JP2020504103A - テクネチウム系化合物により高感受性及び感熱性の標的指向性生体分子を標識化する方法 - Google Patents

テクネチウム系化合物により高感受性及び感熱性の標的指向性生体分子を標識化する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、穏やかな反応条件において、高感受性及び感熱性標的指向性分子を、キット製剤に適した[99mTc(N)(PNP)]系化合物に組み込むための標識化手順に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、穏やかな条件下で、テクネチウムにより高感受性及び感熱性活性生体分子を標識化する方法、及び放射線診断分子イメージングのための有効成分として得られる任意の化合物に関する。
現在、99mTcは、その最適な核特性及び低コストで容易な入手可能性のために、臨床診療SPECTの80%超において様々な化学形態で使用されている、NMにおいて選択される放射性同位体となっており、世界中で毎日行われている推定70,000件の医用イメージング手順に不可欠である。99mTcの6時間という半減期時間(t1/2)は十分に長く、ラジオファーマシーでの放射性医薬品合成の完了、病院への配給、用量調製、投与、及び臨床的に有用な画像の収集を可能にする。同時に、この半減期時間は、患者に送達される放射線量を最小にするうえで十分に短い時間である。市販のガンマカメラによるイメージングにとって最適に近い、単色140keV光子(同位体存在比90%)は、容易にコリメートされて高い空間解像度の画像をもたらす。粒子放射線がないため、患者の放射線被曝を小さくしながら、30mCi(1.1GBq)を超える放射能（activities）の注入が可能である。これらの核特性は、99Mo/99mTc発生器の容易な入手可能性、同位体の適度なコスト、及び複数の製薬会社によって提供されている一連のキットによる、溶出された過テクネチウム酸ナトリウム、Na[99mTcO4]から出発する、放射性医薬品の適度に簡単な再構成と組み合わされる。さらに、長寿命99gTc同位体(Eβ-=292keV、t1/2=2.12×105 yr)を利用して、この遷移金属の化学を体系的に研究する可能性により、注入される放射性薬剤の分子構造を解明するうえでの利点が得られ、最終的に、分子の合理的な改変を通じて、これらの化合物の生物学的特性を微調整することができる。
過去数年間に、潜在的な99mTc放射性医薬品の化学的性質は、トレーサーレベルにおいて、末端Tc≡N多重結合を含有する99mTc種を、無菌且つ発熱性物質非含有の状態で製造するための効果的方法の導入により、拡大されてきた。得られた[Tc≡N]2+コアは、広範囲の実験条件下で非常に高い安定を示す真の無機官能基と考えられることが見出された。これらの考察に基づいて、[99mTc(N)(L)](式中、Lはジチオカルバメートである)及び[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+(式中、PNPは多座ビスホスフィノアミンであり、YZはπ-供与体二座配位子である)型の対称及び非対称5配位ニトリドテクネチウム錯体の様々なクラスの合成及び生物学的評価に関する広範な研究が行われてきた。
核医学用途に有用な[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+型のニトリド非対称化合物は、複数の文献、例えば、特許文献１;特許文献２;特許文献３;特許文献４;特許文献５;非特許文献１に開示されている。
特に、例えば、非特許文献２;非特許文献３;非特許文献４に開示されているように、[Tc(N)(PNP)]足場は、SPECTイメージングのための放射性標識生物活性分子及び分子ベクターのプラットフォームとして魅力的であり、最終生成物の高い安定性及び高い比放射能をもたらす。
米国特許第６，２７０，７４５号 米国特許第７，４４５，７６５号 特開２００８−０３７７５２号公報 米国特許第８，１８２，７８９号 イタリア特許公開公報第２００９０１１０号（ITPD20090110）
C. Bolzati、M. Cavazza-Ceccato、S. Agostini、F. Refosco、Y. Yamamichi、S. Tokunaga、D. Carta、N. Salavarese、D. Bernardini、G. Bandoli、Bioconjugate Chem. (2010)、21巻、928〜939頁 A. Boschi、C. Bolzati、E. Benini、E. Malago、L. Uccelli、A. Duatti、A. Piffanelli、F. Refosco、F. Tisato、Bioconj. Chem. (2001)、12巻、1035〜1042頁 C. Bolzati、E. Benini、E. Cazzola、C. M. Jung、F. Tisato、F. Refosco、H. J. Pietzsch、H. Spies、L. Uccelli、A. Duatti、Bioconj. Chem. (2004)、15巻、628〜637頁 A. Boschi、L. Uccelli、A. Duatti、C. Bolzati、F. Refosco、F. Tisato、R. Romagnoli、P. G. Baraldi、K. Varani、P. Borea、Bioconj. Chem. (2003)、14巻、1279〜1288頁
Tc系の標的特異的放射性医薬品の開発における焦点は、天然分子の生物学的特性を不変にしたまま、効率的な標識化手順を得る必要性にある。別の重要な要件は、できれば穏やかな反応条件下で、高い比放射能を有する、放射性標識化合物を得ることである。したがって、放射性合成（radiosynthesis）は、無菌且つ発熱性物質非含有の条件下で水溶液中にて行われなければならず、30分以内に完了されるべきである。99mTc種の混合物の注入は臓器特異性を低下させることがあるため、放射性トレーサーの収率は、高い溶液安定性を伴って≧90%でなければならない。最終生成物の精製は必要ないはずである。さらに、受容体系放射性トレーサーの場合、大量の「非放射性（cold）」BFC-BAMコンジュゲート(BFC =二官能性キレート剤、BAM =生物活性分子)の使用は、放射性トレーサーにおける受容体部位飽和及び受容体結合(receptor docking)の遮断をもたらし得る。この問題を回避するために、各キット製剤中のBFC-BAMコンジュゲート濃度は、非常に低くなければならない(10-6〜10-5 M)。そうでなければ、過剰の未標識化性受容体リガンドを除去するために後標識精製が必要であり、これは非常に多くの時間を要し、臨床使用に適さない。
しかしながら、テクネチウムは、BAMを放射性標識化するためのキレート化化学を必要とし、いくつかの錯体形成反応は極めて低速である場合があり、長時間にわたる高温及び/又は極端なpH値を必要とし、したがって、そのような放射性標識化方法の使用を難しくしている。上記で引用したすべての参考文献に記載されているように、[Tc(N)(PNP)]標識化標的指向性分子は、適切なビスホスフィノアミン及び選択された修飾ベクターをTc(N)中間体の混合物に同時に添加することによって、効率的に調製され得る。配位子配位は、反応混合物を80〜100℃で30分間加熱することによって達成される。
したがって、この技術は、例えば、pH値及び反応温度に関して、穏やかな反応条件を必要とする、タンパク質、モノクローナル抗体又はそれらの断片などの高感受性(感熱性)生体分子の標識化に適さない。
出願人は、キット製剤に適した穏やかな反応条件において、高感受性(感熱性)標的指向性分子を[99mTc(N)(PNP)]系化合物に組み込むための効率的な標識化手順を見出した。
定義
本明細書において、及び特に指示がない限り、「生物活性分子」という用語は、疾患状態において、特定の組織において発現又は過剰発現する種との間で、分子レベルで相互作用する機能及び能力を有する化合物を指す。一例として、「生物活性分子」という用語は、その意味の中に、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体又はそれらの断片を包含する。
Abuはγ-アミノ酪酸を表す。
CysNAcはN-アセチル-L-システインを表す。
cRGDfKはシクロ(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Lys)ペンタペプチドを表す。
HDTCZはS-メチルジチオカルバゼートを表す。
ApoMbはアポミオグロビン(apomioglobin)を表す。
Biotはビオチンを表す。
Cysはシステインを表す。
Glyはグリシンを表す。
Lysはリジンを表す。
Gluはグルタミン酸を表す。
Alaはアラニンを表します。
Amcは(アミノメチル)シクロエシル((aminomehyl)cycloesyl)を表す。
Fabは抗原結合性断片（fragment antigen-binding）を表す。
本明細書で使用するとき、PNPは、一般的に定義されたビスホスフィノアミンを指す。
PNP3OHは、P原子の位置で-CH2OH基により置換されたビスホスフィノアミンである。
PNP43は、P原子の位置で-CH3基により置換されたビスホスフィノアミンである。
PNP3は、P原子の位置で-(CH2)3OCH3基により置換されたビスホスフィノアミンである。
PNP44は、P原子の位置で-CH2CH3基により置換されたビスホスフィノアミンである。
H2PN(OMe)PH2は、P原子の位置で-H原子により置換されたビスホスフィノアミンである。
PNP3COOHは、P原子の位置で-CH2CH2COOH基により置換されたビスホスフィノアミンである。
PBはリン酸ナトリウム緩衝液を表す。
PBSはリン酸緩衝食塩水を表す。
RCYは放射化学収率を表す。
RCPは放射化学純度を表す。
本明細書の記載において、RCY及びRCPは、HPLC中に有意味の放射能損失が生じない場合において同等の値を示す。
穏やかな条件、穏やかな温度及び穏やかなpH
穏やかな条件は実施形態ごとに異なる。いくつかの実施形態において、穏やかな条件とは穏やかな温度を指し、いくつかの実施形態において、穏やかな条件とは穏やかなpHを指す。さらにいくつかの他の実施形態において、穏やかな条件とは穏やかな温度及び穏やかなpHを指す。
穏やかな温度も実施形態ごとに異なる。いくつかの実施形態において、穏やかな温度は、15℃〜60℃の範囲の温度を表す。いくつかの他の実施形態において、穏やかな温度は、15℃〜50℃、20℃〜45℃、20℃〜40℃、20℃〜35℃、20℃〜30℃、好ましくは20℃〜25℃の温度範囲を表す。
室温は、20℃〜25℃の温度範囲を表す。
穏やかなpHも実施形態ごとに異なる。いくつかの実施形態において、穏やかなpHは5.5〜9.0のpH範囲を表し、いくつかの他の実施形態において、穏やかなpHは6.0〜8.5、6.5〜8.0、好ましくは7〜7.5のpH範囲を表す。
ほぼ中性のpHは7〜7.5のpH範囲を表す。
PNP3OH・HCl及びPNP3OHの31P NMRスペクトル(A)、並びにH2O (B)、炭酸塩緩衝液0.5M(pH9)(C)、リン酸緩衝液0.2M(pH7.4)(D)中でのPNP3OH・HCl及びPNP3OHの経時的な酸化安定性を示す図である。 Cys-Gly-Lys-GlyペプチドへのApoMbのTGase媒介コンジュゲーションを示す図である。TGaseによって媒介されるCys-Gly-Lys-GlyペプチドとApoMbのコンジュゲーション反応のスキーム。ApoMbの三次元構造は、ウマ心臓ホロミオグロビンのX線構造(PDBファイル1YMB)から構築され、ヘリックスFを包含する鎖セグメント(残基82〜97)は、無秩序立体配座で表される。画像は、WebLab Viewer Pro 4.0プログラム(Molecular Simulations Inc.、San Diego、CA、USA)を使用して作成されている。アミノ酸残基Gln91の概略位置が示されている。TGase媒介反応において、Cys-Gly-Lys-GlyペプチドのLys残基は、ApoMbのGln91残基に結合して、生成物Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(A)の形成をもたらす。放射性標識化実験に使用した精製Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb誘導体の逆重畳積分ESI質量スペクトル。挿入の表は、ApoMb誘導体(B)の計算及び測定された分子量を報告している。 標識化試験に用いられたPNP配位子の概略図である。 ZY配位子(プロトン化形態)の概略図である。 室温で30分間インキュベートした後に収集された、得られた錯体1、錯体2、錯体11及び錯体9の放射計HPLCプロファイルを示す図である。反応混合物のRP-HPLCプロファイルは、異なる比における2つのsyn及びanti異性体の混合物としての錯体の、高収率での形成を示している。 pHの関数としての、錯体1及び錯体2テンプレートのRCY(%)の経時変化を示すグラフである。 担体添加条件下で生成されたテンプレート[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]のHPLCプロファイル(UV、Radio)を、対応するESI-MSスペクトルと共に示す図である。 担体添加条件下で生成されたテンプレート[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+のHPLCプロファイル(UV、Radio)を、対応するESI-MSスペクトルと共に示す図である。 システイン誘導体共配位子のミリグラム量の関数としての、錯体1及び錯体2テンプレートのRCY(%)の依存性を示すグラフである。各化合物について、2つの異性体の分布も示されている。□（白）錯体1a、■（薄いグレー）錯体1b;■（濃いグレー）錯体2a、■（黒）錯体2b。 Cys-cRGDfKペプチドのミリグラム量の関数としての、2つの異性体の分布と併せた錯体9のRCY(%)の依存性を示すグラフである。□錯体9a、■錯体9b。 37℃で1時間後及び24時間後に評価した、アビジン濃度の関数としての、アビジンへの錯体11a、bのインビトロ結合(A)、及び37℃で1時間後に評価した、D-ビオチン/アビジンのモル比の関数としての、結合放射性標識化ビオチンの%として表された錯体11a、bの飽和曲線(B)を示すグラフである。 αVβ3陽性M21及びαVβ3陰性M21L細胞株における、99mTc-HYNIC-RGDfK(HYNICとして報告)のデータと比較した、錯体9(PNP3OHとして報告)の細胞取り込み及び内部移行データを示すグラフである。 ヒト血清(HS)、ラット血清(RS)、ラット肝臓ホモジネート(RL)及びラット腎臓ホモジネート(RK)における、37℃での2時間のインキュベーション後の錯体9のHPLCプロファイルを示す図である。対照は天然化合物(インキュベーション前)である。逆相Vydac 218TP C18プレカラム(5μm、4.6×45mm)及びVydac 218TP C18カラム(5μm、4.6×250mm)を用いて、HPLC分析を行った。紫外線検出器: λ=215μm; 1mL/分の流速。溶媒: A H2O TFA(0.1%); B AcCN THF(0.1%)。勾配: 0分、%B=5; 3〜25分、%B=25; 28〜29分、%B=80; 29〜32分、%B=80; 32〜34分、%B=5; 34〜35分、%B=5。 注射後4時間の時点での錯体9において採取した尿のHPLCプロファイルを示す図である。逆相Vydac 218TP C18プレカラム(5μm、4.6×45mm)及びVydac 218TP C18カラム(5μm、4.6×250mm)を用いて、HPLC分析を行った。