CN110072560A - 用于利用基于锝的化合物标记敏感和热敏性靶向生物分子的方法 - Google Patents

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亚历山德罗·马约基
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Abstract

本发明涉及用于在温和反应条件下将敏感和热敏性靶向分子结合到适于试剂盒制剂的基于[99mTc(N)(PNP)]的化合物中的标记程序。

Description

用于利用基于锝的化合物标记敏感和热敏性靶向生物分子的 方法
发明领域
本发明涉及在温和条件下利用锝标记敏感和热敏性活性生物分子的方法，以及作为用于放射性诊断分子成像的活性成分的任何获得的化合物。
背景
目前，99mTc代表其最佳核性质和低成本容易获得性，在NM中选出的放射性同位素在超过80％的临床实践SPECT中以不同的化学形式使用；它对于世界各地每天进行的据估算70,000个医学成像程序来说是不可或缺的。99mTc的6小时半衰期(t1/2)足够长而允许完成放射性药物学中的任何放射性药物合成、分配到医院、剂量制备、施用和临床有用图像的收集。同时，半衰期足够短以最小化递送至患者的辐射剂量。接近利用商业γ相机成像的最佳值的单色140keV光子(90％丰度)很容易准直，以提供具有高空间分辨率的图像。不存在微粒辐射使得可以在对患者进行低辐射暴露下注射超过30mCi(1.1GBq)的活力。使用由多家制药公司提供的一系列试剂盒，将这些核性质与99Mo/99mTc发生器的容易获得性、同位素的适中成本以及从洗脱的高锝酸钠Na[99mTcO4]开始的放射性药物的合理简单重构进行组合。此外，利用长寿命99gTc同位素(Eβ-＝292keV，t1/2＝2.12×105yr)来系统地研究这种过渡金属的化学性质的可能性提供了阐明注入的放射活性试剂的分子结构并且最终通过对分子的合理修饰来微调这些化合物的生物学特性的优势。
在过去几年中，由于引入了一种用于在无菌和无热原条件下，在示踪剂水平生产含有末端Tc≡N多键的99mTc物质的有效方法，所以扩展了潜在99mTc放射性药物的化学。已发现，所得的[Tc≡N]2+核可以被视为真正的无机官能团，其在宽范围的实验条件下表现出非常高的稳定性。基于这些考虑，已经对[99mTc(N)(L)]型的不同类别的对称和不对称五配位次氨基(nitrido)锝复合物的合成和生物评价进行了广泛研究，其中L是二硫代氨基甲酸根(dithiocarbamate)和[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+，其中PNP是多齿双膦基胺并且YZ是π-供体双齿配体。
在核医学应用中有用的[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+型的次氨基不对称化合物在多篇文献中公开，例如US 6,270,745；US 7,445,765；JP2008037752；US 8,182,789；PD2009A000110；C.Bolzati,M.Cavazza-Ceccato,S.Agostini,F.Refosco,Y.Yamamichi,S.Tokunaga,D.Carta,N.Salavarese,D.Bernardini,G.Bandoli,Bioconjugate Chem.(2010),21,928-939。
特别地，如例如在A.Boschi,C.Bolzati,E.Benini,E.Malagò,L.Uccelli,A.Duatti,A.Piffanelli,F.Refosco,F.Tisato,Bioconj.Chem.(2001),12,1035-1042；C.Bolzati,E.Benini,E.Cazzola,C.M.Jung,F.Tisato,F.Refosco,H.J.Pietzsch,H.Spies,L.Uccelli,A.Duatti,Bioconj.Chem.(2004),15,628-637；A.Boschi,L.Uccelli,A.Duatti,C.Bolzati,F.Refosco,F.Tisato,R.Romagnoli,P.G.Baraldi,K.Varani,P.Borea,Bioconj.Chem.(2003),14,1279-1288中公开的，[Tc(N)(PNP)]-支架作为用于放射性标记生物活性分子和分子载体、用于SPECT成像、提供最终产品的高稳定性和高特异性活性的平台而引起关注。
开发基于Tc的靶标特异性放射性药物的重点在于需要具有有效的标记程序，以使天然分子的生物学性质保持不变。另一个重要的要求是尽可能在温和的反应条件下以高特异性活性获得放射性标记化合物。因此，放射合成必须在无菌、无热原条件下在水溶液中进行，并且应该在30分钟内完成。放射性示踪剂的收率必须≥90％并且溶液稳定性高，因为注射99mTc-物质的混合物会降低器官特异性。最终产物的纯化应该是不必需的。此外，对于基于受体的放射性示踪剂，使用大量“冷的”BFC-BAM缀合物(BFC＝双官能螯合剂，BAM＝生物活性分子)可能导致受体位点饱和和阻断对于放射性示踪剂的受体对接。为了避免这个问题，每个试剂盒制剂中的BFC-BAM缀合物浓度必须非常低(10-6–10-5M)。否则，需要进行标记后纯化以除去过量的未标记受体配体，这是非常耗时的并且不适合临床使用。
然而，锝需要螯合化学用于放射性标记BAM，并且一些络合反应可能非常慢，需要长时间的高温和/或极端pH值，并且因此损害了这样的放射性标记方法的使用。如在所有先前引用的参考文献中描述的，[Tc(N)(PNP)]-标记的靶向分子可以通过将适当的双膦胺和所选的修饰载体同时加入到Tc(N)-中间体的混合物中而有效地制备；通过将反应混合物在80-100℃加热30分钟来实现配体配位。
因此，这种技术不适合用于标记(热)敏感性生物分子如蛋白质、单克隆抗体或其片段，其需要温和的反应条件，例如关于pH值和反应温度。
申请人现已发现一种用于在温和的反应条件下将(热)敏感性靶向分子掺入(适用于试剂盒制剂)到基于[99mTc(N)(PNP)]的化合物中的有效标记方法。
定义
在本说明书中，并且除非另有说明，否则术语“生物活性分子”是指具有在分子水平上与在特定组织中、在疾病状态下表达或过表达的物质相互作用的性能和能力的化合物。仅作为一个实例，术语“生物活性分子”在其含义内包括多肽，蛋白质，适体，抗体或其片段。
Abu代表γ-氨基丁酸。
CysNAc代表N-乙酰基-L-半胱氨酸。
cRGDfK代表环(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Lys)五肽。
HDTCZ代表S-二硫代肼基甲酸甲酯(S-methyl dithiocarbazate)。
ApoMb代表脱辅基肌红蛋白(apomioglobin)。
Biot代表生物素。
Cys代表半胱氨酸。
Gly代表甘氨酸。
Lys代表赖氨酸。
Glu代表谷氨酸。
Ala代表丙氨酸。
Amc代表(氨基甲基)环己基(cycloesyl)。
Fab代表抗原结合片段。
如本文中使用的，PNP是指一般定义的双膦胺。
PNP3OH是在P原子处被–CH2OH基团取代的双膦胺。
PNP43是在P原子处被–CH3基团取代的双膦胺。
PNP3是在P原子处被–(CH2)3OCH3基团取代的双膦胺。
PNP44是在P原子处被–CH2CH3基团取代的双膦胺。
H2PN(OMe)PH2是在P原子处被–H原子取代的双膦胺。
PNP3COOH是在P原子处被–CH2CH2COOH基团取代的双膦胺。
PB代表磷酸钠缓冲液。
PBS代表磷酸盐缓冲盐水。
RCY代表放射化学收率。
RCP代表放射化学纯度。
在本说明书中，RCY和RCP表现出相当的值，因为在HPLC期间没有发生有意义的放射性损失。
温和条件、温和温度和温和PH
温和条件在实施方案与实施方案之间不同。对于一些实施方案，温和条件是指温和温度，而对于一些实施方案，温和条件是指温和pH。而对于一些其他实施方案，温和条件是指温和温度和温和pH。
温度在实施方案与实施方案之间也不同。对于一些实施方案，温和温度代表15℃至60℃的温度范围。对于一些其他实施方案，温和温度代表15℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃并且优选20℃至25℃的温度范围。
室温代表20℃至25℃的温度范围。
温和pH在实施方案与实施方案之间也不同。对于一些实施方案，温和pH代表5.5至9.0的pH范围，而对于一些实施方案，温和pH代表6.0至8.5、6.5至8.0并且优选7至7.5的pH范围。
约中性pH代表7至7.5的pH范围。
附图简述
图1呈现了PNP3OH·HCl和PNP3OH的31P NMR谱图(A)以及PNP3OH·HCl和PNP3OH随时间在H2O(B)、碳酸盐缓冲液0.5M pH 9(C)、磷酸盐缓冲液0.2M、pH 7.4(D)中的氧化稳定性。
图2呈现了ApoMb与Cys-Gly-Lys-Gly肽的转谷氨酰胺酶(TGase)介导的缀合。ApoMb与Cys-Gly-Lys-Gly肽通过转谷氨酰胺酶介导的缀合反应的方案。ApoMb的三维结构构建自马心全肌红蛋白的X-射线结构(PDB文件1YMB)，其中涵盖螺旋F(残基82–97)的链区段以无序构象呈现。该图像利用程序WebLab Viewer Pro 4.0(Molecular SimulationsInc.,San Diego,CA,USA)生成。指出了氨基酸残基Gln91的大致位置。在转谷氨酰胺酶介导反应中，Cys-Gly-Lys-Gly肽的Lys残基偶联至ApoMb的Gln91残基，导致形成产物Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(A)。纯化的Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb衍生物的解卷积ESI质谱用于放射性标记实验。插图中的表格报告了ApoMb衍生物的计算和实测分子量(B)。
图3A呈现了在标记研究中采用的PNP配体的示意图。
图3B呈现了ZY配体(为质子化形式)的示意图。
图4呈现了在室温温育30分钟后收集的所获得的复合物1、复合物2、复合物11和复合物9的放射性测量HPLC谱图。反应混合物的RP-HPLC谱图表明这些复合物作为不同比率的两种顺式(syn)和反式(anti)异构体的混合物以高收率形成。
图5是作为pH的函数的复合物1和复合物2模板的RCY(％)随时间的变化。
图6A呈现了在载体添加条件下产生的模板[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]的HPLC谱图(UV，放射)连同相应的ESI-MS谱图。
图6B呈现了在载体添加条件下产生的模板[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+的HPLC谱图(UV，放射)连同相应的ESI-MS谱图。
图7是作为半胱氨酸衍生物共配体的毫克量的函数的复合物1和复合物2模板的RCY(％)的依赖性。对于每个化合物，还示出了两种异构体的分布。□复合物1a，■复合物1b；■复合物2a，■复合物2b。
图8是作为Cys-cRGDfK肽的毫克量的函数的复合物9的RCY(％)的依赖性连同两种异构体的分布。□复合物9a，■复合物9b。
图9呈现了在37℃在1和24h后评价的，作为抗生物素蛋白浓度的函数的复合物11a,b与抗生物素蛋白的体外结合(A)，以及在37℃在1h后评价的，作为D-生物素/抗生物素蛋白摩尔比的函数的复合物11a,b的饱和曲线(表示为结合放射性标记的生物素的％)(B)。
图10呈现了在αVβ3阳性M21和αVβ3阴性M21L细胞系中，相比于99mTc-HYNIC-RGDfK(报告为HYNIC)的那些，复合物9(报告为PNP3OH)的细胞摄取和内化数据。
