CN112704709B - 一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物及其应用 - Google Patents

一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物及其应用，属于中药领域。本发明所述的一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物，所述的中药组合物按照重量份数计，包括以下组分：黑玛咖1‑3份、黄精1‑3份、黄芪2‑3份、玉竹1‑2份、党参1‑2份、当归1‑3份。本发明的中药组合物原料价格低，制备方法便捷，安全有效，具有很好地应用前景和市场前景。

Description

一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物及其应用，属于中药领域。
背景技术
由于社会因素、工作和生活节奏的加快，亚健康人群逐步扩大。据世界卫生组织调查，全球约有35％以上的人长期处于亚健康状态。在这种亚健康的状态下，人们不但会出现学习工作能力下降，例如记忆力减退、头晕耳鸣、失眠多梦、肌肉酸痛、性功能减退、烦躁易怒、全身乏力等“亚健康”现象，还可能导致体内氧化自由基水平过高，诱发免疫力下降，身体器官组织产生严重紊乱，从而导致亚健康，逐渐引发“疲劳综合症”。
中华中医药学会发布的《亚健康中医临床指南》指出：亚健康是指人体处于健康和疾病之间的一种状态。处于亚健康状态者，不能达到健康的标准，表现为一定时间内的活力降低、功能和适应能力减退的症状，但不符合现代医学有关疾病的临床或亚临床诊断标准。肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。市场上中药类的相关保健品主要以熟地黄、鹿茸、蜂王浆、人参和西洋参等补阳中药为主。
现代医学中自由基理论表明：亚健康与机体的氧化抗氧化系统失衡密切相关，致使自由基堆积、肌肉等组织细胞发生脂质过氧化现象，进而引起机体运动能力下降，产生运动性疲劳。尤其是，当人体在长时间而剧烈运动时，机体内的能量代谢和氧化还原平衡被破坏，生成的过量自由基与活性氧，促使体内发生氧化应激，例如乳酸堆积，炎症损伤，甚至会造成肌肉收缩能力下降，肌纤维组织损伤等问题，进而产生肌肉酸痛感。
虽然亚健康的症状尚未完全阐明，但过度产生ROS可导致氧化应激，这被认为是肌肉疲劳或损伤的一个因果因素。改善亚健康，提高劳动效率，需从食疗开始。当然，食品是预防疾病的物质基础，“抗氧化”最直接、最可靠的方式，就是科学选择日常饮食。通过对机体补充外源性抗氧化剂，阻止细胞易氧化底物的氧化、抑制脂质过氧化反应并直接清除体内氧自由基，达到降低体内氧化应激，是提高肌肉的工作能力的有效方法之一。因此，改善亚健康不能全靠功能性饮料，解决体虚人群的难题，还需要关注天然植物的保健功能及其营养疗法。
发明内容
[技术问题]
根据亚健康状态的临床表现，亚健康人主要以易疲劳的症状为主，而精神上则表现为抑郁寡欢。目前，市场上以营养物质和化学物质配伍的相关保健品主要有红牛、东鹏特饮、力保健、日加满、乐虎等。然而，大多数声称“提神醒脑”的产品采用刺激神经的方法来缓解疲劳，而这种方法只是“治标”，并没有真正改善“体虚”的根本问题。时至今日，能量饮料中所谓的“能量”，已经特指某些可以让人感觉精力充沛的神经兴奋剂，成为一种透支精力的方法。
因此，采用天然药用植物进行抗氧化以改善亚健康、提高体力是一种行之有效的办法。然而，草药的安全性很难以保证，尤其是多种药草需要兼顾其药效和毒性，使植物型抗氧化功能饮品开发艰难。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明基于中医理论，结合了现代医学的细胞技术，将采用“药食两用”的食品，进行配伍协调，以双氧水对C2C12细胞造模，模拟肌肉组织的氧化应激，科学的、全面的、合理的设计组合的配方，其采用多种“药食两用”的食品材料，既无安全性的隐患，又能最大程度上发挥抗机体氧化应激的效果，有望能够改善易疲劳的亚健康人群的工作状态和生活质量。
本发明均采用“药食两用”的食品材料(黑玛咖、黄精、黄芪、玉竹、党参、当归)，既改善肌细胞的氧化应激反应，也为原料的安全性提供了保障。而且这些原料之间具有协同作用，可以更好的改善肌细胞氧化应激反应。