紫外線検出器: λ=215μm; 1mL/分の流速。溶媒: A H2O TFA(0.1%); B AcCN THF(0.1%)。勾配: 0分、%B=5; 3〜25分、%B=25; 28〜29分、%B=80; 29〜32分、%B=80; 32〜34分、%B=5; 34〜35分、%B=5。 [99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+のHPLCプロファイルを示す図である。上は放射線の軌跡、下は紫外線の軌跡である。 99mTc(N)-中間体、[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位、[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+の放射線-HPLC比較(A)、及び[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+、[99mTc(N)(PNP3OH)(ApoMb)]+、比較物Fの放射線-HPLC比較(B)示す図である。 室温での30分間のインキュベーション後に採取した[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+の放射線-HPLCプロファイルを示す図である。逆相Symmetry300 RP-C18プレカラム(5μm、4.6×45mm)及びSymmetry300 RP-C18カラム(5μm、4.6×250mm)を用いて、HPLC分析を行った。流速: 1mL/分。紫外線検出器:λ外線30nm。溶媒:A=H2O TFA(0.1%); B=CH3CN TFA(0.1%)。勾配: 0分、%B=25; 1分、%B=25; 17分、%B=32; 23分、%B=32; 24分、%B=90; 28分、%B=90; 29分、%B=25; 30分、%B=25。反応混合物のRP-HPLCプロファイルは、異なる比における2つのsyn及びanti異性体の混合物としての錯体の、高収率での形成を示している。 室温で30分後(A)及び80℃で30分後(B)の、[99mTc(N)(PNP 43)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+の放射線-HPLCプロファイルを表す。99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+について報告されたものと同じ条件でHPLC分析を行った。反応混合物のRP-HPLCプロファイルは、異なる比における2つのsyn及びanti異性体の混合物としての錯体の、高収率での形成を示している。
本発明の一態様は、放射性医薬品用途に有用である、一般式I:
[式中、
Tcは99mTcであり;
Rは水素(-H)又は式-(CH2)n-A(式中、nは1又は2の整数であり、Aは水素(-H)、ヒドロキシル(-OH)、メチル(-CH3)、カルボキシル(-COOH)、カルボキシルナトリウム(-COONa)、アミノ(-NH2)、シアニド(-CN)、スルホニル(-SO3H)及びスルホニルナトリウム(-SO3Na)からなる群から選択される)の基であり;
R1は式-(CH2)m-R2(式中、mは1〜6の整数であり、R2はアルコキシル(-O-Ak)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)、アミノ(-NH2)からなる群から選択される)の基であり;
ZYは、二座配位子であり、[O-,S-]、[S-,S-]、[O-,S]、[O,S-]、[N,S-]、[N-,S]、及び[N-,S-](式中、ZYは、Rが-CH3でありR1が-(CH2)2-OCH3である場合、[N,S-]を介してTcと配位することはない)からなる群から選択される電子供与原子の組み合わせを介してTcと配位している]
の[99mTc(N)(PNP)(YZ)]0/+型の新規テクネチウムヘテロ錯体（heterocomplexs）に関する。
別の態様によれば、本発明は、1種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤との混合体において本発明の少なくとも1種の化合物を含む、タンパク質標的化SPECTイメージングに適した放射性医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、一般式Iの化合物の調製方法であって、物質の生物活性を損なうことなく、穏やかな条件下で、標的指向性分子を[99mTc(N)(PNP)]系化合物に組み込むことに特徴がある、方法に関する。
本発明はさらに、本発明の化合物の調製に適したキットに関する。
第1の態様において、本発明は、一般式I:
[式中、Tc、R、R1及びZYは前記と同じ意味を表す]
の新規テクネチウムヘテロ錯体に関する。
一実施形態において、上記式(I)中、Rは、水素(-H)、メチル(-CH3)、ヒドロキシメチル(-CH2OH)、エチル(-CH2CH3)、及びカルボキシエチル(-CH2CH2COOH)からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明は、mが2であり、R2がメトキシル(-OCH3)である、式(I)の化合物に関する。
他の実施形態において、本発明は、nが1であり、Aがヒドロキシル(-OH)である、式(I)の化合物に関する。
好ましい一実施形態において、本発明は、式(II):
を有する、[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+(式中、PNP3OHは、N,N-ビス[(ビス-ヒドロキシメチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである)型の、上記式(I)係る水溶性テクネチウムヘテロ錯体に関する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、式(III):
を有する、[99mTc(N)(PNP44)(YZ)]0/+(式中、PNP44は、N,N-ビス[(ジ-エチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである)型の、上記式(I)係るテクネチウムヘテロ錯体に関する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、式(IV):
を有する、[99mTc(N)(PNP43)(YZ)]0/+(式中、PNP43は、N,N-ビス[(ジ-メチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである)型の、上記式(I)係るテクネチウムヘテロ錯体に関する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、式(V):
を有する、[99mTc(N)(H2PN(OMe)PH2)(YZ)]0/+(式中、H2PN(OMe)PH2は、N,N-ビス(ホスフィノエチル)メトキシエチルアミンである)型の、上記式(I)係るテクネチウムヘテロ錯体に関する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、式(VII):
を有する、[99mTc(N)(PNP3COOH)(YZ)]0/+(式中、PNP3COOHは、N,N-ビス[(ビス-カルボキシエチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである)型の、上記式(I)係るテクネチウムヘテロ錯体に関する。
追加の一実施形態において、ZYが[O-,S-]、[N,S-]、[S-,S-]及び[N-,S](式中、ZYは、Rが-CH3でありR1が-(CH2)2-OCH3である場合、[N,S-]を介してTcと配位することはない)からなる群から選択される電子供与原子の組み合わせを介してTcと配位している、上記式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)のいずれか1つの化合物が好ましい。
好ましくは、ZYは、システイン、システイン誘導体、又はジアニオン形態のジチオレート誘導体である。
より好ましくは、ZYは、CysNAc、CysOEt、CysGly、DT-OEt、DT-OH、Cys、Abu-Cys、Cys-Gly-Lys-Gly、及びHDTCZからなる群から選択される。
以下は、式(I)の化合物の好ましい例である。
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]、錯体1;
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+、錯体2;
[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+、錯体3;
[99mTc(N)(PNP43)(CysGly)]+、錯体4;
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)]、錯体5;
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)]、錯体6;
[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)]、錯体7;
[99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)]、錯体8;
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys)]0/+;
[99mTc(N)(PNP43)(Cys)]0/+;
[99mTc(N)(PNP3OH)(Abu-Cys)];及び
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly)]+。
さらにより好ましくは、ZYは、好ましくは感熱性である生物活性分子に連結しているか、又はその一部である。
生物活性分子は、Cys-cRGDfK、Biot-Abu-Cys又はGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cysであり得る。
以下は、ZYが生物活性分子に連結しているか、又はその一部である、式(I)の化合物の好ましい例である。
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+、錯体9;
[99mTc(N)(PNP43)(Cys-cRGDfK)]+、錯体10;
[99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)]、錯体11;
[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+、錯体12; 及び
[99mTc(N)(PNP43)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+、錯体13。
生物活性分子は、好ましくはポリペプチド、タンパク質、抗体、及びアプタマーからなる群から選択され、ここで、抗体は好ましくはFabを含む。
別の態様において、本発明は、好ましくは1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、式(I)の化合物の放射性医薬組成物に関する。
放射性医薬組成物は、静脈内投与などの従来的な非経口方式で投与されてよく、その用量は、患者の年齢及び体重、診断される疾患の状態、使用される撮像装置等を考慮して、イメージングが可能と考えられる放射能レベルに応じて決定される。線量は、テクネチウム-99mの放射能の点から、通常、37MBq〜1,850MBq、好ましくは185MBq〜740MBqである。
さらなる態様において、本発明は、タンパク質標的化SPECTイメージングのための、一般式Iの化合物、又はその放射性医薬組成物の使用に関する。さらなる態様において、本発明は、一般式Iの化合物の調製方法であって、穏やかな温度で、99mTc-過テクネチウム酸塩、還元剤、ニトリド窒素供与体、及びZYを、式(VII)
又は式(VIII)
のビスホスフィノアミン化合物と反応させることを含む一段階反応(方法2)を使用する、方法に関する。
好ましい実施形態において、本発明の化合物は、
a)穏やかな温度で、99mTc-過テクネチウム酸塩、還元剤、及びニトリド窒素供与体を混合して、反応性99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+を得る工程;
b)穏やかな温度及び穏やかなpHで、ZY及び式(VII)又は式(VIII)のビスホスフィノアミン化合物を含有する緩衝溶液を同時に添加することによって、99mTc-ニトリド前駆体をヘテロ錯体に変換する工程
を含む二段階反応(方法1)を使用して調製することができる。
99mTc-過テクネチウム酸塩は、99Mo-99mTc発生器から新しく溶出されたNa[99mTcO4]生理食塩水溶液であってもよい。
還元剤は、塩化第一スズ、亜硫酸水素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、第三級ホスフィン及びトリス(m-スルホナトフェニル)ホスフィンからなる群から選択される。
ニトリド窒素供与体は、ジチオカルバジン酸、ジチオカルバジン酸誘導体、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、及びヒドラジド誘導体からなる群から選択され、好ましくはコハク酸ジヒドラジド(SDH)である。
緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝食塩水、及び炭酸ナトリウム緩衝液からなる群から選択され、好ましくはpH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液(PB)0.2M、又はpH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)0.01Mである。
式(II)の化合物の調製の場合、ビスホスフィノアミンは、好ましくは、式(VIII)を有する、塩酸塩形態のN,N-ビス[(トリス-ヒドロキシメチルホスホニウム)エチル]メトキシエチルアミン(PNP3OH・HCl)として提供され、これにより、PIIIを酸化から保護し、対応するPNP3OHに関して配位子をより便利に精製し、好気条件下でも長期間保存することが可能になる。
図1に示されるように、収集されたデータは、PNP3OH・HCl及びPNP3OHの両方の高い酸化安定性(数週間)を示す。炭酸緩衝液又はリン酸緩衝液の添加後に、ホスホニウム塩からPNP3OHへの即時的変換が観察される。
本発明の化合物をもたらす上記の一般的手順の例証的実施は、以下のスキームに図式化される。
本発明係る式(I)の好ましい化合物の調製の具体例は、以下の実験の節にさらに記載されており、実験の節では、上記の方法で使用されている操作条件を全体的に参照する。
何らかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本出願人は、小さい立体障害を有する基又は親水性基(例えば、HOCH2-、CH3CH2-、CH3-、H-、COOHCH2CH2-)によって特徴付けられる基がPNP配位子のP原子に結合していることにより、[99mTc(N)(PNP)]2+構成単位の物理化学的特性が劇的に変化し、したがって、システイン、システイン誘導体及びジチオール系共配位子に対する反応性が改善され、インキュベーション後、生理的溶液中で及び穏やかな反応条件下で、最終的な放射性標識化合物を高収率で形成することが可能になると考えている。これらの条件では、ペプチド、ポリペプチド、ファーマコフォア基、タンパク質、アプタマー、抗体などの高感受性(感熱性)活性生体分子の99mTc標識化が効果的である。