图11呈现了在人血清(HS)、大鼠血清(RS)、大鼠肝匀浆(RL)和大鼠肾匀浆(RK)中，在37℃温育2h后的复合物9的HPLC谱图；对照是天然化合物(温育前)。利用反相Vydac218TP C18前置柱(5μm 4,6x 45mm)和Vydac 218TP C18柱(5μm 4.6x 250mm)进行HPLC分析。UV检测器：λ＝215μm；流速为1mL/min。溶剂：A H2O TFA 0.1％；B AcCN THF 0.1％。梯度：0分钟，％B＝5；3-25分钟，％B＝25；28-29分钟，％B＝80；29-32分钟，％B＝80；32-34分钟，％B＝5；34-35分钟，％B＝5。
图12呈现了在4h p.i.复合物9收集的尿液的HPLC谱图。利用反相Vydac 218TPC18前置柱(5μm 4,6x 45mm)和Vydac 218TP C18柱(5μm 4.6x 250mm)进行HPLC分析。UV检测器：λ＝215μm；流速为1mL/min。溶剂：A H2O TFA0.1％；B AcCN THF 0.1％。梯度：0分钟，％B＝5；3-25分钟，％B＝25；28-29分钟，％B＝80；29-32分钟，％B＝80；32-34分钟，％B＝5；34-35分钟，％B＝5。
图13是[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+的HPLC谱图；上图为放射绘图，下图为UV绘图。
图14呈现了99mTc(N)-中间体、[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元、[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+的放射-HPLC比较(A)和[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+、[99mTc(N)(PNP3OH)(ApoMb)]+，比较F的放射-HPLC比较(B)。
图15呈现了在室温温育30分钟收集的[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+的放射-HPLC谱图。利用反相Symmetry300RP-C18前置柱(5μm，4.6x 45mm)和Symmetry300RP-C18柱(5μm 4.6x 250mm)进行HPLC分析。流速：1mL/min。UV检测器：λ＝230nm。溶剂：A＝H2O TFA 0.1％；B＝CH3CN TFA 0.1％。梯度：0分钟，％B＝25；1分钟，％B＝25；17分钟，％B＝32；23分钟，％B＝32；24分钟，％B＝90；28分钟，％B＝90；29分钟，％B＝25；30分钟，％B＝25。反应混合物的RP-HPLC谱图表明这些复合物作为不同比率的两种顺式和反式异构体的混合物以高收率形成。
图16呈现了在30分钟RT(A)和30分钟80℃(B)后的[99mTc(N)(PNP43)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+的放射-HPLC谱图。在对于99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+所报告的相同条件下进行HPLC分析。反应混合物的RP-HPLC谱图表明这些复合物作为不同比率的两种顺式和反式异构体的混合物以高收率形成。
发明概述
本发明的一个方面涉及通式I的可用于放射性药物应用的[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+型的新型锝杂合物：
其中：
Tc是99mTc；
R是氢(-H)或式-(CH2)n-A的基团，其中n是1或2的整数并且A选自由以下组成的组：氢(-H)，羟基(-OH)，甲基(-CH3)，羧基(-COOH)，羧基钠(-COONa)，氨基(-NH2)，氰基(-CN)，磺酰基(-SO3H)和磺酰基钠(-SO3Na)；
R1是式-(CH2)m–R2的基团，其中m是1至6的整数并且R2选自由以下组成的组：烷氧基(-O-Ak)，羟基(-OH)，羧基(-COOH)和氨基(-NH2)；并且
ZY是双齿配体，其通过选自由以下组成的组中的供电子原子组合与Tc配位：[O-,S-]，[S-,S-]，[O-,S]，[O,S-]，[N,S-]，[N-,S]和[N-,S-]，其中如果R是-CH3并且R1是-(CH2)2-OCH3，则ZY不通过[N,S-]与Tc配位。
根据另一个方面，本发明提及适用于蛋白质靶向SPECT成像的放射性药物组合物，所述放射性药物组合物包含在与一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的混合物中的本发明的至少一种化合物。
本发明的另一个方面涉及用于制备通式I的化合物的方法，所述方法包括在温和条件下将靶向分子掺入到基于[99mTc(N)(PNP)]的化合物中而没有损害物质的生物活性。
本发明还涉及适用于制备本发明的化合物的试剂盒。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及通式I的新型锝杂合物：
其中Tc、R、R1和ZY如上所定义。
在一个实施方案中，在上述式(I)中，R选自由以下组成的组：氢(-H)，甲基(-CH3)，羟甲基(-CH2OH)，乙基(-CH2CH3)和羧基乙基(-CH2CH2COOH)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中m是2并且R2是甲氧基(-OCH3)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中n是1并且A是羟基(-OH)。
在一个优选实施方案中，本发明涉及[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+型的根据上述式(I)的水溶性锝杂合物，其中PNP3OH是N,N-二[(双-羟甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺，并且具有式(II)：
在另一个优选实施方案中，本发明涉及[99mTc(N)(PNP44)(YZ)]0/+型的根据上述式(I)的锝杂合物，其中PNP44是N,N-二[(二-乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺，并且具有式(III)：
在另一个优选实施方案中，本发明涉及[99mTc(N)(PNP43)(YZ)]0/+型的根据上述式(I)的锝杂合物，其中PNP43是N,N-二[(二-甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺，并且具有式(IV)：
在另一个优选实施方案中，本发明涉及[99mTc(N)(H2PN(OMe)PH2)(YZ)]0/+型的根据上述式(I)的锝杂合物，其中H2PN(OMe)PH2是N,N-二(膦基乙基)甲氧基乙胺，并且具有式(V)：
在另一个优选实施方案中，本发明涉及[99mTc(N)(PNP3COOH)(YZ)]0/+型的根据上述式(I)的锝杂合物，其中PNP3COOH是N,N-二[(双-羧基乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺，并且具有式(VII)：
在一个另外的实施方案中，优选的是上述式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)中任一个的化合物，其中ZY通过选自由以下组成的组中的供电子原子组合与Tc配位：[O-,S-]，[N,S-]，[S-,S-]和[N-,S]，其中如果R是-CH3并且R1是-(CH2)2-OCH3，则ZY不通过[N,S-]与Tc配位。
优选地，ZY是半胱氨酸、半胱氨酸衍生物或者二硫醇盐(dithiolate)衍生物的双阴离子形式。
更优选地，ZY选自由以下组成的组：CysNAc，CysOEt，CysGly，DT-OEt，DT-OH，Cys，Abu-Cys，Cys-Gly-Lys-Gly和HDTCZ。
以下是式(I)的化合物的优选实例：
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]，复合物1；
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+，复合物2；
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+，复合物3；
[99mTc(N)(PNP43)(CysGly)]+，复合物4；
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)]，复合物5；
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)]，复合物6；
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)]，复合物7；
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)]，复合物8；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys)]0/+；
[99mTc(N)(PNP43)(Cys)]0/+；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Abu-Cys)]；和
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly)]+。
甚至更优选地，ZY连接至生物活性分子或者是生物活性分子的一部分，所述生物活性分子优选是热敏性的。
生物活性分子可以是Cys-cRGDfK、Biot-Abu-Cys或Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys。
以下是式(I)的化合物的优选实例，其中ZY连接至生物活性分子或者是生物活性分子的一部分：
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+，复合物9；
[99mTc(N)(PNP43)(Cys-cRGDfK)]+，复合物10；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)]，复合物11；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+，复合物12；和
[99mTc(N)(PNP43)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+，复合物13。
生物活性分子优选选自由以下组成的组：多肽，蛋白质，抗体和适体，其中抗体优选包含Fab。
在另一个方面，本发明涉及式(I)的化合物的放射性药物组合物，其优选包含一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。
放射性药物组合物可以通过常规肠胃外模式如静脉内施用来施用，并且鉴于患者的年龄和体重、待诊断的疾病状况、使用的成像装置等，其剂量取决于认为可能成像的放射性水平来确定。依据锝(Tecnetium)-99m的放射性，剂量通常为37MBq至1.850MBq，优选为185MBq至740MBq。
在一个另外的方面，本发明涉及通式I的化合物或其放射性药物组合物用于蛋白质靶向SPECT成像的用途。在另一个方面，本发明涉及利用一步反应(方法2)用于制备通式I的化合物的方法，所述方法包括：在温和温度下，使99mTc-高锝酸盐、还原剂、次氨基氮供体和ZY与式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物反应