本发明的第一个目的是提供一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物，所述的中药组合物按照重量份数计，包括以下组分：黑玛咖1-3份、黄精1-3份、黄芪2-3份、玉竹1-2份、党参1-2份、当归1-3份。
可选的，所述的中药组合物还包括陈皮1-2份。
可选的，所述的中药组合物还包括砂仁1-2份。
可选的，所述的中药组合物还包括甘草1-2份。
可选的，所述的中药组合物还包括罗汉果0.5-1份。
可选的，所述的中药组合物包括黑玛咖1份、黄精2份、黄芪2份、陈皮1份、党参2份、当归1份、玉竹1份、砂仁1份、甘草1份和罗汉果半份。
本发明的第二个目的是提供一种制备本发明所述的改善肌细胞的氧化应激的中药组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将各原料分别粉碎；
(2)在各原料中加入水进行提取，过滤，得到上清液；之后将滤渣再次按照上述过程提取，得到上清液；其中各原料和水的质量比为1：6-10；
(3)将两次得到的上清液合并，浓缩，干燥，得到中药组合物。
可选的，所述提取的温度为90-100℃。
可选的，所述提取的时间为1.5-2.5h。
可选的，所述粉碎采用粉碎机粉碎。
可选的，所述过滤是采用膜过滤。
可选的，所述浓缩是浓缩至固含量为10％。
可选的，所述干燥是冷冻干燥，具体是-50℃冻干48h。
本发明的第三个目的是提供一种药制剂，其组分包括本发明所述的中药组合物。
可选的，所述的药制剂包括口服液、颗粒剂、丸剂、冲剂、胶囊。
本发明的第四个目的是提供一种饮料，其组分包括本发明所述的中药组合物。
本发明的第五个目的是提供一种茶包，其组分包括本发明所述的中药组合物。
[有益效果]
(1)本发明的中药组合物经保健食品功能性检验，具有缓解亚健康状态下肌肉疲劳的功能。
(2)本发明的中药组合物原料价格低，制备方法便捷，安全有效，具有很好地应用前景和市场前景。
(3)本发明的中药组合物可以改善亚健康状态下肌肉的氧化水平，具有提高肌肉伸缩能力的作用。应用在细胞实验之后，细胞的存活率达到76.7％以上，细胞内ROS水平下降了36.7％以上
附图说明
图1为流式细胞仪法测定C2C12细胞内ROS水平，其中(a)为ROS荧光强度；(b)为空白组；(c)为模型组；(d)为实施案例(实施例1)；(e)为阳性组(人参皂苷标准品)。
图2为Calcein-AM/PI双染肌细胞活(第二行)、死(第一行)的荧光图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
测试方法：
1、细胞活力的测试：
采用DMEM培养基、10％FBS、1％青链霉素混合液培养C2C12细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。受试的中药组合物，采用含无FBS的DMEM培养基复溶、稀释至1mg/mL，以每孔5000个C2C12细胞的接种量在96孔板中培养24h后，弃去原培养基，用PBS洗涤后加入1mg/mL中药提取液至于培养箱中继续孵育，在第18h加入0.78mM H2O2溶液，继续共孵育6h后，用CCK-8法测定细胞活力。其中，以空白溶剂和H2O2处理的C2C12细胞为模型组，仅以空白溶剂处理的C2C12细胞为空白对照组。
细胞存活率的计算公式如下式(1)：
Figure BDA0002913861770000041
2、细胞内ROS测定
采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA,Beyotime)荧光探针检测活性氧(ROS)水平。流式细胞术分析，将C2C12细胞以5×105细胞/孔密度接种于6孔板中。收集悬浮细胞和贴壁细胞，用PBS洗涤两次，并补充含有待测样品的培养基。用ROS检测试剂盒(Beyotime)对细胞进行染色，避光孵育20min后，并根据制造商的说明书使用流式细胞仪进行分析。
ROS荧光强度降低比例的计算公式如下式(2)：
Figure BDA0002913861770000042
3、Calcein-AM/PI双染：活死细胞的比例
为进一步探讨实施案例对ROS诱导细胞氧化损伤的改善效果，将C2C12细胞以5×105细胞/孔密度接种于6孔板中,用胰酶消化细胞，1000rpm离心10min收集细胞。去除上清液，加入PBS制备细胞悬液，使其细胞浓度在105～106cell/mL。用PBS洗涤两次去除酯酶活性，用100μL 1mmol Calcein-AM和Propidium Iodide(PI)与200μL细胞悬液混合均匀，37℃孵育15min。用宽场高内涵荧光显微镜(Carl Zeiss,Germany)在490±10nm激发波长下同时观察黄绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞。另外用545nm激发波长单独观察死细胞。