実験部分に示されるように、本発明係るいくつかの代表的な化合物の放射性合成は、穏やかな条件下で行われ高収率が得られた。これに対して、PNPのP原子に結合した基を変えただけの同条件下で、比較化合物は低収率で形成された。
小分子、中分子又は大分子を標識化するために[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位を使用することによって、放射化学収率(RCY)は、YZの性質の関数として、常に85%より高く、85〜97%の範囲であり、すべての場合において、放射性合成は室温（RT）で30分後に完了し、インキュベーション時間を室温で60分に延長することによるRCYの有意な変動はなかった。小分子及び中分子を標識化するために[99mTc(N)(PNP43)]2+構成単位を使用することによって、RCYは、YZの性質の関数として70〜92%の範囲となった。これらの場合、放射性合成は室温で30分後又は60分後に完了した。
標識化効率はまた、ZYの濃度を変えることによっても調べられた。錯体1及び錯体2(図7)では、錯体1では3〜0.05mg、錯体2では3〜0.01mgの範囲の量のZYにより、高いRCYが達成された。錯体7(表9)については、広範囲の濃度のDT-OHにおいて高いRCYが達成された。1.26×10-6M及び6.29×10-7MのDT-OH濃度で、非常に高く、ほぼ最適なRCYが観察されたことは注目に値する。錯体9(図8)については、0.2〜0.05mgの範囲の量のCys-cRGDfKにより、高いRCYが達成された。したがって、生物活性分子とのカップリングに適した官能基を有するシステイン及びジチオレート誘導体共配位子は、分子ベクターを[99mTc(N)(PNP)]-足場に組み込むための最適なキレート系を表し、それらのシステイン及びジチオレート誘導体共配位子が存在しない場合、本発明係る化合物(表8)の合成が妨げられる。
放射性合成はまた、未結合の99mTc(N)-中間体又は[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位からもたらされるピークの欠如に関して、式[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+の化合物のHPLCプロファイル(図4、図6A、図6B、図13、図14)によって確認されるように、高い特異性及び選択性によっても特徴付けられた。特に、図5に示されるように、錯体1及び錯体2は、pH7.4の反応溶液中で18時間以内に安定した(pH9においてのみ、漸進的な分解が観察された)。
さらに、一部の化合物について、グルタチオン(GSH)又はCysなどの過剰(10mM)の交換リガンドの存在下で、錯体の放射化学純度(RCP)を経時的にHPLCでモニターする、トランスキレーション(transchelation)試験が行われてきた。モノカチオン種(錯体2及び錯体9)を考慮すると、中性錯体(錯体1及び錯体11)と比較して、Cysトランスキレーションに対する、より高い安定性が証明された。3及び24時間のインキュベーション後の%RCPは、錯体2については65.93及び23.32、錯体9については75.93及び27.31であった。それにもかかわらず、すべての場合において、1mMのCysを用いて実施されたチャレンジ試験は、錯体のトランスキレーション速度の低下を示し、トランスキレーション反応に対する良好なインビボ安定性を示唆した。[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+については、過剰のCys、GSH及びEDTA(10mM)を用いたチャレンジ実験は、これらの薬剤が放射性標識化タンパク質の安定性に影響を及ぼさないことを示しており、[99mTc(N)(PNP3OH)]2+部分とcys-タンパク質複合体の非特異的結合部位との間の非特異的結合は検出されなかった。
血液及び組織ホモジネート中でのいくつかの放射性錯体の血清タンパク質への結合及びバイオトランスフォーメーション(biotransformation)が、インビボでの安定性及びタンパク質分解プロセスに対する耐性を予測及び推定するために、精製化合物をヒト及びラット血清(錯体1、錯体2、錯体9)並びにラット肝臓及びラット腎臓ホモジネート(錯体9)中で、37℃にて3時間インキュベートすることによって、インビトロで評価された。一般に、15分のインキュベーション後、総放射能（total activity）の10〜15%が血漿タンパク質に関連していることがわかった。関連する放射性錯体の百分率の経時的な変動は観察されなかった。各種化合物について、血漿タンパク質に対する異なる親和性は、それらの高い親水性の特徴と一致していた。錯体1、錯体2及び錯体9は、高い血清安定性を示し、内因性ペプチダーゼによって引き起こされる、ごくわずかなタンパク質分解を伴っていた。例示を目的として、図11は、a)ヒト血清、b)ラット血清、c)ラット腎臓ホモジネート及びd)ラット肝臓ホモジネートにおける、37℃での2時間のインキュベーション後の錯体9のHPLCプロファイルを示す。すべてのピークは対照と同期して、放射性標識化ペプチドのインビトロ安定性を顕著に示すことがわかった。
生物活性分子、ビオチン及びRGDペプチドの受容体結合親和性に対する構成単位の影響を調べるために、錯体9及び錯体11の結合特性の予備的評価を行った。これらの結果(図9及び図10)は、高い親水性特性及び[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位におけるホスフィン供与体原子上のヒドロキシメチル基の存在は、生物活性分子の結合特性に影響を及ぼさず、放射性標識化合物は対応する分子標的によって認識されることを明らかに示している。
錯体1、錯体2及び錯体9のエクスビボ生体分布試験が、それらの薬物動態プロファイル(器官取り込み及び排泄経路)及びインビボ安定性を調べるために、健康な動物において評価された。データは、注射後最初の60分以内の急速な血中クリアランス及び非標的組織からの排出によって特徴付けられる好ましい薬物動態プロファイル、並びに尿からの排泄特性(表9及び10)を明確に示す。血中及び他の臓器からの効率的なクリアランスは、主にPNP配位子のP原子上の新しい置換基の存在によって生じる、錯体の高い極性及び水溶性を反映したものである。すべての錯体について、甲状腺及び胃において低い99mTc放射能（activity）が見出され、このことはインビボ分解が起こらなかったことを示している。インビボ代謝試験から収集された錯体9については、標的指向性分子が最終錯体の構造に安定的に組み込まれたままであることが明らかに示されている(図12)。
さらに、錯体9について、M21(インテグリン陽性)及びM21L(インテグリン陰性)黒色腫を有するマウスにおける、インビボでのインテグリン標的指向性を評価した。注射後2時間の時点で得られた、組織1グラム当たりの注射放射性物質(injected activity)の百分率(%IA/g)として表わされる器官吸収量、及び腫瘍対バックグラウンド比を、表12に要約する。錯体9は、M21陽性腫瘍において良好な局在化を示し(4.38±0.69)、放射能(activity)は対照(M21L)に対して有意に高かった。したがって、高い腫瘍対バックグラウンド比に伴う高いM21対M21L比は、αvβ3陽性細胞による錯体9の吸収が受容体媒介性であり、放射性標識化ペプチドがαvβ3インテグリンを発現している腫瘍に特異的に局在する一方で、標的を発現しない腫瘍には蓄積しないことを明らかに示した。
これらの結果は、本発明の化合物をタンパク質標的化SPECTイメージングに適したものにしている。
本発明はさらに、還元剤及びニトリド窒素供与体を含む容器1、ZY及び式(VII)又は式(VII)のビスホスフィノアミン化合物を含む容器2を備えた、一般式Iの化合物の調製に適したキットであって、還元剤、ニトリド窒素供与体、ZY及びビスホスフィノアミン化合物は、上記に定義した通りである、キットに関する。
本発明の方法を使用することにより、99mTc-過テクネチウム酸塩を容器1に入れ、緩衝溶液を容器2に入れて内容物を溶解させ、得られた一定量の溶液を迅速にバイアル1に入れる。バイアルを振盪し、穏やかな温度で反応させることにより、テクネチウムヘテロ錯体が得られる。
あるいは、キットは3つの容器を備えていてもよく、ここで、容器3は還元剤及びニトリド窒素供与体を含み、容器4はZYを含み、容器5は式(VII)又は式(VIII)のビスホスフィノアミン化合物を含む。
ビスホスフィノアミン配位子N,N-ビス[(ビス-カルボキシエチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP3COOH)は、PNP43についての概要図に示した多段階手順に従って、最後の工程でヨウ化メチルの代わりに3-ブロモプロピオン酸又は3-ヨード-プロピオン酸を使用して、調製することができる。あるいは、Journal of Molecular Catalysis A:Chemical、116巻(1997)、191〜198頁に記載した手順に従って、最後の工程を実施することができる。要約すると、PNP3COOHは、VAZO 67、2,2'-アゾビス(イソブチロニトリル)の存在下でメタノールに溶解させたH2PN(OMe)PH2にアリルカルボン酸ナトリウム塩をラジカル付加し、その溶液を60℃で48時間加熱することにより、調製することができる。反応混合物を室温まで冷却させる。沈殿物をフリットガラス漏斗上に収集し、メタノールですすいで未反応のアリルカルボン酸ナトリウム塩を除去し、次いで真空中で乾燥させる。
ビスホスフィノアミン配位子N,N-ビス(ホスフィノエチル)メトキシエチルアミン(H2PN(OMe)PH2)は、PNP43について概説したスキームに略述した手順の第1及び第2の工程に従って調製することができる。
錯体[99mTc(N)(PNP3OH)(DTCZ)]+は、二段階及び一段階手順(方法1及び2)に従って調製することができる。PB中の含水アルコール溶液を用いる方法1に従って、Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁された0.1〜0.005mg)を含有するバイアルに添加する。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得る。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)に溶解中にさせた1mg)及びHDTCZ(0.3mlのEtOH中1〜0.01mg)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置する。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であるべきであり、容積は1mlであるべきである。PB中の含水アルコール溶液を用いる方法2に従って、SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中1mg)及びHDTCZ(0.3mlのEtOH中0.1〜0.005mg)を添加する。反応混合物を室温で60分間放置する。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であるべきであり、容積は1mlであるべきである。PBS中の含水アルコール溶液を用いる方法2に従って、SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.100ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(1.00mlのPBS(1x)中1mg)及びHDTCZ(0.3mlのEtOH中0.1〜0.005mg)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置する。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であるべきであり、容積は1.5mlであるべきである。
錯体[99mTc(N)(PNP)(DTCZ)]+(PNP=PNP43、PNP44、PNP3COOH)は、二段階及び一段階手順(方法1及び2)に従って調製することができる。方法1に従って、SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁された0.100mg)を含有するバイアルに、Na [99mTcO4](0.400ml、185MBq)を添加する。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得る。次いで、PNP(0.1mlのEtOHに溶解させた9.96 10-4mmol)、HDTCZ(0.2mlのEtOH中0.1〜0.005mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置する。反応終了時に測定したpHは7であるべきであり、容積は1mlであるべきである。方法2に従って、SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP(PNP43、0.1mlのEtOHに溶解させた0.25mg)、HDTCZ(0.2mlのEtOH中1〜0.01mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置する。反応終了時に測定したpHは7であるべきであり、容積は1mlであるべきである。
BAMを含有する、他の[99mTc(N)(PNP)(YZ)]+/0化合物は、10-5〜10-6Mの範囲のYZ-最終モル濃度により、同一又は類似の方法によって合成することができる。
本発明の好ましい化合物及びそれらを調製するための中間体の非限定的な例が、本発明の範囲を限定することなく本発明をより詳細に説明することを目的とした、以下の節に報告されている。
実験例
PNPの合成
[実施例1]
N,N-ビス[(ビス-ヒドロキシメチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP3OH)の合成
以下の合成手順を用いてPNP3OHを得た。
PN(OMe)Pの合成。10mlガラスバイアル中に、メトキシエチルアミン(0.15ml、2.5mmol)、ジエチルビニルホスホネート(5mmol)及び過塩素酸リチウム(532mg、5mmol)を添加した。バイアルに二窒素を充填し、密封して油浴に完全に浸漬させ、撹拌しながら75℃で24時間加熱した。冷却後、バイアルを開けて内容物をクロロホルムで処理した(3×2ml)。化合した有機相を分液漏斗に移し、水(2×6ml)で処理した。有機相を回収し、Na2SO4(200mg)で処理して残留水を完全に除去し、次いで濾過した。溶媒をRotavaporで除去し、油状残渣を真空(0.1トル、40℃)中に60分間放置して、存在し得るジエチルビニルホスホネートの残留物を除去した。淡黄色の油状物が得られた。収率87%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 31.24 (s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 4.08, (m, 8H, (CH3CH2O)2PO); 3.44, (t, 2H, NCH2CH2O); 3.33, (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.82-2.77, (m, 4H, P(O)CH2CH2N); 2.64, (t, 2H NCH2CH2O); 1.96-1.86, (m, 4H, P(O)CH2CH2N); 1.31, (t, 12H, CH3CH2OPO).