在优选实施方案中，本发明的化合物可以利用两步反应(方法1)制备，其包括：
a)在温和温度下，将99mTc-高锝酸盐、还原剂和次氨基氮供体混合，以获得反应性99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+；
b)在温和温度和温和pH下，通过同时加入含有ZY和式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物的缓冲液，将99mTc-次氨基前体转化为杂合物。
99mTc-高锝酸盐可以是从99Mo-99mTc发生器新鲜洗脱的Na[99mTcO4]生理盐水溶液。
还原剂选自由以下组成的组：氯化亚锡，亚硫酸氢钠，硼氢化钠，叔膦和三(间磺酸基苯基)膦。
次氨基氮供体选自由以下组成的组：二硫代肼基甲酸，二硫代肼基甲酸衍生物，肼，肼衍生物和酰肼衍生物，优选地丁二酸二酰肼(SDH)。
缓冲液选自由以下组成的组：磷酸盐缓冲液，磷酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲盐水和碳酸钠缓冲液，优选地磷酸钠缓冲液(PB)0.2M pH 7.4或磷酸盐缓冲盐水(PBS)0.01M pH7.4。
对于式(II)的化合物的制备，双膦胺优选作为具有式(VIII)的盐酸盐形式(PNP3OH·HCl)的N,N-二[(三-羟甲基鏻)乙基]甲氧基乙胺提供，以便针对氧化保护PIII，使得该配体相对于相应的PNP3OH可以更方便地纯化并且在有氧条件下也可以长时间储存。
如图1中显示的，收集的数据展现PNP3OH·HCl和PNP3OH二者的高氧化稳定性(数周)。在加入碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液后，观察到鏻盐至PNP3OH的中间转化。
产生本发明的化合物的上述一般程序的一种示例性实施在以下方案中图示：
此外，根据本发明的式(I)的优选化合物的制备的具体实例在以下实验部分中提供，构成对上述方法中采用的操作条件的总体参考。
尽管不愿意受任何特定理论的束缚，但是申请人认为PNP配体的P原子上具有小空间位阻或以亲水基团(如HOCH2-，CH3CH2-，CH3-，H-，COOHCH2CH2-)为特征的基团的连接显著改变[99mTc(N)(PNP)]2+结构单元的物理化学性质，从而提高其对半胱氨酸、半胱氨酸衍生物和基于二硫醇的共配体的反应性，并且使得可以在生理溶液中和在温和反应条件下，在温育后以高收率形成最终的放射性标记的化合物。在这些条件下，(热)敏感性活性生物分子(如肽，多肽，药效基团，蛋白质，适体，抗体)的99mTc-标记是有效的。
如实验部分中所显示的，根据本发明的一些代表性化合物的放射合成已在温和条件下以高收率进行；相反，在相同条件下，仅改变PNP的P原子上连接的基团的比较化合物以低收率形成。
通过使用[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元来标记小分子、中分子或大分子，根据YZ的性质，放射化学收率(RCY)总是高于85％，范围为85％到97％，并且在所有情况下，放射合成在室温下30分钟后完成，通过在室温下将温育时间延长至60分钟，RCY没有显著变化。通过使用[99mTc(N)(PNP43)]2+结构单元来标记小分子和中分子，根据YZ的性质，RCY在70-92％的范围内。在这些情况下，放射合成在室温下30或60分钟后完成。
还通过改变ZY的浓度来研究标记效率。对于复合物1和复合物2(图7)，利用对于复合物1在3-0.05mg范围内并且对于复合物2在3-0.01mg范围内的ZY的量实现了高RCY。对于复合物7(表9)，在DT-OH的宽浓度范围内实现高RCY。值得注意的是，在DT-OH浓度为1.26x10-6M和6.29x 10-7M的情况下观察到非常高的、几乎是最佳的RCY。对于复合物9(图8)，利用在0.2-0.05mg范围内的Cys-cRGDfK的量实现了高RCY。因此，携带适合与生物活性分子偶联的官能团的半胱氨酸和二硫醇盐衍生物共配体都代表了用于将分子载体掺入[99mTc(N)(PNP)]-支架中的最佳螯合系统，并且它们的缺失将阻止根据本发明的化合物的合成(表8)。
如通过式[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+的化合物的HPLC谱图所证实的，放射合成的特征还在于高特异性和选择性(图4，图6A，图6B，图13，图14)，因为不存在由于未结合的99mTc(N)-中间体或[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元而产生的峰。特别地，如图5中所显示的，复合物1和复合物2在pH 7.4的反应溶液中在18小时内是稳定的(仅在pH 9时，观察到逐渐降解)。
此外，在过量(10mM)的交换配体如谷胱甘肽(GSH)或Cys的存在下通过HPLC监测复合物随时间的放射化学纯度(RCP)，已经对一些化合物进行了转螯合(transchelation)研究。考虑到单阳离子物质(复合物2和复合物9)，相对于中性复合物(复合物1和复合物11)，证实了对于Cys转螯合的更高稳定性。温育3和24h后的％RCP对于复合物2为65.93和23.32并且对于复合物9为75.93和27.31。然而，在所有情况下，用Cys 1mM进行的攻击研究显示，复合物的转螯合速率降低，其表明了对于转螯合反应的良好体内稳定性。对于[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+，用过量的Cys、GSH和EDTA(10mM)进行的攻击实验显示，这些试剂不影响放射性标记蛋白的稳定性，并且没有检测到[99mTc(N)(PNP3OH)]2+部分与cys-蛋白质缀合物的非特异性结合位点之间的非特异性结合。
通过将纯化的化合物在人和大鼠血清(复合物1、复合物2、复合物9)中以及在大鼠肝和大鼠肾匀浆(复合物9)中在37℃下温育3小时，已经在体外评估在血液和组织匀浆中一些放射性复合物与血清蛋白的结合和生物转化，以预测和估计体内稳定性和对蛋白水解降解过程的抗性。通常，在15分钟温育后，已发现10-15％的总活性与血浆蛋白相关。随着时间的推移，没有观察到相关放射性-复合物的百分比的变化。对于各种化合物，对血浆蛋白的不同亲和力与其高亲水性特征一致。复合物1、复合物2和复合物9显示出高血清稳定性，其中由内源性肽酶引起的蛋白水解降解可忽略不计。出于举例说明的目的，图11显示了在a)人血清，b)大鼠血清，c)大鼠肾匀浆和d)大鼠肝匀浆中，在37℃下温育2小时后，复合物9的HPLC谱图。发现所有的峰与对照一致，从而表明放射性标记的肽的显著体外稳定性。
已经进行了复合物9和复合物11的结合特性的初步评估，以研究结构单元对生物活性分子、生物素和RGD肽的受体结合亲和力的影响。这些结果(图9和图10)清楚地显示，高亲水性特征和在[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元中的膦供体原子上的羟甲基的存在不影响生物活性分子的结合性能，并且放射性标记的化合物被相应的分子靶标识别。
已经在健康动物中评估了复合物1、复合物2和复合物9的离体生物分布研究，以研究它们的药代动力学特性(器官摄取和排泄途径)和体内稳定性。数据清楚地显示有利的药代动力学特性的特征在于快速血液清除以及在第一个60分钟p.i.内从非靶组织中消除和从尿液的排泄特性(表9和10)。自血液和自其他器官的有效清除反映了主要通过在PNP配体的P原子上存在新的取代基而产生的复合物的高极性和水溶性。对于所有的复合物，在甲状腺中和在胃中发现低的99mTc活性，从而表明没有发生体内分解。对于从体内代谢收集的复合物9，研究清楚地显示靶向分子保持稳定地掺入最终复合物的结构中(图12)。
另外，对于复合物9，已经在携带M21(整联蛋白阳性)和M21L(整联蛋白阴性)黑素瘤的小鼠中评价了体内整联蛋白靶向性质。器官摄取量(表示为每克组织的注射活性的百分比(％IA/g))和在2h p.i.获得的肿瘤与背景比率总结在表12中。复合物9在M21阳性肿瘤中表现出良好的定位(4.38±0.69)：相对于对照(M21L)，活性显著更高。因此，高M21与M21L比率连同高肿瘤与背景比率清楚地显示，复合物9通过αvβ3阳性细胞的摄取是受体介导的，并且放射性标记的肽特异性地定位在表达αvβ3整联蛋白的肿瘤中，而不能在不表达靶标的肿瘤中累积。
这些结构使得本发明的化合物适用于蛋白质靶向SPECT成像。
本发明还涉及适用于制备通式I的化合物的试剂盒，其包括包含还原剂和次氮基氮供体的容器1、包含ZY和式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物的容器2，其中还原剂、次氨基氮供体、ZY和双膦胺化合物如上所定义。
通过使用本发明的方法，将99mTc-高锝酸盐放入容器1中，而将缓冲液放入容器2中以溶解内容物并且将确定量的所得溶液快速放入小瓶1中。将该小瓶摇晃并留置以在温和温度下反应，由此获得锝杂合物。
试剂盒可以备选地包括三个容器，其中容器3包含还原剂和次氨基氮供体，容器4包含ZY，并且容器5包含式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物。
双膦胺配体N,N-二[(双-羧基乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP3COOH)可以按照对于PNP43概述的方案中描绘的多步骤程序制备，其中在最后一步中使用3-溴-丙酸或3-碘-丙酸代替碘甲烷。备选地，最后一步可以按照在Journal of Molecular Catalysis A:Chemical 116(1997)191-198中描述的程序进行。简言之，PNP3COOH可以通过如下方式制备：在VAZO 67，2,2’-偶氮双(异丁腈)存在下将烯丙基羧酸钠盐自由基加成至溶解在甲醇中的H2PN(OMe)PH2并在60℃下将溶液加热48小时。将反应混合物冷却至室温。在烧结玻璃漏斗上收集沉淀物，用甲醇漂洗以除去未反应的烯丙基羧酸钠盐，然后在真空中干燥。
双膦胺配体N,N-二(膦基乙基)甲氧基乙胺(H2PN(OMe)PH2)可以按照对于PNP43概括的方案中描绘的第一和第二步骤制备。
复合物[99mTc(N)(PNP3OH)(DTCZ)]+可以根据两步和一步程序(方法1和2)制备。按照利用在PB中的水醇溶液(hydroalcoholic solution)的方法1，将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.1-0.005mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(1mg，溶解在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和HDTCZ(1-0.01mg，在0.3ml的EtOH中)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH应为7并且体积应为1ml。按照利用在PB中的水醇溶液的方法2，向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速加入PNP3OH·HCl(1mg，在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和HDTCZ(0.1-0.005mg，在0.3ml的EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH应为7并且体积应为1ml。按照利用在PBS中的水醇溶液的方法2，向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.100ml；185MBq)，接着快速加入PNP3OH·HCl(1mg，在1.00ml的PBS 1x中)和HDTCZ(0.1-0.005mg，在0.3ml二EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH应为7并且体积应为1.5ml。
