少正常组织中的巨噬细胞，因此导致不良副作用的产生。甘露糖受体(CD206)在M2-TAMs表面高表达，是M2-TAMs的高特异性标志物，靶向分子与CD206受体结合，可以将放射性核素特异性靶向传递到肿瘤组织中的M2-TAMs，减少正常组织损伤。
近年来，利用放射性核素标记靶向肿瘤的多肽，实现肿瘤的诊断和治疗的研究报道很多，特别是标记多肽类靶向分子进行放射性核素治疗具有更明显的优势。
多肽CSPGAKVRC能特异性靶向CD206受体，具有高结合亲和力，然而，目前还未发现放射性核素标记多肽CSPGAKVRC的报道。采用在多肽CSPGAKVRC非靶向活性区域偶联双功能耦合剂并标记放射性核素，减少标记条件对其靶向活性的影响，制备出放射性核素标记的CD206受体靶向肽，这有望为肿瘤的诊断和治疗提供一种新方法。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种放射性核素标记CD206受体靶向肽，以能够通过放射性核素成像来探测M2-TAMs，从而可用于肿瘤和转移病灶的准确定位、早期预测肿瘤复发和淋巴结转移等，并能够对肿瘤进行有效的靶向放射性核素治疗。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种放射性核素标记CD206受体靶向肽，所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的结构如下式(I)所示，其中M为放射性核素原子，
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种放射性核素标记CD206受体靶向肽，其中所述的M选自68Ga、67Ga、64Cu、67Cu、177Lu、18F、89Zr、90Y、86Y、111In或225Ac。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种放射性核素标记CD206受体靶向肽，其中所述的M为177Lu。
本发明的第二个目的是提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，以能够高标记率和高放化纯的制备如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽，制备所得放射性核素标记CD206受体靶向肽能够通过放射性核素成像来探测M2-TAMs，从而可用于肿瘤和转移病灶的准确定位、早期预测肿瘤复发和淋巴结转移等，并能够对肿瘤进行有效的靶向放射性核素治疗。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)在多肽CSPGAKVRC的N端半胱氨酸残基上连接双功能螯合剂DOTA，得到DOTA-CSPGAKVRC；
(2)将DOTA-CSPGAKVRC溶液、NaAc溶液、177LuCl3溶液按一定比例混匀后于90-100℃进行反应；
(3)反应结束后用色谱进行分离，得到所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC。
上述制备方法中DOTA-CSPGAKVRC的结构如下式(II)所示，
步骤(2)的反应原理如下：
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其中步骤(1)的连接反应的条件为：在采用固相合成法制备多肽过程中，将多肽-树脂置于反应管中，三倍摩尔过量的DOTA-三(tBu)酯和三倍摩尔过量的苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)均用少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入反应管中，立刻加入8倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，吹N2反应60min，用茚三酮检测试剂检测，结果显无色，说明反应完全。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其中步骤(2)中，配制1M的NaAc溶液，并使用0.04M的HCl溶液调pH值为3.5-4.5，然后加入Chelex-100离子交换树脂除去溶液中的金属离子，树脂加入至少24h后使用，此即为标记缓冲液，采用高纯水配制DOTA-CSPGAKVRC溶液，浓度为1mg/ml～5mg/ml，177LuCl3溶液的浓度为3.7GBq/mL～37GBq/mL。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其中步骤(2)中，177LuCl3溶液与DOTA-CSPGAKVRC溶液的用量比为3.6GBq/μmol-96.5GBq/μmol，NaAc溶液的加入量使得反应总体积在0.2mL-2.0mL。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其中步骤(2)中，反应时间为10-20min，反应pH为3.5-4.5。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其中步骤(3)中，所述的色谱进行分离为用Sep-pak C18柱进行分离。
本发明的有益效果在于，利用本发明的放射性核素标记CD206受体靶向肽及其制备方法，能够高标记率和高放化纯的制备如上所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽，制备所得放射性核素标记CD206受体靶向肽能够通过放射性核素成像来探测M2-TAMs，从而可用于肿瘤和转移病灶的准确定位、早期预测肿瘤复发和淋巴结转移等，并能够对肿瘤进行有效的靶向放射性核素治疗。