N,N-ビス(ホスフィノエチル)メトキシエチルアミン(H2PN(OMe)PH2)の合成。標準的シュレンク手法を用いて不活性雰囲気(窒素)下で操作を行った。PN(OMe)P(0.533g、1.32mmol)を二口丸底フラスコ(100ml)に量り取った。無水ジエチルエーテル(5ml)を窒素下で添加した。フラスコを0℃で冷却し、ゴム隔壁を通して、ジエチルエーテル(8ml、8mmol)中のLiAlH4(1M)をゆっくり添加した。添加後、浴を取り外し、混合物をさらに30分間撹拌した。次いで、混合物を0℃で再び冷却し、脱気したNa2SO4飽和溶液(3ml)でクエンチした。さらに、無水Na2SO4を添加して残留水を完全に除去した。無機固体を濾過により分離し、ジエチルエーテル(5ml×3)で洗浄し、エーテル溶液及び洗浄アリコートを二口フラスコに収集した。二窒素流及び真空による溶媒除去後に、無色の液体が残った。収率88%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -145.49.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 3.45 (t, H, NCH2CH2OCH3); 3.34 (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.93, 2.28 (2t, 4H, PH2CH2); 2.65 (m, 6H, PH2CH2CH2NCH2CH2O); 1.64-1.62 (m, 4H, PH2CH2CH2N).
N,N-ビス[(トリス-ヒドロキシメチルホスホニウム)エチル]メトキシエチルアミン塩酸塩(PNP3OH・HCl)の合成。H2PN(OMe)PH2(530mg、1.31mmol)を含有する二口丸底フラスコに、脱気したEtOH(6ml)を添加し、続いて、ホルムアルデヒド37%(0.59ml、7.86mmol)及びHCl(3M、1.5ml)を添加した。反応混合物を、二窒素雰囲気下で室温にて3時間撹拌した。溶液が透明になった。溶媒をRotavaporで完全に除去し、次いで、高真空を適用して、ホスホニウム塩の白色ワックスである、PNP3OH・HClを得た。収率52%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 28.69 (s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 4.70, (s, 12H (HOCH2)3P); 3.67, (m, 6H (PCH2CH2)2NCH2CH2O); 3.42, (m, 2H, NCH2CH2OCH3); 3.30, (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.89, (m, 4H PCH2CH2N).
ESI-MS(m/z)は遊離PNP3OH(m/z 316、[M+H]+)と一致している。
N,N-ビス[(ビス-ヒドロキシメチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP3OH)の合成。PNP3OH・HCl塩を0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)又は0.5M炭酸緩衝液(pH9)に溶解させることによって、遊離PNP3OHを得た。
PNP3OH・HCl及びPNP3OHは、水に非常に溶解しやすく、アルコールに溶解しやすい。
[実施例2]
PNP3OH・HCl及びPNP3OHの安定性試験
i) 1mlの蒸留水; ii) 1mlの炭酸塩緩衝液(0.5M、pH9); iii) 1mlリン酸ナトリウム緩衝液(0.2、pH 7.4)に、5mgの配位子を溶解させることによって、PNP3OH・HClの水性原液を調製した。これらの溶液を開放空気中で撹拌し、アリコートを様々な時間間隔で31P NMRにより分析した。
PNP3OH・HCl塩及び対応する遊離PNP3OHの酸化安定性を、31P{1H} NMRによって評価した(図1)。
[実施例3]
N,N-ビス[(ジ-メチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP43)の合成
以下の合成手順を用いてPNP43を得た。
PN(OMe)Pの合成。10mlガラスバイアルに、メトキシエチルアミン(0.15ml、2.5mmol)、ジエチルビニルホスホネート(0.768ml、5mmol)及び過塩素酸リチウム(691mg、5mmol)を添加した。バイアルに二窒素を充填し、密封して油浴に完全に浸漬させ、撹拌しながら75℃で24時間加熱した。冷却後、バイアルを開けて内容物をクロロホルムで処理した(3×2ml)。化合した有機相を分液漏斗に移し、水(2×6ml)で処理した。有機相を回収し、Na2SO4(200mg)で処理して残留水を完全に除去し、次いで濾過した。溶媒をRotavaporで除去し、油状残渣を真空(0.1トル、40℃)中に60分間放置して、存在し得るジエチルビニルホスホネートの残留物を除去した。黄色の油状物が得られた。収率87%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 31.24 (s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 4.08, (m, 8H, (CH3CH2O)2PO); 3.44, (t, 2H, NCH2CH2O); 3.33, (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.82-2.77, (m, 4H, P(O)CH2CH2N); 2.64, (t, 2H NCH2CH2O); 1.96-1.86, (m, 4H, P(O)CH2CH2N); 1.31, (t, 12H, CH3CH2OPO).
N,N-ビス(ホスフィノエチル)メトキシエチルアミン(H2PN(OMe)PH2)の合成。標準的シュレンク手法を用いて不活性雰囲気(窒素)下で操作を行った。PN(OMe)P(0.533g、1.32mmol)を二口丸底フラスコ(100ml)に量り取った。無水ジエチルエーテル(5ml)を添加した。フラスコを0℃で冷却し、ゴム隔壁を通して、ジエチルエーテル(8ml、8mmol)中のLiAlH4(1M)をゆっくり添加した。添加後、浴を取り外し、混合物をさらに30分間撹拌した。次いで、混合物を0℃で再び冷却し、脱気したNa2SO4飽和溶液(3ml)でクエンチした。さらに、無水Na2SO4を添加して残留水を完全に除去した。無機固体を濾過により分離し、ジエチルエーテル(5ml×3)で洗浄し、エーテル溶液及び洗浄アリコートを二口フラスコに収集した。二窒素流及び真空による溶媒除去後に、無色の液体が残った。収率88%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -145.49.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 3.45 (t, H, NCH2CH2OCH3); 3.34 (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.93, 2.28 (2t, 4H, PH2CH2); 2.65 (m, 6H, PH2CH2CH2NCH2CH2O); 1.64-1.62 (m, 4H, PH2CH2CH2N).
N,N-ビス[(ジ-メチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP43)の合成。二口丸底フラスコ内で、二窒素雰囲気下にて、H2PN(OMe)PH2(530mg、1.31mmol)を乾燥THF(10ml)に溶解させた。ヘキサン(1.8ml、4.52mmol)中のn-BuLi(2.5M)をゆっくり添加した。色が黄色から茶色に変化した。フラスコを-78℃で冷却し、均圧化ロートを介して、THF(10ml)に溶解させたヨウ化メチル(1.02ml、4.52mmol)をゆっくり添加した。溶液が透明になり、次いで、浴の温度が-20℃に達するまで、溶液を撹拌しながら放置した。透明な黄金色の溶液を二窒素流下で体積の1/3に減らし、0℃で冷却し、脱気水(5ml)でクエンチした。混合物を二口分液漏斗(double neck separator funnel)で吸い上げ、脱気したジエチルエーテル(10ml×3)で抽出した。有機層を無水Na2SO4で収集した。固体を濾過により分離し、溶媒を二窒素流下及び真空下で蒸発させた。収率79%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = - 52.83 (s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 3.51, (t, 2H, NCH2CH2OCH3); 3.39 (s, 3H, NCH2CH2OCH3) 2.71 (m, 6H (PCH2CH2)2N, NCH2CH2O); 1.43 (m, 4H, PCH2CH2)2N; 1.08 (s, 12H, -P(CH3)4.
ESI-MS: (m/z 252, [M + H]+).
[実施例4]
N,N-ビス[(ジ-エチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミン(PNP44)の合成
以下の合成手順を用いてPNP44を得た。原則として、N,N-ビス(ジ-エチルホスフィノエチル)メトキシエチルアミン(PNP44)は、最終段階においてヨウ化メチルの代わりに臭化エチル(1.02ml、4.52mmol)を使用して、PNP43について概説したスキームに略述した多段階手順に従って、調製することができる。
したがって、第一級ホスフィンH2PN(OMe)PH2(160mg、0.822mmol)を、二窒素雰囲気下で乾燥THF(10ml)に溶解させた。ヘキサン(1.480ml、3.7mmol)中のn-BuLi(2.5M)をゆっくり添加した。色が黄色に変わり、数分後、黄色の懸濁液の形成が観察された。反応混合物を30分間撹拌しながら室温で維持した。次いで、フラスコを-78℃で冷却し、均圧下ロートを介して、THF(30ml)に溶解させた臭化エチル(0.245ml、3.29mmol)をゆっくり添加した。溶液が透明になり、次いで、浴の温度が-20℃に達するまで、溶液を撹拌しながら放置した。透明な黄金色の溶液を二窒素流下で体積の1/3に減らし、0℃で冷却し、脱気水(5ml)でクエンチした。混合物を二口分液漏斗で吸い上げ、脱気したEt2O(10ml×3)で抽出した。有機画分を混ぜ合わせ、無水Na2SO4で処理した。固体を二窒素雰囲気下で濾過(G3フリット)によって分離し、濾液を100ml二口フラスコに収集した。フリット上の固体をEt2O(2×10ml)で洗浄した。混ぜ合わせたエーテル相を二窒素流下で蒸発させ、次いで真空下で蒸発させて、最終化合物を得た。収率85%。純度80%。
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -23.59.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 3.54 (t, 2H, NCH2CH2OCH3); 3.36 (s, 3H, NCH2CH2OCH3); 2.77, (m, 2H, NCH2CH2O; 4H, PCH2CH2N); 1.61, (m, 4H, PCH2CH2N); 1.43 (m, 8H, (CH3-CH2-)4P), 1.07 (m, 12H, (CH3-CH2-)4P).
ESI-MS [(CH3CH2)2PCH2CH2]2NCH2CH2OCH3)], C15H35NOP2, MW= 307.22; m/z 308, [M + H]+.
主要な副生成物を下記のように特徴付けた。
[(CH3CH2)2PCH2CH2]2N+(CH2CH3)(CH2CH2OCH3)], ESI-MS, C17H40NOP2, MW= 336.26; m/z 336, [M]+.