复合物[99mTc(N)(PNP)(DTCZ)]+(PNP＝PNP43，PNP44，PNP3COOH)可以根据两步和一步程序(方法1和2)制备。按照方法1，将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将该小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP(9.96 10-4mmol，溶解在0.1ml的EtOH中)、HDTCZ(0.1-0.005mg，在0.2ml的二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH应为7并且体积应为1ml。按照方法2，向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速加入PNP(PNP43，0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、HDTCZ(1-0.01mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH应为7并且体积应为1ml。
其他[99mTc(N)(PNP)(YZ)]+/0化合物(含有BAM)可以利用在范围10-5-10-6M内的YZ-最终摩尔浓度通过相同或相似方法合成。
本发明的优选化合物和用于其制备的中间体的非限制性实施例在以下部分中报告，旨在在没有限制本发明范围的情况下更详细地举例说明本发明。
实验例
合成PNP
实施例1：合成N,N-二[(双-羟甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP3OH)
通过使用以下合成程序获得PNP3OH：
合成PN(OMe)P。在10ml玻璃瓶中，加入甲氧基乙胺(0.15ml，2.5mmol)、二乙基乙烯基膦酸酯(5mmol)和高氯酸锂(532mg，5mmol)。将小瓶用二氮填充，气密性地盖上盖并完全浸没在油浴中，并且在搅拌下在75℃加热24h。在冷却之后，将小瓶打开并将内容物用氯仿(3x 2ml)处理。将合并的有机相转移到分液漏斗中并用水(2x 6ml)处理。将有机相收集并用Na2SO4(200mg)处理以完全除去残留的水，然后过滤。将溶剂用旋转蒸发仪除去并且将油状残余物在真空(0.1托，40℃)中留置60分钟以除去二乙基乙烯基膦酸酯的任何可能残余物。获得浅黄色油状物。收率87％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝31.24(s)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝4.08,(m,8H,(CH3CH2O)2PO)；3.44,(t,2H,NCH2CH2O)；3.33,(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.82-2.77,(m,4H,P(O)CH2CH2N)；2.64,(t,2HNCH2CH2O)；1.96-1.86,(m,4H,P(O)CH2CH2N)；1.31,(t,12H,CH3CH2OPO)。
合成N,N-二(膦基乙基)甲氧基乙胺(H2PN(OMe)PH2)。使用标准Schlenk技术在惰性气氛(氮气)下进行操作。在双颈圆底烧瓶(100ml)中称量PN(OMe)P(0.533g，1.32mmol)。在氮气下加入无水二乙醚(5ml)。将烧瓶在0℃冷却并通过橡胶隔膜缓慢加入在二乙醚(8ml，8mmol)中的LiAlH4 1M。在添加后，移去浴并将混合物再搅拌30分钟。然后将混合物再次在0℃冷却，并用脱气的Na2SO4饱和溶液(3ml)猝灭。加入另外的无水Na2SO4以完全除去残留的水。无机固体通过过滤分离，用二乙醚(5ml x3)洗涤，并将醚制溶液和洗涤等分试样收集在双颈烧瓶中。在借助于二氮气流和真空除去溶剂后剩余无色液体。收率88％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝–145.49。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝3.45(t,H,NCH2CH2OCH3)；3.34(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.93,2.28(2t,4H,PH2CH2)；2.65(m,6H,PH2CH2CH2NCH2CH2O)；1.64-1.62(m,4H,PH2CH2CH2N)。
合成N,N-二[(三-羟甲基鏻)乙基]甲氧基乙胺盐酸盐(PNP3OH.HCl)。在含有H2PN(OMe)PH2(530mg，1.31mmol)的双颈圆底烧瓶中，加入脱气的EtOH(6ml)，接着加入甲醛37％(0.59ml，7.86mmol)和HCl(3M，1.5ml)。将反应混合物在二氮气氛下在室温搅拌3h。溶液变清澈。将溶剂用旋转蒸发仪完全除去，然后施加高真空，由此得到鏻盐PNP3OH.HCl的白色蜡状物。收率52％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝28.69(s)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝4.70,(s,12H(HOCH2)3P)；3.67,(m,6H(PCH2CH2)2NCH2CH2O)；3.42,(m,2H,NCH2CH2OCH3)；3.30,(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.89,(m,4H PCH2CH2N)。
ESI-MS(m/z)与游离PNP3OH(m/z 316,[M+H]+)一致。
合成N,N-二[(双-羟甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP3OH)。游离PNP3OH通过将PNP3OH.HCl盐溶解在0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)或0.5M碳酸钠缓冲液(pH 9)中获得。
PNP3OH.HCl和PNP3OH在水中是高度可溶的并且在醇中是可溶的。
实施例2：PNP3OH·HCl和PNP3OH的稳定性研究
通过将5mg的配体溶解在：i)1ml的蒸馏水；ii)1ml的碳酸盐缓冲液0.5M，pH 9；iii)1ml的磷酸钠缓冲液0.2，pH 7.4中来制备PNP3OH.HCl的储备水溶液。将这些溶液露天搅拌并且将等分试样在不同时间间隔通过31P NMR进行分析。
PNP3OH.HCl盐和相应的游离PNP3OH的氧化稳定性通过31P{1H}NMR评估(图1)。
实施例3：合成N,N-二[(二-甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP43)
PNP43通过使用以下合成程序获得：
合成PN(OMe)P。在10ml玻璃瓶中，加入甲氧基乙胺(methoxyetilamine)(0.15ml，2.5mmol)、二乙基乙烯基膦酸酯(0.768ml，5mmol)和高氯酸锂(691mg，5mmol)。将小瓶用二氮填充，气密性地盖上盖并完全浸没在油浴中，并且在搅拌下在75℃加热24h。在冷却之后，将小瓶打开并将内容物用氯仿(3x 2ml)处理。将合并的有机相转移到分液漏斗中并用水(2x 6ml)处理。将有机相收集并用Na2SO4(200mg)处理以完全除去残留的水，然后过滤。将溶剂用旋转蒸发仪除去并且将油状残余物在真空(0.1托，40℃)中留置60分钟以除去二乙基乙烯基膦酸酯的任何可能残余物。获得黄色油状物。收率87％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝31.24(s)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝4.08,(m,8H,(CH3CH2O)2PO)；3.44,(t,2H,NCH2CH2O)；3.33,(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.82-2.77,(m,4H,P(O)CH2CH2N)；2.64,(t,2HNCH2CH2O)；1.96-1.86,(m,4H,P(O)CH2CH2N)；1.31,(t,12H,CH3CH2OPO)。
合成N,N-二(膦基乙基)甲氧基乙胺(H2PN(OMe)PH2)。使用标准Schlenk技术在惰性气氛(氮气)下进行操作。在双颈圆底烧瓶(100ml)中称量PN(OMe)P(0.533g，1.32mmol)。加入无水二乙醚(5ml)。将烧瓶在0℃冷却并通过橡胶隔膜缓慢加入在二乙醚(8ml，8mmol)中的LiAlH4 1M。在添加后，移去浴并将混合物再搅拌30分钟。然后将混合物再次在0℃冷却，并用脱气的Na2SO4饱和溶液(3ml)猝灭。加入另外的无水Na2SO4以完全除去残留的水。无机固体通过过滤分离，用二乙醚(5ml x 3)洗涤，并将醚制溶液和洗涤等分试样收集在双颈烧瓶中。在借助于二氮气流和真空除去溶剂后剩余无色液体。收率88％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝–145.49。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝3.45(t,H,NCH2CH2OCH3)；3.34(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.93,2.28(2t,4H,PH2CH2)；2.65(m,6H,PH2CH2CH2NCH2CH2O)；1.64-1.62(m,4H,PH2CH2CH2N)。
合成N,N-二[(二-甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP43)。在双颈圆底烧瓶中，在二氮气氛中，将H2PN(OMe)PH2(530mg，1.31mmol)溶解在无水THF(10ml)。缓慢地加入在己烷中的n-BuLi 2.5M(1.8ml，4.52mmol)。颜色从黄色变为棕色。将烧瓶在-78℃冷却并通过压力平衡漏斗缓慢加入溶解在THF(10ml)中的碘甲烷(1.02ml，4.52mmol)。溶液变清澈，然后将其在搅拌下留置直至浴温达到-20℃。在二氮气流下将澄清的金黄色溶液减少至1/3的体积，在0℃冷却并用脱气的水(5ml)猝灭。将混合物虹吸到双颈分液漏斗中，并用脱气的二乙醚(10ml x 3)萃取。用无水Na2SO4收集有机层。通过过滤分离固体，并在二氮气流和真空下蒸发溶剂。收率79％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝-52.83(s)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝3.51,(t,2H,NCH2CH2OCH3)；3.39(s,3H,NCH2CH2OCH3)2.71(m,6H(PCH2CH2)2N,NCH2CH2O)；1.43(m,4H,PCH2CH2)2N；1.08(s,12H,-P(CH3)4.