本发明首次在新型CD206受体靶向肽CSPGAKVRC的N端半胱氨酸残基上连接一个双功能螯合剂DOTA，得到DOTA-CSPGAKVRC，并进行放射性核素(比如68Ga、67Ga、64Cu、67Cu、177Lu、18F、89Zr、90Y、86Y、111In、225Ac等)的标记。尤其是首次采用177Lu标记DOTA-CSPGAKVRC(177Lu具有优良的核性质，半衰期为6.7天，能发射合适的β射线，可用于肿瘤放射性治疗；还能发射合适的γ射线，可用于SPECT成像)，并建立了标记方法和分离纯化方法，得到标记率和放射化学纯度分别为98.7％±0.6％和99.2％±0.1％。同时，还研究了177Lu-DOTA-CSPGAKVRC在37℃的生理盐水和鼠血清中的稳定性，发现在37℃的生理盐水中孵育72h后，放射化学纯度高达97.8％±0.2％；在37℃的鼠血清中孵育72h后，放射化学纯度仍然能达到84.3％±4.4％。
本发明提供了177Lu-DOTA-CSPGAKVRC制备较完整的数据，分离纯化数据以及其体外稳定性数据，为进一步开展肿瘤的放射性靶向诊断和治疗研究奠定基础。并且，放射性核素标记的多肽靶向分子具有可全身检测、显像准确直观、无创伤和较低的成本等优点。177Lu-DOTA-CSPGAKVRC通过特异性结合CD206受体，能特异性靶向肿瘤和前哨淋巴结中的M2-TAMs，在肿瘤的无创诊断、靶向治疗、早期预测肿瘤淋巴结转移和肿瘤复发等方面具有广阔的研究潜力。
本发明可能为肿瘤的诊断和治疗提供一种新的途径，具有重大的意义，应用前景十分广泛。
附图说明
图1为具体实施方式中177LuCl3的TLC测试图。
图2为具体实施方式中177Lu标记环状多肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的标记混合液的TLC测试图。
图3为具体实施方式中177Lu标记环状多肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC纯化后的TLC测试图。
图4为具体实施方式中177Lu标记环状多肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC在37℃的生理盐水中孵育5min，1h，16h，24h，48h，72h后的放射化学纯度图。
图5为具体实施方式中177Lu标记环状多肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC在37℃的鼠血清中孵育5min，1h，16h，24h，48h，72h后的放射化学纯度图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1：177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的制备
1、DOTA-CSPGAKVRC(DOTA-Cys-Ser-Pro-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Cys，二硫键成环)的制备
采用固相合成法制备DOTA-CSPGAKVRC(CSPGAKVRC首尾二硫键成环)。多肽CSPGAKVRC从C端到N端方向合成，具体方法为：
将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加入二氯甲烷(DCM)(15ml/g)，振荡30min。接第一个氨基酸，抽滤掉溶剂后，加3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH多肽，再加8倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加二甲基甲酰胺(DMF)溶解，吹N2反应60min。除去溶液后加甲醇封闭反应60min。去掉溶剂，加两次20％哌啶的DMF溶液(15ml/g)，依次反应5min和15min，脱掉氨基酸的Fmoc保护基。用茚三酮检测试剂检测，结果显蓝色，即可进行下一步反应。用DMF(10ml/g)洗两次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。加入第二个氨基酸进行缩合反应，三倍过量的Fmoc-Ser(tBu)-OH多肽和三倍过量的HBTU，均用少量的DMF溶解，然后加到反应管中，立刻加8倍过量的DIEA，吹N2反应60min。用茚三酮检测试剂检测显无色，说明反应完全。用DMF(10ml/g)洗两次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。重复操作，依次连接氨基酸Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Arg(Mtr)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH，并脱掉最后一个氨基酸的Fmoc保护基。三倍过量的DOTA-三(tBu)酯(CAS号137076-54-1)和三倍过量的HBTU均用少量DMF溶解，加入反应管中，立刻加8倍过量的DIEA，吹N2反应60min。用茚三酮检测试剂检测显无色，说明反应完全。使用三氟乙酸切割液吹N2反应120min，并脱去氨基酸侧链保护基。采用空气氧化法使首尾二硫键成环，经HPLC纯化，得到DOTA-CSPGAKVRC。
2、由DOTA-CSPGAKVRC制备177Lu-DOTA-CSPGAKVRC
(1)标记缓冲液配制
取1M的NaAc溶液650μl向其中加入0.04M的HCl溶液，调pH值为4.2左右，然后加入Chelex-100离子交换树脂(美国Sigma-Aldrich公司)除去溶液中的金属离子，树脂加入至少24h后使用。
(2)DOTA-CSPGAKVRC溶液配制
取2mg的DOTA-CSPGAKVRC，加入500μl的高纯水，得到4mg/ml的DOTA-CSPGAKVRC溶液。
(3)由DOTA-CSPGAKVRC制备177Lu-DOTA-CSPGAKVRC
取300μl的标记缓冲液(pH4.2左右)于一1.5mL的EP管中，向其中加入5μl的DOTA-CSPGAKVRC溶液(4mg/ml)，然后再向其中加入5μl的177LuCl3溶液(无载体，0.04M的HCl溶液中，放化纯度＞99％，比活度＞3000GBq/mg，2.98mCi，德国ITG公司)，涡旋混匀，体系pH值在4.2左右。然后将样品管置于95℃的孵育器中，反应15min。反应完成后取样，测定标记率。