31P{1H} NMR (121.44 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -27.67.
二座配位子ZYの合成
[実施例5]
Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMbの調製
ペプチド合成。Protein Technologies International(Tucson、AZ、USA)製Model PS3自動合成機で、フルオレニル-メチルオキシカルボニル化学を使用した固相法により、ペプチドCys-Gly-Lys-Glyを合成した。Vydac C18半分取用カラム(10×250mm、10μm)を使用するRP-HPLCによって、粗ペプチドを精製した。2.0ml/分の流速にて、0.1%のTFAに対して12分間0%のAcCN及び4分間0%から80%のAcCNという、アセトニトリル(AcCN)、0.085%TFA及び水の勾配を適用することによって、RP-HPLC分離を行い、続いて、2.5ml/分の流速にて80%AcCNで無勾配洗浄を行った。226nmで吸光度を測定することによって、流出液をモニターした。凍結乾燥後、Cys-Gly-Lys-GlyペプチドをESI-MSによって分析した。精製ペプチドの量を重量測定により推定した。精製ペプチドを50mMの濃度でDMSO中に溶解させ、-20℃でアリコートに保存した。
Cys-Gly-Lys-GlyペプチドへのアポミオグロビンのTGase媒介コンジュゲーション。1mgの凍結乾燥アポミオグロビンのアリコートを20μlの0.1%TFA水溶液に溶解させ、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)により800μlに希釈した。遠心分離後、上清溶液中のApoMbの濃度は、280nmでの吸光度の測定によって決定された通り、0.77mg/mlであった。ジチオトレイトールのApoMb溶液を、最終濃度194μMのCys-Gly-Lys-GlyペプチドにApoMb/ペプチドのモル比1/30で添加し、最終濃度194μMのTGaseに酵素/基質(E/S)の比1/50(重量/重量)で添加した。反応混合物を37℃で4時間インキュベートし、次いで、1%TFAの水溶液でpHを下げることによって停止させた。C18 Phenomenexカラム(150×4.6mm)を使用するRP-HPLCによって、反応物のアリコートを分析した。0.1%TFAに対して5分間5%から40%のAcCN及び17分間40%から47%のAcCNという、アセトニトリル(AcCN)、0.085%TFA及び水の二段階勾配を適用することによって、溶出を行った。226nmで流出液の吸光度をモニターした。RP-HPLC分析から収集した画分を凍結乾燥し、ESI-MSにより分析した。Cys-Gly-Lys-Glyペプチドにより誘導体化されたApoMbを精製するために、同じHPLCシステム上で、Vydac C18半分取用カラム(10×250mm、10μm)を使用して、半分取RP-HPLCを行った。適用した勾配は分析用HPLCと同じであるが、流速は2ml/分であった。生成物のいくつかの画分は、2つのペプチド分子間のジスルフィド結合形成(Gly-Lys-Gly-Cys-SS-Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)により、Cys-Gly-Lys-Glyペプチドの二量体とコンジュゲートしたApoMbを含有していたため、これらの試料を還元し、反応混合物と同じ条件を使用した半分取RP-HPLCにより精製した。5.9mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を含有する0.1%TFAの水溶液にApoMb誘導体(0.5mg/ml)を溶解させ、続いて、37℃で90分間インキュベートすることによって、還元を行った。精製ApoMb誘導体の純度をESI-MS分析によって確認した。
試料をAcCN:水(1:1)中の0.1%ギ酸に溶解させ、MS陽イオンモードで分析した。Masslynxソフトウェア(Micromass)により、計測器制御、データ取得及び処理を行った(図2)。
[実施例6]
Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cysの調製
工程1: 200mgの2-クロロトリチルクロリド樹脂(充填量1.22mmol/g)を10mlのCH2Cl2で予備膨潤させた。第1のFmoc保護AA(Fmoc-L-2Nal-OH)に、3当量のDIPEA(128μl)を、2.5時間(2当量、0.488mmol、213.5mg)、樹脂上で充填した。第1のAAの固定後、樹脂を3:0.5のMeOH/DIPEAの溶液で30分間エンドキャップした。樹脂をDMFで洗浄し、分割溶液を反応器(ピペリジン:DMF 1:4)に添加し、30分間撹拌した。樹脂をDMFで洗浄し、4当量のDIPEA(170μl)及び1.8当量のHBTU(166.6mg、0.439mmol)により、Boc-4-Amc-OHを添加した(2当量、125.6mg、0.488mmol)。2時間後、樹脂をDMFで洗浄し、HFIP/CH2Cl21:4の溶液により、5分間にわたり、完全に保護されたペプチドを樹脂から分割した。溶媒を真空中で蒸発させ、生成物aをさらに精製することなく工程2で使用した。
工程2: 生成物a(110mg、0.244mmol)をCH2Cl2に溶解させ、DIPEA(3当量、128μl)及びHBTU(0.9当量、83mg)を溶液に添加した。次いで、(OtBu)2Glu-尿素-Lys(OtBu)(1当量)の溶液(Weineisenら、EJNMMI Research、2014年、4巻:63号に記載の通り合成したもの)を溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をシリカ重量測定クロマトグラフィーにより精製した。得られた生成物を0℃で3mlのCH2Cl2に溶解させた。300μlのTFAを滴下して添加し、反応混合物を0℃で1時間撹拌した。10mlの飽和NaHCO3を溶液に加え、生成物をCCl3で抽出した。Et2Oを添加し、生成物を沈殿させた。溶媒を蒸発させて、完全に保護された生成物bを得た。
工程3: 丸底フラスコ中で41.5mgのBoc-Cys(Trt)-OHをCH2Cl2に溶解させ、3当量のDIPEAと1当量のHBTUを溶液に添加した。次いで、生成物bを溶液に添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を水で3回洗浄し、次いで、溶媒を蒸発させ、TFA/TIS 95:5(4ml)の溶液に再溶解させた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を低温Et2O中で沈殿させた。分取HPLC: Atlantis prepD(登録商標)C18OBD 5μm(19×100mm)カラムにより、生成物を精製した。溶離液: (A)H2O中の0.1%TFA、(B)CH3CN中の0.1%TFA。勾配プロファイル;5.69分間で25%のBでの無勾配、2.85分間で25%から37.5%のBの線形勾配、1.70分間で37.5%から100%の線形勾配、1.8分間で100%のBの無勾配。流速;20ml/分。19.8mgのGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cysを単離した。総収率: 4%。上記の勾配プロファイル及び移動相を使用して、分析用HPLC、Atlantis DC18 5μm(4.6×150mm)カラムにより、生成物の純度をモニターした。1ml/分の流速及び230nmでの紫外線検出。HPLC純度99%。qNMRアッセイ: 94% ESI-MS(m/z): 計算質量(C36H51N6O10S): 759.90; 実測値: 759.66。あるいは、J.Med.Chem. (2016)、59巻、1761〜1775頁に報告されているように、固相合成によって生成物bを調製することもできる。ペプチド配列の固定化アミノ官能基に対するCysのコンジュゲーションは、固相合成によって行うことができる。上記の分割手順を適用して、完全に脱保護された生成物を得ることができる。
99mTc標識化試験及び特性決定
小サイズ分子の標識化
[実施例7]
錯体1、錯体2、錯体3、[99mTc(N)(PNP3OH)(ZY)]0/+ (ZY=CysNAc; CysOEt; CysGly)の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.500ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中に溶解させた1mg)及びZY(0.2mlのH2O中に0.150〜0.005mg)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
室温での30分間インキュベーションを行った時点で収集した、最終錯体のRP-HPLCプロファイルのいくつかを図4に示す。
80℃で反応を行ったとき、[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+のRCYの有意な減少が観察された(23%)。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.500ml; 185MBq)を添加した。バイアルを10秒間ボルテックスした。すぐに、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中1mg)、ZY(0.2mlのH2O中0.150〜0.005mg)を同時に添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
80℃で反応を行ったとき、[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+のRCYの有意な減少が観察された(21.23%)。
PBS中の方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.300ml; 185MBq)を添加した。バイアルを10秒間ボルテックスした。すぐに、PNP3OH・HCl(1.00mlのPBS 1x中に1mg)及びZY(0.1ml中0.150〜0.005mg)を同時に添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1.5mlであった。
80℃で反応を行ったとき、[99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+のRCYの有意な減少が観察された(73.85%)。
異なる方法により得られ、HPLCクロマトグラフィーにより決定されたRCYを表1に報告する。
異なる条件における、錯体1及び錯体2の(%)RCYの経時的な(30分対18時間の)変動を図5に示す。これらの調製では、ホスホニウム塩PNP3OH・HClを自家pHで使用するか、又はリン酸緩衝液(0.2M、pH7.4)を添加することによって、対応する遊離PNP3OHにその場で変換する。あるいは、遊離PNP3OHを直接使用した。この後者は、使用前に、リン酸緩衝液(0.2M、pH7.4)又は炭酸塩緩衝液(0.5M、pH9)に、PNP3OH・HClを溶解させて得た。
MS特性決定のための(99m/99gTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)]及び[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+の担体付加調製。
放射性標識化合物の化学的同一性を確認するために、長寿命99gTc及び短寿命99mTcの両方を使用して、担体付加合成を行い、[99g/99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+テンプレートを調製した。
要約すると、SDH(15.0mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた2mg)及びNH4[99gTcO4](0.100mlの食塩水中0.050mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml、50.0MBq)を添加した。バイアルを30分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中に溶解させた1mgのPNP3OH・HCl)及び選択したシステイン誘導体配位子(0.200mlの水に溶解させた3mg)の原液を添加し、反応混合物を室温で30分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であった。
デュアル検出器を備えたHPLCにより担体付加調製物を分析した。両方の調製物のクロマトグラフプロファイルは、2つの重ね合わせることができる紫外線及び放射計ピークを示す。これらのピークは、完全な99mTc崩壊後に単離されてESI(+)-MSによって分析されたものである。質量スペクトルは、図6A及び6Bにおいて予想される信号を示す。
[99gTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)] 異性体a m/z 590 ([M + H]+, 100%); 異性体b m/z 590 (M+ H+, 100%);
[99gTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+ 異性体a m/z 576 (M+, 100%); 異性体b m/z 576 (M+, 100%).