ESI-MS:(m/z 252,[M+H]+)。
实施例4：合成N,N-二[(二-乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺(PNP44)
PNP44通过利用以下合成程序获得。原则上，N,N-二(二-乙基膦基乙基)甲氧基乙胺(PNP44)可以按照在对于PNP43概述的方案中描绘的多步程序制备，其中在最后一步中使用溴乙烷(1.02ml，4.52mmol)代替碘甲烷。
因此，在二氮气氛下，将伯膦H2PN(OMe)PH2(160mg，0.822mmol)溶解在无水THF(10ml)中。缓慢加入在己烷中的n-BuLi 2.5M(1.480ml，3.7mmol)。颜色变为黄色，并且在几分钟后，观察到形成黄色悬浮液。将反应混合物在搅拌下在室温保持30分钟。然后，将烧瓶在-78℃冷却，并通过压力平衡漏斗缓慢加入溶解在THF(30ml)中的溴乙烷(0.245ml，3.29mmol)。溶液变清澈，然后将其在搅拌下留置直至浴温达到-20℃。在二氮气流下将澄清的金黄色溶液减少至1/3的体积，在0℃冷却并用脱气的水(5ml)猝灭。将混合物虹吸到双颈分液漏斗中，并用脱气的Et2O(10ml x 3)萃取。合并有机级分并用无水Na2SO4处理。在二氮气氛下通过过滤(G3玻璃料)分离固体，并将滤液收集在双颈100ml烧瓶中。用Et2O(2x10ml)洗涤玻璃料上的固体。合并的醚相在二氮气流下蒸发然后在真空下蒸发，得到最终化合物。收率85％。纯度80％。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝-23.59。
1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝3.54(t,2H,NCH2CH2OCH3)；3.36(s,3H,NCH2CH2OCH3)；2.77,(m,2H,NCH2CH2O；4H,PCH2CH2N)；1.61,(m,4H,PCH2CH2N)；1.43(m,8H,(CH3-CH2-)4P),1.07(m,12H,(CH3-CH2-)4P)。
ESI-MS[(CH3CH2)2PCH2CH2]2NCH2CH2OCH3)],C15H35NOP2,MW＝307.22；m/z 308,[M+H]+。
主要副产物表征为[(CH3CH2)2PCH2CH2]2N+(CH2CH3)(CH2CH2OCH3)],ESI-MS,C17H40NOP2,MW＝336.26；m/z 336,[M]+。
31P{1H}NMR(121.44MHz,CDCl3)：δ(ppm)＝-27.67。
合成双齿配体ZY
实施例5：制备Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb
肽合成。在来自Protein Technologies International(Tucson，AZ，USA)的ModelPS3自动合成仪上，利用芴基-甲氧基羰基化学，通过固相方法合成肽Cys-Gly-Lys-Gly。使用Vydac C18半制备型柱(10x 250mm，10μm)通过RP-HPLC纯化粗制肽。通过以2.0ml/min的流速施加乙腈(AcCN)、0.085％TFA和水，0.1％TFA的0％AcCN的梯度达12分钟和在4分钟内的0至80％AcCN，接着以2.5ml/min的流速在80％AcCN下等度洗涤来进行RP-HPLC分离。通过测量在226nm处的吸光度来监测流出物。在冷冻干燥后，通过ESI-MS分析Cys-Gly-Lys-Gly肽。通过重量测量估算纯化的肽的量。将纯化的肽以50mM的浓度溶解在DMSO中，并以等分试样在-20℃储存。
转谷氨酰胺酶介导的脱辅基肌红蛋白与Cys-Gly-Lys-Gly肽的缀合。将1mg冻干的脱辅基肌红蛋白的等分试样溶解在20μl的0.1％TFA水溶液中，然后用0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0稀释至800μl。在离心后，如通过测量在280nm处的吸光度确定的，上清液中ApoMb的浓度为0.77mg/ml。加入二硫苏糖醇的ApoMb溶液至终浓度为194μM，Cys-Gly-Lys-Gly肽的摩尔比ApoMb/肽为1/30，并且转谷氨酰胺酶的酶/底物(E/S)为1/50(w/w)。将反应混合物在37℃下温育4小时，然后通过用1％TFA水溶液降低pH来停止。使用C18Phenomenex柱(150x4.6mm)，通过RP-HPLC分析反应的等分试样。通过在5分钟内施加乙腈(AcCN)、0.085％TFA和水、0.1％TFA(5至40％AcCN)和在17分钟内施加40至47％的两步梯度进行洗脱。在226nm处监测流出物的吸光度。将从RP-HPLC分析收集的级分冻干并通过ESI-MS分析。为了纯化用Cys-Gly-Lys-Gly肽衍生的ApoMb，半制备型RP-HPLC在相同的HPLC系统上进行，但是使用Vydac C18半制备型柱(10x 250mm，10μm)。施加的梯度与用于分析型HPLC的相同，但是流速为2ml/min。因为由于两个肽分子之间的二硫键形成(Gly-Lys-Gly-Cys-SS-Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)所致，产物的一些级分含有与Cys-Gly-Lys-Gly肽二聚体缀合的ApoMb，所以将这些样品还原并且使用与对于反应混合物相同的条件通过半制备型RP-HPLC纯化。还原通过将ApoMb衍生物(0.5mg/ml)溶解在含有5.9mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)的0.1％TFA水溶液中，接着在37℃温育90分钟进行。通过ESI-MS分析确认纯化的ApoMb衍生物的纯度。
将样品溶解于在AcCN:水(1:1)中的0.1％甲酸中，并以MS阳离子模式进行分析。使用Masslynx软件(Micromass)实现仪器控制、数据采集和处理(图2)。
实施例6：制备Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys
步骤1：将200mg 2-氯三苯甲基氯(2-Chlorotrytil chloride)树脂(加载1.22mmol/g)用10ml的CH2Cl2预溶胀。用3当量的DIPEA(128μl)在2.5h期间将第一个Fmoc保护的AA(Fmoc-L-2Nal-OH)加载到树脂(2当量，0.488mmol，213.5mg)上。在锚固第一个AA之后，将树脂用MeOH/DIPEA3:0.5的溶液封端30分钟。用DMF洗涤树脂，并将裂解溶液加入至反应器(哌啶:DMF 1:4)中并搅拌30分钟。用DMF洗涤树脂，并加入Boc-4-Amc-OH(2当量，125.6mg，0.488mmol)与4当量的DIPEA(170μl)和1.8当量的HBTU(166.6mg，0.439mmol)。在两小时后，用DMF洗涤树脂，并用HFIP/CH2Cl2 1:4的溶液将完全保护的肽从树脂上解离持续5分钟。在真空中蒸发溶剂，并且产物a在未经进一步纯化下用于步骤2。
步骤2：将产物a(110mg，0.244mmol)溶解在CH2Cl2中，并将DIPEA(3当量，128μl)和HBTU(0.9当量，83mg)加入到溶液中。然后将(OtBu)2Glu-脲-Lys(OtBu)(1当量)(如在Weineisen等，EJNMMI Research 2014,4:63中所述合成的)的溶液加入到所述溶液中，并将反应混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂，并且粗产物通过二氧化硅重量色谱纯化。将得到的产物在0℃下溶解在3ml的CH2Cl2中。逐滴加入300μl的TFA，并将反应混合物在0℃下搅拌1小时。将10ml的饱和NaHCO3加入到溶液中，并用CCl3萃取产物。加入Et2O并沉淀产物。蒸发溶剂，得到完全保护的产物b。
步骤3：在圆底烧瓶中，将41.5mg的Boc-Cys(Trt)-OH溶解在CH2Cl2中并将3当量的DIPEA和1当量的HBTU加入到溶液中。然后，将产物b加入到溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将溶液用水洗涤三次，然后蒸发溶剂并重新溶解在TFA/TIS 95:5(4ml)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，并使产物在冷Et2O中沉淀。产物通过制备型HPLC纯化：AtlantisC18OBD 5μm(19X100mm)柱。洗脱剂：(A)在H2O中的0.1％TFA，(B)在CH3CN中的0.1％TFA。梯度分布：在25％的B下持续5.69分钟的等度，在2.85分钟内的25％到37.5％的B的线性梯度，在1.70分钟内的37.5％到100％的线性梯度，在100％B下持续1.8分钟的等度。流速：20ml/min。分离出19.8mg的Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys；总收率：4％。通过分析型HPLC，Atlantis DC18 5μm(4.6X150mm)柱，使用先前的梯度分布和流动相，监测产物的纯度。流速为1毫升/分钟，并且UV检测在230nm处。HPLC纯度99％。qNMR测定：94％ESI-MS(m/z)：计算质量(C36H51N6O10S)：759.90；实验值：759.66。备选地，产物b也可以通过在J.Med.Chem.(2016),59,1761-1775中报道的固相合成来制备。Cys与肽序列的固定氨基官能团的缀合可以通过固相合成进行。应用上述裂解程序可以获得完全去保护的产物。
99mTc-标记研究和表征
小尺寸分子的标记
实施例7：放射合成复合物1、复合物2、复合物3、[99mTc(N)(PNP3OH)(ZY)]0/+(ZY＝CysNAc；CysOEt；CysGly)
在PB中的方法1(两步)。Na[99mTcO4](0.500ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(1mg，溶解在0.200ml的PB 0.2MpH 7.4中)和ZY(0.150-0.005mg，在0.2ml的H2O中)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
在室温温育30分钟时收集的最终复合物的RP-HPLC谱图中的一些显示在图4中。
当反应在80℃进行时，观察到[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+的RCY显著减小(23％)。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.500ml；185MBq)。将小瓶涡旋10秒。快速地同时加入PNP3OH·HCl(1mg，在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)、ZY(0.150-0.005mg，在0.2ml的H2O中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
当反应在80℃进行时，观察到[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+的RCY显著减小(21.23％)。
在PBS中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.300ml；185MBq)。将小瓶涡旋10秒。快速地同时加入PNP3OH·HCl(1mg，在1.00ml的PBS1x中)和ZY(0.150-0.005mg，在0.1ml中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1.5ml。
当反应在80℃进行时，观察到[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+的RCY显著减小(73.85％)。
通过不法方法获得且通过HPLC色谱确定的RCY报告在表1中。
在不同条件下，复合物1和复合物2的(％)RCY随时间(30分钟相比于18h)的变化显示在图5中。在这些制剂中，鏻盐PNP3OH.HCl在自生pH下采用，或通过加入磷酸盐缓冲液0.2M pH 7.4原位转化为相应的游离PNP3OH。备选地，直接使用游离PNP3OH。后者通过在使用之前将PNP3OH.HCl溶解在磷酸盐缓冲液0.2M pH 7.4中或溶解在碳酸盐缓冲液0.5M pH9中获得。
用于MS表征的(99m/99gTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]和[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+的添加载体的制剂
为了确认放射标记化合物的化学同一性，利用长寿命的99gTc和短寿命的99mTc二者来进行添加载体的合成以制备[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+模板。
简言之，将Na[99mTcO4](0.400ml，50.0MBq)加入至含有SDH(15.0mg)、SnCl2(2mg，悬浮在0.100ml的盐水中)和NH4[99gTcO4](0.050mg，在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持30分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH(1mg的PNP3OH.HCl，溶解在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和所选的半胱氨酸衍生物配体(3mg，溶解在0.200ml的水中)，并将反应混合物在室温留置30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7。
通过具有双重检测器的HPLC来分析添加载体的制剂。两种制剂的色谱图展现出两个可叠加的UV和放射性测量峰，将其分离并在完全99mTc-衰变后通过ESI(+)-MS分析。质谱图显示图6A和6B中的预期信号。
[99gTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]异构体a m/z 590([M+H]+，100％)；异构体b m/z590(M+H+，100％)；
[99gTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+异构体a m/z 576(M+，100％)；异构体b m/z 576(M+，100％)。
实施例8：放射合成复合物4[99mTc(N)(PNP43)(CysGly)]+
通过使用如由放射标记效率研究确定的0.010mg的CysGly量，分别根据方法1和2中所述的两步和一步程序来制备复合物。反应在室温下进行。
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.500ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP43(0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、CysGly(0.010mg，在0.1ml的H2O中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.500ml；185MBq)。将小瓶涡旋10秒。快速地加入PNP43(0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、CysGly(0.010mg，在0.1ml的H2O中)和PB(0.200ml，0.2MpH 7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7.2并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表1中。
比较例9：放射合成比较A[99mTc(N)(PNP3)(CysGly)]
用于比较的目的，作为另外的实施例，通过使用[99mTc(N)(PNP3)]-支架来标记小肽CysGly。
通过使用如由放射标记效率研究确定的0.010mg的CysGly量，分别根据方法1和2中所述的两步和一步程序来制备复合物。反应在室温下进行。
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.500ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、CysGly(0.010mg，在0.1ml的H2O中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.500ml；185MBq)。将小瓶涡旋10秒。快速地加入PNP3(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、CysGly(0.010mg，在0.1ml的H2O中)和PB(0.200ml，0.2M pH7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7.2并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表1中。
实施例10：放射合成复合物5[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)]
方法1(两步)，在PB中的水醇溶液。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(1mg，溶解在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和DT-OEt(1.5mg，在0.3ml二EtOH中)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱确定的RCY报告在表2中。
方法2(一步)，在PB中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3OH·HCl(1mg，在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和DT-OEt(1.5-0.0075mg，在0.3ml二EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱确定的RCY报告在表2.