3、177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的纯化
(1)Sep-pak C18柱预处理
取一支Sep-pak C18柱(Sep-
Light C18柱，德国Waters公司)，首先采用10mL无水乙醇淋洗，将无水乙醇缓慢注射到Sep-pak C18柱中，出液口液体成滴状流出。然后再采用10mL纯水淋洗Sep-pak C18柱，淋洗方式与无水乙醇一致，最后将Sep-pak C18柱中液体排干，待用。
(2)Sep-pak C18柱分离纯化
将反应后的样品溶液小心取出，加入到预处理后的Sep-pak C18柱中。使用3.0ml纯水，用以淋洗Sep-pak C18柱，并排干Sep-pak C18柱中液体，未标记的游离177Lu则被洗脱出来，收集到废液瓶中。最后使用1ml的80％(v/v)的乙醇溶液，用以淋洗Sep-pak C18柱，并排干Sep-pak C18柱中液体，目标样品177Lu-DOTA-CSPGAKVRC则被洗脱出来，收集到1.5mL的EP管中。
实施例2：177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的检测
1、标记率和放射化学纯度检测
采用薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)进行标记率和放射化学纯度(radiochemical purity，RCP)的测定，具体方法如下。
将177LuCl3溶液点样于iTLC-SG纸(美国Agilent公司，下同)上，将其置于展开体系中(10mM DTPA溶液，pH＝6.0)上行展开，展开距离约10cm，然后将其取出，自然晾干，使用Miniscan放射性薄层扫描仪(美国Bioscan公司，下同)进行扫描。结果如图1所示，未标记的游离177Lu会随展开剂移动到前沿。
将反应后的样品溶液点样于iTLC-SG纸上，将其置于展开体系中(10mM DTPA溶液，pH＝6.0)上行展开，展开距离约10cm，然后将其取出，自然晾干，使用Miniscan放射性薄层扫描仪进行扫描，测定标记率。结果如图2所示，177Lu-DOTA-CSPGAKVRC会停留在原点。研究发现，在该标记条件下，177Lu标记多肽DOTA-CSPGAKVRC的标记率高达98.7％±0.6％。金属杂质会影响177Lu对多肽的标记，为了得到高的标记率，在标记过程中一定要小心避免其他金属的污染。
将纯化后的样品溶液点样于iTLC-SG纸上，将其置于展开体系中(10mM DTPA溶液，pH＝6.0)上行展开，展开距离约10cm，然后将其取出，自然晾干，使用Miniscan放射性薄层扫描仪进行扫描，测定放射化学纯度(RCP)。结果如图3所示，表明采用Sep-pak C18柱纯化后，177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的放射化学纯度为99.2％±0.1％。
2、177Lu-DOTA-CSPGAKVRC的体外稳定性检测
将纯化后的177Lu-DOTA-CSPGAKVRC溶液分别与生理盐水和鼠血清以1：9的体积比混合，然后于37℃中孵育，孵育5min、1h、16h、24h、48h、72h后，分别点样于iTLC-SG纸上，再将其置于展开体系中(10mM DTPA溶液，pH＝6.0)上行展开，展开距离约10cm，然后将其取出，自然晾干，使用Miniscan放射性薄层扫描仪进行扫描，测定放射化学纯度(RCP)。
标记物的体外稳定性如图4和图5所示，结果显示，177Lu标记的环状多肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC在37℃的生理盐水中具有很好的稳定性，其与37℃的生理盐水孵育72h后，放射化学纯度高达97.8％±0.2％；177Lu-DOTA-CSPGAKVRC在37℃的鼠血清中的稳定性有所降低，但是其与37℃的鼠血清孵育72h后，放射化学纯度仍然能达到84.3％±4.4％。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种放射性核素标记CD206受体靶向肽，其特征在于：所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的结构如下式(I)所示，其中M为放射性核素原子，
2.根据权利要求1所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽，其特征在于：所述的M选自68Ga、67Ga、64Cu、67Cu、177Lu、18F、89Zr、90Y、86Y、111In或225Ac。
3.根据权利要求1所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽，其特征在于：所述的M为177Lu。
4.一种根据权利要求3所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)在多肽CSPGAKVRC的N端半胱氨酸残基上连接双功能螯合剂DOTA，得到DOTA-CSPGAKVRC；
(2)将DOTA-CSPGAKVRC溶液、NaAc溶液、177LuCl3溶液按一定比例混匀后于90-100℃进行反应；
(3)反应结束后用色谱进行分离，得到所述的放射性核素标记CD206受体靶向肽177Lu-DOTA-CSPGAKVRC。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，反应时间为10-20min，反应pH为3.5-4.5。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的色谱进行分离为用Sep-pak C18柱进行分离。
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