[実施例8]
錯体4、[99mTc(N)(PNP43)(CysGly)]+の放射性合成
放射性標識化効率試験によって決定された0.010mgのCysGly量を使用することによって、それぞれ方法1及び2に記載した二段階及び一段階手順に従って、錯体を調製した。反応を室温で行った。
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.500ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP43(0.1mlのEtOH中に溶解させた0.25mg)、CysGly(0.1mlのH2O中0.010mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.500ml; 185MBq)を添加した。バイアルを10秒間ボルテックスした。続いてすぐに、PNP43(0.1mlのEtOH中に溶解させた0.25mg)、CysGly(0.1mlのH2O中0.010mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7.2であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表1に報告する。
[比較例9]
比較物A、[99mTc(N)(PNP3)(CysGly)]の放射性合成
比較のために、さらなる例として、[99mTc(N)(PNP3)]-足場を用いることにより、低分子ペプチド(small peptide)CysGlyを標識化した。
放射性標識化効率試験によって決定された0.010mgのCysGly量を使用することによって、それぞれ方法1及び2に記載した二段階及び一段階手順に従って、錯体を調製した。反応を室温で行った。
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.500ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3(0.1mlのEtOH中に溶解させた1mg)、CysGly(0.1mlのH2O中0.010mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.500ml; 185MBq)を添加した。バイアルを10秒間ボルテックスした。続いてすぐに、PNP3(0.1mlのEtOH中に溶解させた1mg)、CysGly(0.1mlのH2O中0.010mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7.2であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表1に報告する。
[実施例10]
錯体5、[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)]の放射性合成
方法1(二段階)、PB中の含水アルコール溶液。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中に溶解させた1mg)及びDT-OEt(0.3mlのEtOH中1.5mg)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1mlであった。HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表2に報告する。
方法2(一段階)、PB中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中1mg)及びDT-OEt(0.3mLのEtOH中1.5〜0.0075mg)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1mlであった。HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表2に報告する。
方法2(一段階)、PBS中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.100ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(1.00mlのPBS(1x)中1mg)及びDT-OEt(0.3mlのEtOH中0.0075mg)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1.5mlであった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表2に報告する。
[実施例11]
錯体6、[99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)]の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP(PNP43、0.1mlのEtOHに溶解させた0.25mg)、DT-OEt(0.2mlのEtOH中0.0075mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP43(0.1mlのEtOHに溶解させた0.25mg)、DT-OEt(0.2mlのEtOH中0.0075mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表2に報告する。
[比較例12]
比較物B、[99mTc(N)(PNP3)(DT-OEt)]の放射性合成
比較の目的で、0.0075mgのDT-OEt量を使用することにより、方法1及び2にそれぞれ記載した二段階及び一段階手順に従って、錯体を調製した。反応を室温で行った。
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いでPNP(0.1mlのEtOH中に溶解させた1mg)、DT-OEt(0.2mlのEtOH中0.0075mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3(0.1mlのEtOHに溶解させた1mg)、DT-OEt(0.2mlのEtOH中0.0075mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表2に報告する。
[実施例13]
錯体7、[99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)]の放射性合成
方法1(二段階)、PB中の含水アルコール溶液。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中に溶解させた1mg)及びDT-OH(0.3mlのEtOH中0.00078mg)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置して、30分及び60分の時点でHPLC分析した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1mlであった。HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
方法2(一段階)、PB中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中1mg)及びDT-OH(0.3mlのEtOH中0.0078〜0.000156mg)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置し、30分及び60分の時点でHPLC分析した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1mlであった。HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
方法2(一段階)、PBS中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.100ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3OH・HCl(1.00mlのPBS(1x)中1mg)及びDT-OH(0.3mlのEtOH中0.00078mg)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置し、30分及び60分の時点でHPLC分析した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7であり、容積は1.5mlであった。HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
[実施例14]
錯体8、[99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)]の放射性合成
方法1(二段階)、PB中の含水アルコール溶液。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いでPNP43(0.1mlのEtOH中に溶解させた0.25mg)、DT-OH(0.2mlのEtOH中0.00078mg)及びPB(0.200ml、0.2M pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した(30分及び60分の時点でHPLCによりチェックした)。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告した。
方法2(一段階)、PB中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP43(0.1mlのEtOHに溶解させた0.25mg)、DT-OH (0.2mlのEtOH中0.00078mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した(30分及び60分の時点でHPLCによりチェックした)。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
[比較例15]
比較物C、[99mTc(N)(PNP3)(DT-OH)]の放射性合成
比較のために、0.00078mgのDT-OH量を使用することにより、方法1及び2にそれぞれ記載した二段階及び一段階手順に従って、錯体を調製した。反応を室温で行った。
方法1(二段階)、PB中の含水アルコール溶液。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いでPNP3(0.1mlのEtOH中に溶解させた1mg)、DT-OH(0.2mlのEtOH中0.00078mg)及びPB(0.200ml、0.2M pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した(30分及び60分の時点でHPLCによりチェックした)。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
方法2(一段階)、PB中の含水アルコール溶液。SDH(2.5mg)及びSnCl2(0.10mlの食塩水中に懸濁させた0.10mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.400ml; 185MBq)を添加し、続いてすぐに、PNP3(0.1mlのEtOHに溶解させた1mg)、DT-OH(0.2mlのEtOH中0.00078mg)及びPB(0.200ml、0.2M、pH7.4)を添加した。反応混合物を室温で60分間放置した(30分及び60分の時点でHPLCによりチェックした)。反応終了時に測定したpHは7であり、容積は1mlであった。
室温でHPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表3に報告する。
[実施例16]
DT-OH配位子の放射性標識化効率。
方法2(一段階)で報告した標準化標識化条件に従って、DT-OHの放射性標識化効率を決定する。PNP3OH・HClの量を1mg(2×10-3M)に固定し、一方で、DT-OHの量を0.78mg(6.29×10-3 M)〜0.000078mg(6.29×10-7 M)の範囲で漸進的に減少させた。混合物を室温で30分間インキュベートした。最終pHは7であり、容積は1mlであった。RCYをHPLCにより決定した。データを表9にまとめる。
中サイズ分子の標識化
[実施例17]
錯体9、[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。SDH(5.0mg)及びSnCl2(0.1mlの食塩水中に懸濁させた0.1mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](1.0ml、50.0MBq〜2.2GBq)を添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体、[Tc≡N]int 2+の混合物を得た。PNP3OH・HCl(0.2mlのPB(0.2M、pH7.4)中1.0mg)及びCys-cRGDfK(0.200mlの水中0.050mg)を、同時に反応バイアルに添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.4であった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表4にまとめた。室温で30分間インキュベートしたときの最終錯体のHPLCプロファイルを図4に示す。
[実施例18]
錯体10、[99mTc(N)(PNP43)(Cys-cRGDfK)]+の放射性合成
方法1(二段階)。SDH(5.0mg)及びSnCl2(0.1mlの食塩水中に懸濁させた0.1mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.95ml、50.0MBq〜2.2GBq)を添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体、[Tc≡N]int 2+の混合物を得た。PNP43(0.25mg/0.5mlγ-シクロデキストリン4mg/ml)及びCys-cRGDfK(0.050mlの水中0.050mg)を、同時に反応バイアルに添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.4であった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表4にまとめる。
[比較例19]
比較物D、[99mTc(N)(PNP3)(Cys-cRGDfK)]+の放射性合成
方法1(二段階)。SDH(5.0mg)及びSnCl2(0.1mlの食塩水中に懸濁させた0.1mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.95ml、50.0MBq〜2.2GBq)を添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体、[Tc≡N]int 2+の混合物を得た。PNP3(1mg/0.5mlγ-シクロデキストリン4mg/ml)及びCys-cRGDfK(0.050mlの水中0.050mg)を、同時に反応バイアルに添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.4であった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表4にまとめる。
[実施例20]
錯体11、[99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)]の放射性合成
方法1(二段階)。SDH(5.0mg)及びSnCl2(0.1mlの食塩水中に懸濁させた0.1mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](1.0ml、50.0MBq〜2.2GBq)を添加した。バイアルを30分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体、[Tc≡N]int 2+の混合物を得た。PNP3OH・HCl(0.2mlの水中2.0〜0.625mg)、リン酸ナトリウム緩衝液(0.2ml、0.2M、pH7.4)及びBiot-Abu-Cys(0.2mlの水中0.200mg)を、同時に反応バイアルに添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.4であった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表5にまとめる。
[比較例21]
比較物E、[99mTc(N)(PNP3)(Biot-Abu-Cys)]の放射性合成
方法1(二段階)。SDH(5.0mg)及びSnCl2(0.1mlの食塩水中に懸濁させた0.1mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](1.0ml、50.0MBq〜2.2GBq)を添加した。バイアルを30分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体、[Tc≡N]int 2+の混合物を得た。PNP3(0.1mlのEtOH中1mg)、リン酸ナトリウム緩衝液(0.2ml、0.2M、pH7.4)及びBiot-Abu-Cys(0.3mlの水中0.200mg)を、同時に反応バイアルに添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.4であった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表5にまとめる。
[実施例22]
Cys-配位子量の関数としての放射性標識化効率
選択したCys-配位子の放射性標識化効率を、方法1に報告した標準化標識化条件に従って決定した。PNP3OH・HClの量を1mg(3.17 10-3mmol)に固定し、一方で、Cys-配位子の濃度を、CysNAcについては3mg(18.4×10-3mmol)〜5μg(3.06×10-5mmol); CysOEt・HClについては3mg(20.10×10-3mmol)〜5μg(3.35×10-5mmol); Biot-Abu-Cysについては0.250mg(5.77×10-4mmol)〜50μg(1.15×10-4mmol); Cys-cRGDfKについては0.200mg(2.82×10-4mmol)〜5μg(7.07×10-6mmol)の範囲で、漸進的に減少させた。混合物を室温で30分間インキュベートした。RCYをHPLCにより決定した。
共配位子の濃度に対する、各異性体型の分布に伴う錯体形成の(%)RCYの依存性を、錯体1及び錯体2については図7に示し、錯体9については図8に示す。
錯体2の定量的形成は、共配位子のエステル基[-(CO)OEt]の加水分解によって生じた副生成物の形成によって妨げられた。特に、錯体1及び錯体2について、異性体分布の変動が共配位子量の関数であることが見出された。
[実施例23]
錯体12、[99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.500ml、185MBq)を添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中に溶解させた0.5mg)及びGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys(0.157mlのH2O中0.043mg/0.043μlのDMSO)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
HPLC及びTLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表7に報告する。
PBにおける方法2(一段階)。SDH(5mg)及びSnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに、Na[99mTcO4](0.500ml; 185MBq)を添加した。バイアルを10秒間ボルテックスした。すぐに、PNP3OH・HCl(0.200mlのPB(0.2M、pH7.4)中0.5mg)、及びGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys(0.157mlのH2O中0.043mg/0.043μlのDMSO)を同時に添加した。反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表7に報告する。
MS特性決定のための[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+の担体付加調製。放射性標識化合物の化学的同一性を確認するために、長寿命99gTc及び短寿命99mTcの両方を使用して、担体付加合成を行い、[99m/99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+化合物を調製した。SDH(15mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた2mg)を含有するバイアルに、Na [99mTcO4](0.400ml、185MBq)及びNH4[99gTcO4](0.100mg/0.100ml)を含有する水溶液を添加した。バイアルを30分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99m/99gTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP3OH・HCl(0.200mgのPB(0.2M、pH7.4)に溶解させた0.5mg)及びGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys(0.15mlのH2O中0.5mg/0.050μlのDMSO)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
精製。反応混合物をmilliQ水で1:9に希釈し、次いで、Sep Pak C18カートリッジ(5mLのEtOH及び5mLの水で前処理したもの)に充填した。カートリッジ上の生成物を20mlの食塩水及び3mlの10%EtOHで洗浄した。2mlのEtOH/食塩水混合物40/60(画分#1: 4gtt; 画分#2: 25〜30gtt; 画分#3:残り)により、放射性錯体を分画溶出した。化合物の大部分は画分#2にあった。99mTc崩壊が完了した後の精製生成物を、LC-MS(陽イオンモードで動作する、加熱エレクトロスプレーイオン化イオン源を備えた、Surveyor Plusと組み合わせたLCQ Fleet(Thermo-Scientific)イオントラップ質量分析計)によって分析した。
ESI-MS [99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+ a MW C47H76N8O15P2S2Tcの計算値 = 1186.08 実測値 (m/z = 593 [M+H]2+ (存在率100%); m/z = 1185 [M]+ (存在率15%).
ESI-MS [99gTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+ b MW C47H76N8O15P2S2Tcの計算値= 1186.08 実測値 (m/z = 593 [M+H]2+ (存在率30%); m/z = 1185 [M]+ (存在率25%).