方法2(一步)，在PBS中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.100ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3OH·HCl(1mg，在1.00ml的PBS 1x中)和DT-OEt(0.0075mg，在0.3ml二EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1.5ml。
通过HPLC色谱确定的RCY报告在表2中。
实施例11：放射合成复合物6[99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)]
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP(PNP43，0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OEt(0.0075mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP43(0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OEt(0.0075mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表2中。
比较例12：放射合成比较B[99mTc(N)(PNP3)(DT-OEt)]
用于比较的目的，通过使用0.0075mg的DT-OET量，分别根据方法1和2中所述的两步和一步程序来制备复合物。反应在室温下进行。
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OEt(0.0075mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OEt(0.0075mg，在0.2ml的EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表2中。
实施例13：放射合成复合物7[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)]
方法1(两步)，在PB中的水醇溶液。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(1mg，溶解在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和DT-OH(0.00078mg，在0.3ml二EtOH中)并将反应混合物在室温静置60分钟，并且在30和60分钟进行HPLC分析。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱确定的RCY报告在表3中。
方法2(一步)，在PB中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3OH·HCl(1mg，在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和DT-OH(0.0078-0.000156mg，在0.3ml二EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟并且在30和60分钟进行HPLC分析。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱确定的RCY报告在表3中。
方法2(一步)，在PBS中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.100ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3OH·HCl(1mg，在1.00ml的PBS 1x中)和DT-OH(0.00078mg，在0.3ml二EtOH中)。将反应混合物在室温静置60分钟并且在30和60分钟进行HPLC分析。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7并且体积为1.5ml。通过HPLC色谱确定的RCY报告在表3中。
实施例14：放射合成复合物8[99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)]
方法1(两步)，在PB中的水醇溶液。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP43(0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OH(0.00078mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟(并且在30和60分钟进行HPLC检查)。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表3中。
方法2(一步)，在PB中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP43(0.25mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OH(0.00078mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟(并且在30和60分钟进行HPLC检查)。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表3中。
比较例15：放射合成比较C[99mTc(N)(PNP3)(DT-OH)]
用于比较的目的，通过使用0.00078mg的DT-OH量，分别根据方法1和2中所述的两步和一步程序来制备复合物。反应在室温下进行。
方法1(两步)，在PB中的水醇溶液。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OH(0.00078mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH 7.4)，并将反应混合物在室温静置60分钟(并且在30和60分钟进行HPLC检查)。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表3中。
方法2(一步)，在PB中的水醇溶液。向含有SDH(2.5mg)和SnCl2(0.10mg，悬浮在0.10ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.400ml；185MBq)，接着快速地加入PNP3(1mg，溶解在0.1ml的EtOH中)、DT-OH(0.00078mg，在0.2ml二EtOH中)和PB(0.200ml，0.2M pH7.4)。将反应混合物在室温静置60分钟(并且在30和60分钟进行HPLC检查)。在反应结束时测量的pH为7并且体积为1ml。
通过HPLC色谱在室温确定的RCY报告在表3.
实施例16：DT-OH配体的放射标记效率。
DT-OH的放射标记效率按照在方法2(一步)中报告的标准标记条件来确定。将PNP3OH·HCl的量固定在1mg(2x 10-3M)，同时将DT-OH的量在范围0.78mg(6.29x 10-3M)–0.000078mg(6.29x 10-7M)内逐渐减小。将混合物在室温温育30分钟。最终pH为7并且体积为1ml。RCY通过HPLC确定。数据概括在表9中。
中间尺寸分子的标记
实施例17：放射合成复合物9[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](1.0ml，50.0MBq-2.2GBq)加入至含有SDH(5.0mg)和SnCl2(0.1mg，悬浮在0.1ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[Tc≡N]int 2+的混合物。将PNP3OH·HCl(1.0mg，在0.2ml的PB 0.2M，pH 7.4中)和Cys-cRGDfK(0.050mg，在0.200ml的水中)同时加入至反应小瓶。将反应混合物在室温温育30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.4。
通过HPLC色谱确定的RCY总结在表4中。在室温温育30分钟时最终复合物的HPLC谱图显示在图4中。
实施例18：放射合成复合物10[99mTc(N)(PNP43)(Cys-cRGDfK)]+
方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.95ml，50.0MBq-2.2GBq)加入至含有SDH(5.0mg)和SnCl2(0.1mg，悬浮在0.1ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[Tc≡N]int 2+的混合物。将PNP43(0.25mg/0.5mlγ-环糊精4mg/ml)和Cys-cRGDfK(0.050mg，在0.050ml的水中)同时加入至反应小瓶。将反应混合物在室温温育30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.4。
通过HPLC色谱确定的RCY总结在表4中。
比较例19：放射合成比较D[99mTc(N)(PNP3)(Cys-cRGDfK)]+
方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.95ml，50.0MBq-2.2GBq)加入至含有SDH(5.0mg)和SnCl2(0.1mg，悬浮在0.1ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[Tc≡N]int 2+的混合物。将PNP3(1mg/0.5mlγ-环糊精4mg/ml)和Cys-cRGDfK(0.050mg，在0.050ml的水中)同时加入至反应小瓶。将反应混合物在室温温育30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.4。
通过HPLC色谱确定的RCY总结在表4中。
实施例20：放射合成复合物11[99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)]
方法1(两步)。将Na[99mTcO4](1.0ml，50.0MBq-2.2GBq)加入至含有SDH(5.0mg)和SnCl2(0.1mg，悬浮在0.1ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持30分钟，得到99mTc-次氨基前体[Tc≡N]int 2+的混合物。将PNP3OH.HCl(2.0-0.625mg，在0.2ml的水中)、磷酸钠缓冲液(0.2ml，0.2M，pH 7.4)和Biot-Abu-Cys(0.200mg，在0.2ml的水中)同时加入至反应小瓶。将反应混合物在室温温育30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.4。
通过HPLC色谱确定的RCY总结在表5中。
比较例21：放射合成比较E[99mTc(N)(PNP3)(Biot-Abu-Cys)]。
方法1(两步)。将Na[99mTcO4](1.0ml，50.0MBq-2.2GBq)加入至含有SDH(5.0mg)和SnCl2(0.1mg，悬浮在0.1ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持30分钟，得到99mTc-次氨基前体[Tc≡N]int 2+的混合物。将PNP3(1mg，在0.1ml的EtOH中)、磷酸钠缓冲液(0.2ml，0.2M，pH7.4)和Biot-Abu-Cys(0.200mg，在0.3ml的水中)同时加入至反应小瓶。将反应混合物在室温温育30分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.4。
通过HPLC色谱确定的RCY总结在表5中。
实施例22：作为Cys-配体量的函数的放射标记效率
按照方法1中报告的标准化标记条件来确定所选Cys-配体的放射标记效率。将PNP3OH·HCl的量固定在1mg(3.17 10-3mmol)，同时将Cys-配体的浓度在以下范围内逐渐减小：对于CysNAc，3mg(18,4x 10-3mmol)-5μg(3.06x 10-5mmol)；对于CysOEt.HCl，3mg(20.10x 10-3mmol)-5μg(3.35x 10-5mmol)；对于Biot-Abu-Cys，0.250mg(5.77x 10-4mmol)-50μg(1.15x 10-4mmol)；对于Cys-cRGDfK，0.200mg(2.82x 10-4mmol)-5μg(7.07x 10- 6mmol)。将混合物在室温温育30分钟。RCY通过HPLC确定。
复合物形成的(％)RCY连同每种异构体形式的分布对于共配体的浓度的依赖性显示在图7(对于复合物1和复合物2)中和在图8(对于复合物9)中。
复合物2的定量形成受到通过共配体的酯基团[-(CO)OEt]水解产生的副产物的形成威胁。值得注意的是，对于复合物1和复合物2，发现异构体分布的变化是共配体量的函数。
实施例23：放射合成复合物12[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.500ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(0.5mg，溶解在0.200ml的PB 0.2MpH 7.4中)和Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys(0.043mg/0.043μl DMSO，在0.157ml的H2O中)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
通过HPLC和TLC色谱确定的RCY报告在表7中。
在PB中的方法2(一步)。向含有SDH(5mg)和SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶中加入Na[99mTcO4](0.500ml；185MBq)。将小瓶涡旋10秒。快速地同时加入PNP3OH·HCl(0.5mg，在0.200ml的PB 0.2M pH 7.4中)和Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys(0.043mg/0.043μl DMSO，在0.157ml的H2O中)。将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
通过HPLC色谱确定的RCY报告在表7中。