[実施例24]
錯体13、[99mTc(N)(PNP43)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。Na[99mTcO4](0.400ml、185MBq)を、SDH(2.5mg)、SnCl2(0.100mlの食塩水中に懸濁させた0.100mg)を含有するバイアルに添加した。バイアルを15分間室温に保ち、99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+の混合物を得た。次いで、PNP43(0.100mlのEtOH中に溶解させた0.25mg)、Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys(0.157mlのH2O中0.043mg/0.043μlのDMSO)及び0.2mlのPB(0.2M、pH7.4)を添加し、反応混合物を室温で60分間放置した。反応終了時に測定した反応混合物のpHは7.2であり、容積は1mlであった。
HPLCクロマトグラフィーにより決定したRCYを表7に報告する。
反応を80℃で行ったとき、RCPは82.06±2.65%であった。
大分子(>15000Da)の標識化
[実施例25]
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。上記のように調製した40μl(111MBq)の[99mTc≡N]mix 2+中間体に、PNP3OH・HCl(5μlのPB(0.2M、pH7.4)中5μg)、PB(45μl、0.2ml、0.2M、pH7.4)及びCys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(10μlの0.01%TFA中80μg)を同時に添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。
RCYを表6にまとめる。TLC及びHPLCにより、特性決定を行った。
反応混合物の紫外線-放射線HPLC分析を図13に示す。
[比較例26]
比較物F、[99mTc(N)(PNP3)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+の放射性合成
PBにおける方法1(二段階)。上記のように調製した40μl(111MBq)の[99mTc≡N]mix 2+中間体に、PNP3(8μLのEtOH中8μg)、PB(42μl、0.2M、pH7.4)及びCys-Gly-Lys-Gly-ApoMb(10μLの0.01%TFA中80μg)を添加した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。
RCYを表6にまとめる。
[比較例27]
比較物G、[99mTc(N)(PNP3OH)(ApoMb)]+及び比較物H、[99mTc(N)(PNP3OH)(BSA)]+の放射性合成
方法2(一段階)。比較を目的とするこの手順に従い、Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMbの代わりに、金属画分への配位に適した、又はそれに利用できるCys残基を含有しない、未修飾アポミオグロビン(ApoMb)又はヒト血清アルブミン(HSA)を使用することによって、一連の反応を行った。
RCYを表8にまとめる。
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+のラジオクロマトグラムを、a)99mTc(N)-中間体; b)[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位(図14A);及びc)Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMbの代わりに天然ApoMbを用いて実施した試験反応(図14B)の放射線-HPLCプロファイルと比較する。未結合99mTc(N)-中間体又は[99mTc(N)(PNP3OH)]2+構成単位から生じるピークは検出されず、これらの反応の高い特異性及び選択性を確認した。
[実施例28]
インビトロ安定性試験
いくつかの化合物について、過剰の交換配位子の存在下で錯体の放射化学純度(RCP)をHPLCにより経時的にモニターして、トランスキレーション試験を行った。実験を三重に行った。
チャレンジ反応。過剰のグルタチオン(GSH)又はCysを使用して、精製[99mTc(N)(PNP3OH)]-標識化小サイズ化合物(錯体1、錯体2、錯体9及び錯体10)について、チャレンジ実験を行った。塩酸システインの水性原液(10mM; 1mM)のアリコート(50μl)を、PB(250μl、0.2M; pH7.4)、水(100μl)及び選択した[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物(100μl)を含有するプロピレン試験管に添加した。混合物をボルテックスし、37℃で24時間インキュベートした。塩酸システインの代わりに等容積の水を含む対照反応を並行して試験した。30分、1時間、3時間及び24時間の時点で、反応混合物のアリコートを取り出し、HPLCクロマトグラフィーにより分析した。チャレンジ配位子としてGSH(50μl、10mM)を使用して、同様の手順を適用した。
[99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly-ApoMb)]+について、交換配位子としてEDTA(50μl、10mM)を使用して、追加の実験を行った。
一般に、化合物は配位子交換反応に対して十分な安定を示すことがわかった。
[実施例29]
受容体親和性試験
標的指向性分子、ビオチン及びRGDペプチドの受容体結合親和性に対する[99mTc(N)(PNP)]構成単位の影響を調べるために、試験を行った。
錯体11及び錯体9の両方についての実験の前に、2つの異性体をHPLCによって単離し、それらの異性体変換を37℃で24時間にわたって評価した。
錯体11を37℃でインキュベートしても、a対b及びその逆の変動は観察されなかった。これに対して、錯体9については、可逆的なa対b及びb対a変換が検出された。特に、放射性標識化ペプチドの精製直後に収集されたHPLCプロファイルは、2つの異性体種の量がおよそ90:10の比であることを明示しており、このことは一方の異性体から他方への迅速な変換が生じたことを示している。さらに、より高速なb対aの変換が見られた。したがって、放射性標識化ペプチドについては、70/30の比による2つの異性体型の混合物を、受容体親和性試験に直接利用した。
アビジン結合。錯体11の2つの別々の異性体のアビジンへの結合特性の予備的評価を、以前に報告された方法に従って行い、既に公表されている対応する方法(Bolzati, C.; Caporale, A.; Agostini, S.; Carta, D.; Cavazza-Ceccato, M.; Refosco, F.; Tisato, F.; Schievano, E.; Bandoli, G. Avidin-biotin system: a small library of cysteine biotinylated derivatives designed for the [99mTc(N)(PNP)]2+ metal fragment. Nucl. Med. Biol (2006)、34巻、511〜522頁)と比較した。
飽和曲線に沿って1時間及び24時間のインキュベーション後に評価した、結合した放射性標識化ビオチンの百分率を図9に報告する。
細胞取り込み。RPMI1640(Gibco Life Technologies)中で増殖させたM21及びM21L細胞に対して、錯体9の細胞試験を行った。細胞株におけるαvβ3及びαvβ5の発現をフローサイトメトリーにより分析した。
細胞実験の前に、RPMI1640培地中の精製錯体9の安定性を評価した。放射性標識化ペプチドは安定であることがわかった。データを、文献(Decristoforo C、Santos I、Pietzsch HJ、Kuenstler JU、Duatti A、Smith CJ、Rey A、Alberto R、Von Guggenberg E、Haubner R、Comparison of in vitro and in vivo properties of [99mTc]cRGD peptides labeled using different novel Tc-cores、Q J Nucl Med Mol Imaging. (2007)、51巻、33〜41頁)に従い生成した標識化化合物99mTc-HYNIC-RGDfKのデータと比較した。
したがって、990μLの細胞培養培地を含有するガラス試験管に、10μCiの錯体9を含有する10μLの溶液を添加した。混合物をボルテックスし、37℃で2時間インキュベートした。30分、1時間及び2時間の時点で、100μlの反応混合物を取り出し、HPLCクロマトグラフィーにより分析した。錯体の放射化学純度(RCP)は>90%であることがわかった。
放射性標識化ペプチドの細胞取り込みを、ヒト黒色腫αvβ3陽性M21及び陰性M21L細胞株において37℃にて懸濁状態で評価した。取り込み実験中の細胞損傷及び/又は細胞死を回避するように実験条件を設定するために、予備試験を行った。これらの結果を使用して、未標識化c(RGDfK)ペンタ-ペプチド(50μl; 1.65mM)の存在下又は非存在下で、滅菌ガラス管中で、37℃にて30分間、細胞をプレインキュベートした。その後、1mlの細胞懸濁液(1×106細胞/ml)を、10μCi(10μL)の99mTc錯体と共に断続的に攪拌しながらインキュベートした。90分の時点で、管をボルテックスし、細胞をEppendorf製微量遠心管(1.5ml)に移し、インキュベーションを遠心分離(10℃で5分間、3000rpm)により中断した。上清をペレットから分離し、細胞ペレットを含む底部先端を、室温にて食塩水酢酸塩緩衝液(CH3COOH 0.2 M/NaCl 0.5 M)で処理して、膜結合化合物を除去した。遠心分離(10℃で10分間、3000rpm)後、上清をペレットから分離し、各画分を収集し、別個の計数管に入れ、計数器(Cobra II、Packard)を使用して細胞取り込み及び内部移行画分の両方を決定するために、放射能（activity）を決定した。
錯体の取り込みは、細胞106個での全放射能（total activity）の細胞取り込み百分率(%細胞取り込み/細胞106個)として表される。
3回の実験について、すべての評価を三重に行った。
データを図10に要約する。
[実施例30]
インビトロ評価
血清タンパク質結合。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、クロマトグラフィー法により、血清タンパク質に対する錯体1、錯体2及び錯体9の親和性を評価した。
プロピレン試験管中で、100μlの精製錯体(50〜100MBq)を900μlのヒト又はラット血清に添加した。37℃でのインキュベーションの15、60、120及び240分の時点で、各試料の25μlを取り出し、プレスピン(pre-spun)(735×gで2分間)Sephadex G-50ミニカラムに充填した。カラムを735×gで1分間遠心分離にかけた。収集した溶出液及びカラムをNaI-シンチレーションカウンターで計数した。タンパク質結合錯体を全放射能（total activity）の百分率として計算した。
血清及びホモジネート安定性。以下の手順を使用して、異なる時点でRCPをモニターすることによって、錯体1、錯体2、錯体9及び錯体11のインビトロ安定性を評価した。プロピレン試験管内で、50μlの精製[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物を、a)450μlのヒト血清、b)450μlのラット血清、c)450μlのラット肝臓ホモジネート及びd)450μlのラット腎臓ホモジネートに添加した。得られた混合物を37℃で4時間インキュベートした。
15、60、120及び240分で、各溶液の(50μl)を取り出し、950μlのPB(0.02M、pH7.4)で希釈し、HPLC注入前にOASIS HLB抽出カートリッジに通した。試料をカートリッジに充填し、MeOH(1ml)で予備調整し、水(1ml)で平衡化し、5%MeOH(3ml)ですすいだ。EtOH/食塩水60%の混合物(1ml)により、放射性物質(activity)を溶出させた。各画分を収集し、溶出プロファイルを決定するためにカウンター(Cobra II、Packard)を使用して放射能(activity)を測定した。充填した放射性物質(activity)の80%が溶出画分に収集された。この溶液のアリコート(100μl)をHPLCで分析して99mTc(N)-錯体の分解を評価した(図11)。
[実施例31]
インビボ試験
齧歯動物のモデルにおけるすべての動物実験は、国内動物福祉規制(National Regulations for Animal Welfare)の指針に従って行った。プロトコルは、地域の動物実験倫理委員会(Ethical Committee for Animal Experiment)によって承認されている。標準的食物及び水道水を自由に摂取できる気流制御キャビネット内の標準的条件下で動物を飼育した。
注射前に、99mTc錯体を、逆相C18 Sep-Packカートリッジを使用して精製し、過剰の未標識化配位子を除去した。精製後、回収済み放射性物質(activity)をさらにPBSで希釈して、EtOH含有量が<0.5%である最終溶液を得た。インビボ投与前及びその後の18時間にわたって、RCP及び精製錯体の安定性を評価した。
健康なラットにおける生体分布。薬物動態プロファイル及び排出経路、並びにインビボ代謝に対する耐性を評価するために、錯体1、錯体2及び錯体9について、健康なラットにおける生体分布を行った。体重180〜200gの雌スプラーグドーリーラットを、ゾレチル（Zoletil）(40mg/kg)及びキシラジン(2mg/kg)の混合物の筋肉内注射で麻酔した。頸静脈を外科的に露出し、選択した[99mTc(N)(PNP3OH)]-化合物を含有する100μl(300〜370kBq)の溶液を注射した。ラット(n=3)を、注射後の異なる時点で頸椎脱臼により屠殺した。死亡直後に注射器で心臓から血液を採取して定量した。臓器を摘出し、食塩水ですすぎ、秤量し、放射能(activity)をNaIウェルカウンターで計数した。
1グラム当たりの注射用量の百分率(%ID/g)として表される結果を表9及び10に要約する。
尿中の代謝物。注射後2時間及び4時間の時点で、尿を膀胱から直接採取し、HPLCで分析した(図12)。
担癌マウスにおける分布。NOD/SCIDマウスにおいて錯体9について腫瘍取り込み試験を行い、内因的に発現したαvβ3インテグリンをインビボで検出する錯体の有効能力を決定した。腫瘍異種移植片の導入のために、M21(αvβ3陽性)及びM21L(αvβ3陰性)細胞を、5×106細胞/マウスの濃度で皮下注射し、3mmの腫瘍を触知できるまで増殖させた。精製放射性標識化ペプチド(15μCi/200μL)を含有する溶液を尾部静脈に静脈内注射した。動物(n=5)を注射後2時間の時点で頸椎脱臼により屠殺した。腫瘍及び他の組織(血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、胃、腸、筋肉)を取り出し、秤量し、放射能（activity）をNaIウェルカウンターで計数した。結果を組織1グラム当たりの注射放射能（activity）の百分率(%IA/g)として表し、腫瘍対臓器比を計算した。
データを表12にまとめる。
方法1及び方法2によって調製された、本発明係るいくつかの代表的な化合物から30分及び60分の両方の時点で得られた、形成物の(%)RCYを要約し、以下の表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8において、いくつかの比較化合物について測定した対応値と比較する。
ZY配位子の濃度に対する各異性体型の分布に沿った、本発明のいくつかの化合物の形成の(%)RCYの依存性を、図7及び図8に示す。
ZY配位子の濃度に沿った、本発明の化合物の形成の(%)RCYの依存性を、表9に報告する。
異なるpH条件における、錯体1及び錯体2の(%)RCYの経時的な変動を図5に示す。
式[99mTc(N)(PNP3OH)(YZ)]0/+のいくつかの化合物のHPLCプロファイルを、図4、図6A、図6B、図13、図14及び図15に示す。
受容体親和性試験を図9及び図10にまとめ、健康なラット及び担癌マウスにおける生体分布試験を表10、表11、表12にまとめる。
放射性標識化ペプチドのインビトロ及びインビボ安定性を図11及び図12に示す。
これらの結果は、本発明の化合物によって表される特定の選択が、室温及び穏やかな反応条件下で生物活性分子の99mTc-標識化を高収率で可能にすることを確認するものである。

Claims (50)

  1. 式(I)
    [式中、
    Tcは99mTcであり;
    Rは水素(-H)又は式-(CH2)n-A(式中、nは1又は2の整数であり、Aは水素(-H)、ヒドロキシル(-OH)、メチル(-CH3)、カルボキシル(-COOH)、カルボニルナトリウム(-COONa)、アミノ(-NH2)、シアニド(-CN)、スルホニル(-SO3H)及びスルホニルナトリウム(-SO3Na)からなる群から選択される)の基であり;