[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+的添加载体的制剂并用于MS表征。为了确认放射标记化合物的化学同一性，利用长寿命的99gTc和短寿命的99mTc二者进行添加载体的合成以制备[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+化合物。向含有SDH(15mg)、SnCl2(2mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶中加入含有Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)和NH4[99gTcO4](0.100mg/0.100ml)的水溶液。将小瓶在室温保持30分钟，得到99mTc-次氨基前体[99m/99gTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP3OH·HCl(0.5mg，溶解在0.200ml的PB 0.2M pH7.4中)和Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys(0.5mg/0.050μl DMSO，在0.15ml的H2O中)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
纯化。将反应混合物用milliQ水1:9稀释，然后加载到Sep Pak C18筒(用5mL EtOH和5ml水预调节)。筒上的产物用20ml盐水和3ml EtOH 10％洗涤。放射复合物用2ml EtOH/盐水混合物40/60分级洗脱(级分#1：4gtt；级分#2：25-30gtt；级分#3：余下的)；大部分化合物在级分#2中)。在完全99mTc-衰变之后，纯化的产物通过LC-MS(Surveyor Plus结合LCQFleet Thermo-Scientific离子阱质谱仪，其配备有加热电喷雾电离离子源，以正离子模式运行)分析。
ESI-MS[99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+a对于C47H76N8O15P2S2Tc计算的MW＝1186.08实测值(m/z＝593[M+H]2+(丰度100％)；m/z＝1185[M]+(丰度15％)。
ESI-MS[99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+b对于C47H76N8O15P2S2Tc计算的MW＝1186.08实测值(m/z＝593[M+H]2+(丰度30％)；m/z＝1185[M]+(丰度25％)。
实施例24：放射合成复合物13[99mTc(N)(PNP43)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+
在PB中的方法1(两步)。将Na[99mTcO4](0.400ml，185MBq)加入至含有SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mg，悬浮在0.100ml的盐水中)的小瓶。将小瓶在室温保持15分钟，得到99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+的混合物。然后加入PNP43(0.25mg，溶解在0.100ml的EtOH中)、Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys(0.043mg/0.043μl DMSO，在0.157ml的H2O中)和0.2ml的PB(0.2M，pH 7.4)并将反应混合物在室温静置60分钟。在反应结束时测量的反应混合物的pH为7.2并且体积为1ml。
通过HPLC色谱确定的RCY报告在表7中。
当反应在80℃进行时，RCP为82.06±2.65％。
大分子(>15000Da)的标记
实施例25：放射合成[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+
在PB中的方法1(两步)。向40μl(111MBq)的如上制备的[99mTc≡N]mix 2+中间体中，同时加入PNP3OH.HCl(5μg，在5μl的PB 0.2M，pH 7.4中)、PB(45μl，0.2ml，0.2M，pH 7.4)和Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(80μg，在10μl的TFA0.01％中)。将反应混合物在室温温育30分钟。
RCY总结在表6中。通过TLC和HPLC进行表征。
反应混合物的UV-放射HPLC分析显示在图13中。
比较例26：放射合成比较F[99mTc(N)(PNP3)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+
在PB中的方法1(两步)。向40ul(111MBq)的以上制备的[99mTc≡N]mix 2+中间体中，加入PNP3(8μg，在8μl的EtOH中)、PB(42μl，0.2M，pH 7.4)和Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(80μg，在10μl的TFA0.01％中)。将反应混合物在室温温育30分钟。
RCY总结在表6中。
比较例27：放射合成比较G[99mTc(N)(PNP3OH)(ApoMb)]+和比较H[99mTc(N)(PNP3OH)(BSA)]+
方法2(一步)。根据此程序，用于比较的目的，代替Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb，通过使用未修饰的脱辅基肌红蛋白(ApoMb)或人血清白蛋白(HSA)(其不含有适用于或可用于与金属片段配位的Cys残基)进行一系列反应。
RCY总结在表8中。
将[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+的放射色谱与以下的放射-HPLC谱图进行比较：a)99mTc(N)-中间体；b)[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元(图14A)；和c)通过利用天然ApoMb代替Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb进行的测试反应(图14B)。没有检测到由未结合的99mTc(N)-中间体或[99mTc(N)(PNP3OH)]2+结构单元产生的峰，从而确认这些反应的高特异性和选择性。
实施例28：体外稳定性研究
在过量交换配体存在下通过HPLC监测复合物随时间的放射化学纯度(RCP)对一些化合物进行转螯合研究。一式三份地进行实验。
挑战反应。使用过量的谷胱甘肽(GSH)或Cys，在[99mTc(N)(PNP3OH)]-标记的小尺寸化合物(复合物1、复合物2、复合物9和复合物10)上进行挑战实验。将半胱氨酸盐酸盐的储备水溶液(10mM；1mM)的等分试样(50μl)加入至含有PB(250μl，0.2M；pH 7.4)、水(100μl)和所选[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物(100μl)的丙烯试管。将混合物涡旋并且在37℃温育24h。含有等体积的水代替半胱氨酸盐酸盐的对照反应平行地进行研究。在30分钟、1、3和24h，取出反应混合物的等分试样并通过HPLC色谱分析。使用GSH(50μl，10mM)作为挑战配体，应用类似程序。
对于[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+，使用EDTA(50μl，10mM)作为交换配体进行实验。
总体地，发现化合物对于配体交换反应是足够合适的。
实施例29：受体亲和力研究
进行研究以考察[99mTc(N)(PNP)]结构单元对靶向分子、生物素和RGD肽的受体结合亲和力的影响。
在对于复合物11和复合物9二者进行实验之前，通过HPLC分离两种异构体并且在37℃在24h内对其异构体转化进行评估。
通过在37℃温育复合物11，观察到a相对于b没有变化并且反之亦然。相反，对于复合物9检测到可逆的a相对于b和b相对于a的转化。值得注意地，在放射标记的肽的纯化后立即收集的HPLC谱图清楚地证实两种异构体物质的量为大致在90:10比率，表明发生了一种异构体到其他异构体的快速转化。另外，注意到更快速的b相对于a的变化。因此，对于放射标记的肽，将比率70/30的两种异构体形式的混合物直接用于受体亲和力研究。
抗生物素蛋白结合。复合物11的两种单独异构体与抗生物素蛋白的结合特性的初步评价根据之前报道的方法进行评估并且与已经公开的相应的那些进行比较(Bolzati,C.；Caporale,A.；Agostini,S.；Carta,D.；Cavazza-Ceccato,M.；Refosco,F.；Tisato,F.；Schievano,E.；Bandoli,G.Avidin–biotin system:a small library of cysteinebiotinylated derivatives designed for the[99mTc(N)(PNP)]2+metal fragment(抗生物素蛋白–生物素系统：设计用于[99mTc(N)(PNP)]2+金属片段的半胱氨酸生物素化衍生物的小文库)。Nucl.Med.Biol(2006),34,511–522)。
在温育1和24h后评价的，结合的放射标记生物素的百分比连同饱和曲线报告在图9中。
细胞摄取。复合物9的细胞研究在RPMI1640(Gibco Life Technologies)中生长的M21和M21L细胞上进行。αvβ3和αvβ5在细胞系中的表达通过流式细胞仪分析。
在细胞实验之前，对纯化的复合物9在RPMI1640培养基中的稳定性进行评价。发现放射标记的肽是稳定的。将数据与根据文献产生的99mTc-HYNIC-RGDfK标记的化合物的那些进行比较(Decristoforo C,Santos I,Pietzsch HJ,Kuenstler JU,Duatti A,Smith CJ,Rey A,Alberto R,Von Guggenberg E,Haubner R.Comparison of in vitro and in vivoproperties of[99mTc]cRGD peptides labeled using different novel Tc-cores(使用不同新型Tc核标记的[99mTc]cRGD肽的体外和体内特性的比较).Q J Nucl Med MolImaging.(2007),51,33-41)。
因此，向含有990μL的细胞培养基的玻璃试管中加入10μL含有10μCi的复合物9的溶液。将混合物涡旋并且在37℃温育2h。在30分钟、1和2h，取出100μl的反应混合物并通过HPLC色谱进行分析。发现复合物的放射化学纯度(RCP)>90％。
放射标记肽的细胞摄取在人黑素瘤αvβ3阳性M21和阴性M21L细胞系中在37℃在悬浮液中进行评估。进行初步研究以设置实验条件从而避免在摄取实验期间的细胞损害和/或死亡。利用这些结果，在存在或不存在未标记的c(RGDfK)五肽(50μl；1.65mM)下在无菌玻璃管中在37℃将细胞预温育30分钟。之后，将1ml的细胞悬浮液(1x 106个细胞/ml)在间歇搅拌下用10μCi(10μL)的99mTc复合物温育。在90分钟，将这些管涡旋，将细胞转移到Eppendorf微量离心管(1.5ml)中并且通过离心(3000rpm持续5分钟，在10℃)中断温育。将上清液与沉淀分离并且将含有细胞沉淀的底部尖部在室温用盐水乙酸盐缓冲液(CH3COOH0.2M/NaCl 0.5M)处理，以除去膜结合的化合物。在离心(3000rpm持续10分钟，在10℃)后，将上清液与沉淀分离，收集每个级分，放入单独的计数管中并且利用计数器(Cobra II，Packard)测定活性以确定细胞摄取和内化部分二者。
复合物的摄取表示为在106个细胞上的总活性的百分比细胞摄取(％细胞摄取/106个细胞)。
对于三个实验，所有评估都一式三份地进行。
数据总结在图10中。
实施例30：体外评价
血清蛋白结合。利用尺寸排阻色谱法，通过色谱方法评价复合物1、复合物2和复合物9对于血清蛋白的亲和力。
在丙烯试管中，将100μl的纯化复合物(50-100MBq)加入至900μl的人或大鼠血清中；在37℃温育15、60、120和240分钟时，每个样品取出25μl并加载到预旋转(735x g持续2分钟)Sephadex G-50微小柱上。将该柱以735x g离心1分钟。在NaI-闪烁计数器中对收集的洗脱物和柱进行计数。将蛋白质结合的复合物计算为总活性的百分比。
血清和匀浆稳定性。通过使用以下程序在不同时间点监测RCP来评价复合物1、复合物2、复合物9和复合物11的体外稳定性。在丙烯试管中，将50μl的纯化[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物加入至：a)450μl的人血清，b)450μl的大鼠血清，c)450μl的大鼠肝匀浆和d)450μl的大鼠肾匀浆。将所得的混合物在37℃下温育4h。
在15、60、120和240分钟，取出每种溶液的(50μl)，用950μl的PB(0.02M，pH 7.4)稀释，并在HPLC注射前通过OASIS HLB提取筒。将样品加载到筒上，用MeOH(1ml)预调节并用水(1ml)平衡，并用MeOH 5％(3ml)漂洗。用EtOH/盐水60％(1ml)的混合物洗脱活性。收集每个级分并使用计数器(Cobra II，Packard)测量活性以确定洗脱特性。在洗脱级分中收集80％的加载活性。通过HPLC分析此溶液的等分试样(100μl)以评估99mTc(N)-复合物的降解(图11)。
实施例31：体内研究
在啮齿动物模型中的所有动物实验均根据国家动物福利法规指南(theguidelines of the National Regulations for Animal Welfare)进行。该方案经当地动物实验伦理委员会(Ethical Committee for Animal Experiment)批准。将动物在标准条件下在受控气流柜中饲养，其中可自由接近标准食物和自来水。
在注射之前，使用反相C18Sep-Pack筒纯化99mTc复合物以除去过量的未标记配体。在纯化后，用PBS进一步稀释回收的活性，以获得EtOH含量＜0.5％的最终溶液。在体内施用之前对纯化的复合物的RCP和稳定性进行评价，并且持续随后的18小时。
在健康大鼠中的生物分布。对复合物1、复合物2和复合物9进行在健康大鼠中的生物分布，以评价它们的药代动力学特性和消除途径以及它们对体内代谢的抗性。通过肌内注射Zoletil(40mg/kg)和甲苯噻嗪(2mg/kg)的混合物来麻醉重180-200g的雌性Sprague-Dawley大鼠。手术地暴露颈静脉并注射100μl(300–370kBq)含有所选[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物的溶液。在注射后的不同时间通过颈部脱位法使大鼠(n＝3)处死。在死亡后立即用注射器将血液从心脏中取出血液并定量。切除器官，在盐水中漂洗，称重，并在NaI井型计数器中对活性进行计数。
表示为每克的注射剂量的百分比(％ID/g)的结果总结在表9和10中。
尿液中的代谢产物。在2和4h p.i.，直接从膀胱收集尿液并通过HPLC分析(图12)。
在荷瘤小鼠中的分布。在NOD/SCID小鼠中对复合物9进行肿瘤摄取研究以确定该复合物检测在体内内源性表达的αvβ3整联蛋白的有效能力。为了诱导肿瘤异种移植，将M21(αvβ3阳性)和M21L(αvβ3阴性)细胞以5x 106个细胞/小鼠的浓度皮下地注射并使其生长直至易感知3mm的肿瘤。将含有纯化的放射标记肽的溶液(15μCi/200μL)静脉内地注入尾静脉中。将动物(n＝5)在注射后2h通过颈椎脱位法处死。移出肿瘤和其他组织(血液，心脏，肺，肝，肾，胃，肠，肌肉)，称重，并且在NaI井型计数器中对活性计数。结果表示为每克组织的注射活性的百分比(％IA/g)并且计算肿瘤与器官比率。
数据总结在表12中。