    R1は式-(CH2)m-R2(式中、mは1〜6の整数であり、R2はアルコキシル(-O-Ak)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)、アミノ(-NH2)からなる群から選択される)の基であり;
    ZYは、二座配位子であり、[O-,S-]、[S-,S-]、[O-,S]、[O,S-]、[N,S-]、[N-,S]、及び[N-,S-](式中、ZYは、Rが-CH3でありR1が-(CH2)2-OCH3である場合、[N,S-]を介してTcと配位することはない)からなる群から選択される電子供与原子の組み合わせを介してTcと配位している]
    の化合物。
  2. Rが、水素(-H)、メチル(CH3)、ヒドロキシメチル(-CH2OH)、エチル(-CH2CH3)、及びカルボキシエチル(-CH2CH2COOH)からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  3. mが2であり、R2がメトキシル(-OCH3)である、請求項1又は2に記載の化合物。
  4. nが1であり、Aがヒドロキシル(-OH)である、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. 式:
    を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 式:
    を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 式:
    を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 式:
    を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  9. ZYが[O-,S-]、[N,S-]、[S-,S-]及び[N-,S](式中、ZYは、Rが-CH3でありR1が-(CH2)2-OCH3である場合、[N,S-]を介してTcと配位することはない)からなる群から選択される電子供与原子の組み合わせを介してTcと配位している、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. ZYが、システイン、システイン誘導体、又はジアニオン形態のジチオレート誘導体である、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
  11. ZYが、CysNAc、CysOEt、CysGly、DT-OEt、DT-OH、Cys、Abu-Cys、Cys-Gly-Lys-Gly、及びHDTCZからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の化合物。
  12. [99mTc(N)(PNP3OH)(CysNAc)];
    [99mTc(N)(PNP3OH)(CysOEt)]+;
    [99mTc(N)(PNP3OH)(CysGly)]+;
    [99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OEt)];
    [99mTc(N)(PNP43)(DT-OEt)];
    [99mTc(N)(PNP3OH)(DT-OH)];
    [99mTc(N)(PNP43)(DT-OH)];
    [99mTc(N)(PNP3OH)(Cys)]0/+;
    [99mTc(N)(PNP43)(Cys)];
    [99mTc(N)(PNP3OH)(Abu-Cys)];及び
    [99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-Gly-Lys-Gly)]+
    からなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物。
  13. ZYが、生物活性分子に連結しているか、又はその一部である、請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 生物活性分子が、感熱性である、請求項13に記載の化合物。
  15. ZYが、Cys-cRGDfK、Biot-Abu-Cys、及びGlu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cysからなる群から選択される、請求項13又は14に記載の化合物。
  16. [99mTc(N)(PNP3OH)(Cys-cRGDfK)]+; [99mTc(N)(PNP3OH)(Biot-Abu-Cys)];及び99mTc(N)(PNP3OH)(Glu-尿素-Lys-2-ナフチル-L-Ala-Amc-Cys)]+からなる群から選択される、請求項13から15のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 生物活性分子が、ポリペプチド、タンパク質、抗体、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項13に記載の化合物。
  18. 抗体が、Fabを含む、請求項17に記載の化合物。
  19. 請求項1から18のいずれか一項に記載の式(I)の化合物を含む、タンパク質標的化SPECTイメージングに適した放射性医薬組成物。
  20. 1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む、請求項19に記載の放射性医薬組成物。
  21. 式(I)
    [式中、
    Tcは99mTcであり;
    Rは水素(-H)又は式-(CH2)n-A(式中、nは1又は2の整数であり、Aは水素(-H)、ヒドロキシル(-OH)、メチル(-CH3)、カルボキシル(-COOH)、カルボキシルナトリウム(-COONa)、アミノ(-NH2)、シアニド(-CN)、スルホニル(-SO3H)及びスルホニルナトリウム(-SO3Na)からなる群から選択される)の基であり;
    R1は式-(CH2)m-R2(式中、mは1〜6の整数であり、R2はアルコキシル(-O-Ak)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)、及びアミノ(-NH2)からなる群から選択される)の基であり;
    ZYは、二座配位子であり、[O-,S-]、[S-,S-]、[O-,S]、[O,S-]、[N,S-]、[N-,S]、及び[N-,S-](式中、ZYは、Rが-CH3でありR1が-(CH2)2-OCH3である場合、[N,S-]を介してTcと配位することはない)からなる群から選択される電子供与原子の組み合わせを介してTcと配位している]
    の化合物を調製する方法であって、
    穏やかな温度で、99mTc-過テクネチウム酸塩、還元剤、ニトリド窒素供与体、及びZYを、式(VII)
    又は式(VIII)
    のビスホスフィノアミン化合物と反応させる工程
    を含む、方法。
  22. a)穏やかな温度で、99mTc-過テクネチウム酸塩、還元剤、及びニトリド窒素供与体を混合して、反応性99mTc-ニトリド前駆体[99mTc≡N]int 2+を得る工程;並びに
    b)穏やかな温度及び穏やかなpHで、ZY及び式(VII)又は式(VIII)のビスホスフィノアミン化合物を含有する緩衝溶液を添加することによって、99mTc-ニトリド前駆体をヘテロ錯体に変換する工程
    を含む、請求項21に記載の方法。
  23. 還元剤が、塩化第一スズ、亜硫酸水素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、第三級ホスフィン及びトリス(m-スルホナトフェニル)ホスフィンからなる群から選択される、請求項21又は22に記載の方法。
  24. ニトリド窒素供与体が、ジチオカルバジン酸、ジチオカルバジン酸誘導体、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、及びヒドラジド誘導体からなる群から選択される、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. ニトリド窒素供与体が、コハク酸ジヒドラジドである、請求項21から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 緩衝液が、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝食塩水、及び炭酸ナトリウム緩衝液からなる群から選択される、請求項21から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 緩衝液が、pH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液0.2M、又はpH7.4のリン酸緩衝食塩水0.01Mである、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. ZYが、生物活性分子に連結しているか、又はその一部である、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 生物活性分子が、ポリペプチド、タンパク質、抗体、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
  30. 抗体が、Fabを含む、請求項29に記載の方法。
  31. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ビス-ヒドロキシメチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  32. ビスホスフィノアミン化合物が、塩酸塩形態のN,N-ビス[(トリス-ヒドロキシメチルホスホニウム)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  33. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ジ-エチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  34. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ジ-メチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  35. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ビス-カルボキシエチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  36. 穏やかな温度が、室温である、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  37. 穏やかなpHが、ほぼ中性のpHである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  38. 穏やかな温度が、室温であり、穏やかなpHが、ほぼ中性のpHである、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
  39. 請求項1から18のいずれか一項に記載の式(I)の化合物の調製に適したキットであって、2容器キット又は3容器キットであり、2容器キットが容器1及び容器2を含み、3容器キットが容器3、容器4、及び容器5を含み;容器1が還元剤及びニトリド窒素供与体を含み、容器2がZY及び式(VII):
    又は式(VIII):
    のビスホスフィノアミン化合物を含み;容器3が還元剤及びニトリド窒素供与体を含み、容器4がZYを含み、容器5が式(VII)又は式(VIII)のビスホスフィノアミン化合物を含む、
    キット。
  40. 還元剤が、塩化第一スズ、亜硫酸水素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、第三級ホスフィン及びトリス(m-スルホナトフェニル)ホスフィンからなる群から選択される、請求項39に記載のキット。
  41. ニトリド窒素供与体が、ジチオカルバジン酸、ジチオカルバジン酸誘導体、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、及びヒドラジド誘導体からなる群から選択される、請求項39又は40に記載のキット。
  42. ニトリド窒素供与体が、コハク酸ジヒドラジドである、請求項39から41のいずれか一項に記載のキット。
  43. ZYが、生物活性分子に連結しているか、又はその一部である、請求項39から42のいずれか一項に記載のキット。
  44. 生物活性分子が、ポリペプチド、タンパク質、抗体、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項43に記載のキット。
  45. 抗体が、Fabを含む、請求項44に記載のキット。
  46. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ビス-ヒドロキシメチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項39から45のいずれか一項に記載のキット。
  47. ビスホスフィノアミン化合物が、塩酸塩形態のN,N-ビス[(トリス-ヒドロキシメチルホスホニウム)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項39から45のいずれか一項に記載のキット。
  48. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ジ-エチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項39から45のいずれか一項に記載のキット。
  49. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ジ-メチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項39から45のいずれか一項に記載のキット。
  50. 式(VII)のビスホスフィノアミン化合物が、N,N-ビス[(ビス-カルボキシエチルホスフィノ)エチル]メトキシエチルアミンである、請求項39から45のいずれか一項に記載のキット。
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BOLZATI, CRISTINA; BENINI, ELISA; CAZZOLA, EMILIANO; JUNG, CHRISTIAN; ET AL: "Synthesis, Characterization, and Biological Evaluation of Neutral Nitrido Technetium(V) Mixed Ligan", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. Vol.15(3), JPN6021030670, 2004, pages 628 - 637, ISSN: 0004567216 *
BOLZATI, CRISTINA; CAPORALE, ANDREA; AGOSTINI, STEFANIA; CARTA, DAVIDE; ET AL: ""Avidin-biotin system: A small library of cysteine biotinylated derivatives designed for the [99mTc(", NUCLEAR MEDICINE AND BIOLOGY, vol. Vol.34(5), JPN6021030667, 2006, pages 511 - 522, ISSN: 0004567218 *
BOLZATI, CRISTINA; CAVAZZA-CECCATO, MARIO; AGOSTINI, STEFANIA; REFOSCO, ET AL: ""Biological in Vitro and in Vivo Studies of a Series of New Asymmetrical Cationic [99mTc(N)(DTC-Ln)(", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. Vol.21(5), JPN6021030671, 2010, pages 928 - 939, ISSN: 0004567213 *
CARTA, DAVIDE; JENTSCHEL, CHRISTIAN; BOLZATI, CRISTINA ET AL: ""Assessment of the best N3 - donors in preparation of [M(N)(PNP)]-based (M= 99mTc-; 188Re) target-sp", NUCLEAR MEDICINE AND BIOLOGY, vol. Vol.41(7), JPN6021030668, 2014, pages 570 - 581, ISSN: 0004567217 *
イタリア特許第１３９７５４７号明細書, JPN7021003057, 16 January 2013 (2013-01-16), ISSN: 0004567215 *

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