在以下表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8中，对从通过方法1和方法2制备的根据本发明的一些代表性化合物在30和60分钟获得的形成的(％)RCY进行了总结，并与对于一些比较化合物测量的相应值进行了比较。
本发明的一些化合物的形成的(％)RCY连同每个异构体形式的分布对于ZY配体的浓度的依赖性显示在图7和图8中。
本发明化合物的形成的(％)RCY连同ZY配体的浓度的依赖性报告在表9中。
在不同pH条件下，复合物1和复合物2的(％)RCY随时间的变化显示在图5中。
式[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+的一些化合物的HPLC谱图显示在图4、图6A、图6B、图13、图14和图15中。
受体亲和力研究总结在图9和图10中，而在健康大鼠和在荷瘤小鼠中的生物分布研究总结在表10、表11、表12中。
放射标记的肽的体外和体内稳定性显示在图11和图12中。
这些结果确认，由本发明的化合物呈现的特定选择使得在室温并且在温和反应条件下以高收率对生物活性分子进行99mTc-标记。

Claims (50)

1.一种式(I)的化合物
其中：
Tc是99mTc；
R是氢(-H)或式-(CH2)n-A的基团，其中n是1或2的整数并且A选自由以下组成的组：氢(-H)，羟基(-OH)，甲基(-CH3)，羧基(-COOH)，羧基钠(-COONa)，氨基(-NH2)，氰基(-CN)，磺酰基(-SO3H)和磺酰基钠(-SO3Na)；
R1是式-(CH2)m–R2的基团，其中m是1至6的整数并且R2选自由以下组成的组：烷氧基(-O-Ak)，羟基(-OH)，羧基(-COOH)和氨基(-NH2)；并且
ZY是双齿配体，其通过选自由以下组成的组中的供电子原子组合与Tc配位：[O-,S-]，[S-,S-]，[O-,S]，[O,S-]，[N,S-]，[N-,S]和[N-,S-]，其中如果R是-CH3并且R1是-(CH2)2-OCH3，则ZY不通过[N,S-]与Tc配位。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R选自由以下组成的组：氢(-H)，甲基(-CH3)，羟甲基(-CH2OH)，乙基(-CH2CH3)和羧基乙基(-CH2CH2COOH)。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中m是2并且R2是甲氧基(-OCH3)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中n是1并且A是羟基(-OH)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，所述化合物具有下式：
6.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，所述化合物具有下式：
7.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，所述化合物具有下式：
8.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，所述化合物具有下式：
9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中ZY通过选自由以下组成的组中的供电子原子组合与Tc配位：[O-,S-]，[N,S-]，[S-,S-]和[N-,S]，其中如果R是-CH3并且R1是-(CH2)2-OCH3，则ZY不通过[N,S-]与Tc配位。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中ZY是半胱氨酸、半胱氨酸衍生物或者二硫醇盐衍生物的双阴离子形式。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中ZY选自由以下组成的组：CysNAc，CysOEt，CysGly，DT-OEt，DT-OH，Cys，Abu-Cys，Cys-Gly-Lys-Gly和HDTCZ。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物，所述化合物选自由以下组成的组：
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]；
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+；
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+；
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)]；
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)]；
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)]；
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)]；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys)]0/+；
[99mTc(N)(PNP43)(Cys)]；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Abu-Cys)]；和
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly)]+。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中ZY连接至生物活性分子或者是生物活性分子的一部分。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中所述生物活性分子是热敏性的。
15.根据权利要求13或14所述的化合物，其中ZY选自由以下组成的组：Cys-cRGDfK，Biot-Abu-Cys和Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的化合物，所述化合物选自由以下组成的组：
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+；
[99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)]；和
[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-脲-Lys-2-萘基-L-Ala-Amc-Cys)]+。
17.根据权利要求13所述的化合物，其中所述生物活性分子选自由以下组成的组：多肽，蛋白质，抗体和适体。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述抗体包含Fab。
19.一种适用于蛋白质靶向SPECT成像的放射性药物组合物，所述放射性药物组合物包含根据权利要求1-18中任一项所述的式(I)的化合物。
20.根据权利要求19所述的放射性药物组合物，所述放射性药物组合物还包含一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。
21.一种用于制备式(I)的化合物的方法，
其中：
Tc是99mTc；
R是氢(-H)或式-(CH2)n-A的基团，其中n是1或2的整数并且A选自由以下组成的组：氢(-H)，羟基(-OH)，甲基(-CH3)，羧基(-COOH)，羧基钠(-COONa)，氨基(-NH2)，氰基(-CN)，磺酰基(-SO3H)和磺酰基钠(-SO3Na)；
R1是式-(CH2)m–R2的基团，其中m是1至6的整数并且R2选自由以下组成的组：烷氧基(-O-Ak)，羟基(-OH)，羧基(-COOH)和氨基(-NH2)；并且
ZY是双齿配体，其通过选自由以下组成的组中的供电子原子组合与Tc配位：[O-,S-]，[S-,S-]，[O-,S]，[O,S-]，[N,S-]，[N-,S]和[N-,S-]，其中如果R是-CH3并且R1是-(CH2)2-OCH3，则ZY不通过[N,S-]与Tc配位，所述方法包括：
在温和温度下，使99mTc-高锝酸盐、还原剂、次氨基氮供体和ZY与式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物反应
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法包括：
a)在温和温度下，将99mTc-高锝酸盐、还原剂和次氨基氮供体混合，以获得反应性99mTc-次氨基前体[99mTc≡N]int 2+；和
b)在温和温度和温和pH下，通过添加含有ZY和式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物的缓冲液将所述99mTc-次氨基前体转化为杂合物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：氯化亚锡，亚硫酸氢钠，硼氢化钠，叔膦和三(间磺酸基苯基)膦。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述次氨基氮供体选自由以下组成的组：二硫代肼基甲酸，二硫代肼基甲酸衍生物，肼，肼衍生物和酰肼衍生物。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述次氨基氮供体是丁二酸二酰肼。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述缓冲液选自由以下组成的组：磷酸盐缓冲液，磷酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲盐水和碳酸钠缓冲液。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述缓冲液是0.2M pH7.4磷酸钠缓冲液或0.01M pH7.4磷酸盐缓冲盐水。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中ZY连接至生物活性分子或者是生物活性分子的一部分。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述生物活性分子选自由以下组成的组：多肽，蛋白质，抗体和适体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体包含Fab。
31.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(双-羟甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
32.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述双膦胺化合物是盐酸盐形式的N,N-二[(三-羟甲基鏻)乙基]甲氧基乙胺。
33.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(二-乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
34.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(二-甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
35.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(双-羧基乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
36.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述温和温度是室温。
37.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述温和pH是约中性pH。
38.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述温和温度是室温并且所述温和pH是约中性pH。
39.一种适用于制备如权利要求1-18中任一项所定义的式(I)的化合物的试剂盒，所述试剂盒是双容器试剂盒或三容器试剂盒，其中所述双容器试剂盒包括容器1和容器2，并且所述三容器试剂盒包括容器3、容器4和容器5；其中所述容器1包含还原剂和次氨基氮供体，所述容器2包含ZY和式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物：
并且
其中所述容器3包含还原剂和次氨基氮供体，所述容器4包含ZY，并且所述容器5包含式(VII)或式(VIII)的双膦胺化合物。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述还原剂选自由以下组成的组：氯化亚锡，亚硫酸氢钠，硼氢化钠，叔膦和三(间磺酸基苯基)膦。
41.根据权利要求39或40所述的试剂盒，其中所述次氨基氮供体选自由以下组成的组：二硫代肼基甲酸，二硫代肼基甲酸衍生物，肼，肼衍生物和酰肼衍生物。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的试剂盒，其中所述次氨基氮供体是丁二酸二酰肼。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的试剂盒，其中ZY连接至生物活性分子或者是生物活性分子的一部分。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述生物活性分子选自由以下组成的组：多肽，蛋白质，抗体和适体。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述抗体包含Fab。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的试剂盒，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(双-羟甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
47.根据权利要求39-45中任一项所述的试剂盒，其中所述双膦胺化合物是盐酸盐形式的N,N-二[(三-羟甲基鏻)乙基]甲氧基乙胺。
48.根据权利要求39-45中任一项所述的试剂盒，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(二-乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
49.根据权利要求39-45中任一项所述的试剂盒，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(二-甲基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
50.根据权利要求39-45中任一项所述的试剂盒，其中所述式(VII)的双膦胺化合物是N,N-二[(双-羧基乙基膦基)乙基]甲氧基乙胺。
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