实施例1
一种制备改善肌细胞氧化应激的中药组合物的方法，包括如下步骤：
(1)按照质量份数将黑玛咖1份、黄精2份、黄芪2份、玉竹1份、党参2份、当归1份分别粉碎；
(2)在粉碎后的各原料中加入水在95℃下提取1.5h，膜过滤，得到上清液；之后将滤渣再次按照上述过程提取，得到上清液；其中各原料和水的质量比为1：6；
(3)将两次得到的上清液合并，浓缩至固含量为10％，在-50℃下冷冻干燥48h，得到中药组合物。
以空白溶剂和H2O2处理的C2C12细胞为模型组，仅以空白溶剂处理的C2C12细胞为空白对照组；以人参皂苷标准品为阳性对照组；进行性能测试，测试结果如下：
图1为肌细胞内ROS水平，其中(a)为各组细胞中ROS荧光强度；(b)为空白组；(c)为模型组；(d)为实施案例(实施例1)；(e)为阳性组(人参皂苷)。从图1可以看出：H2O2增加了模型组细胞中ROS的水平，而经过实施例1预处理后，则减少了H2O2诱导的ROS的产生(荧光强度从1379下降到750，下降了45.2％)。与空白组相比，H2O2处理后计数直方图(RNC)-FITC右移。同时将C2C12肌细胞与实施例1共孵育，可阻断H2O2诱导的肌细胞中线粒体ROS的产生。
图2为荧光显微镜下，肌细胞活(第二行)死(第一行)荧光图。从图2可以看出：在经过实施例1(实施案例)处理后，相比于模型组，肌细胞在氧化应激条件下的存活率明显提高。
实施例2
调整实施例1中各组分的配比如表1所示，其他和实施例1保持一致，得到中药组合物。
将实施例1和实施例2得到的中药组合物进行性能测试，测试结果如下：
表1实施例1和2的测试结果
黑玛咖：黄精：黄芪：玉竹：党参：当归 细胞的存活率(％) ROS荧光强度降低比例(％)
1：2：2：1：2：1(实施例1) 86.0 45.2
1：1：2：1：2：1 78.1 37.8
2：1：2：1：2：1 80.3 40.1
2：1：1：1：2：1 76.7 36.7
2：1：1：2：2：1 78.5 37.9
2：1：1：1：1：1 79.4 39.0
2：1：1：2：1：2 80.1 40.0
对照例1
调整实施例1中各组分的配比如表2所示，其他和实施例1保持一致，得到中药组合物。
表2对照例1的测试结果
中药配方 细胞的存活率(％) ROS荧光强度降低比例(％)
实施例1 86.0 45.2
黑玛咖 65.9 27.9
黄精 68.2 29.8
黄芪 69.1 30.1
玉竹 64.5 27.1
党参 68.4 29.9
当归 63.7 26.7
注：表中中药的总质量是相同的。
实施例3
一种制备改善肌细胞氧化应激的中药组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将黑玛咖1份、黄精2份、黄芪2份、党参2份、当归1份、玉竹1份、陈皮1份、分别粉碎；
(2)在粉碎后的各原料中加入水在95℃下提取1.5h，膜过滤，得到上清液；之后将滤渣再次按照上述过程提取，得到上清液；其中各原料和水的质量比为1：6；
(3)将两次得到的上清液合并，浓缩至固含量为10％，在-50℃下冷冻干燥48h，得到中药组合物。
实施例4
调整实施例3中各组分的配比如表3所示，其他和实施例3保持一致，得到中药组合物。
对照例2
调整实施例3中中药组合物为陈皮，其他和实施例3保持一致，得到中药组合物。
将实施例3、4和对照例2得到的中药组合物进行性能测试，测试结果如下：
表3实施例3、4和对照例2的测试结果
黑玛咖：黄精：黄芪：玉竹：党参：当归：陈皮 细胞的存活率(％) ROS荧光强度降低比例(％)
1：2：2：1：2：1：1(实施例3) 90.9 52.2
1：2：2：1：2：1：0(实施例1) 86.0 45.2
1：2：2：1：2：1：2 87.1 48.5
仅陈皮 65.3 27.6
注：表中中药的总质量是相同的。
实施例5
一种制备改善肌细胞的氧化应激的中药组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将黑玛咖1份、黄精2份、黄芪2份、陈皮1份、党参2份、当归1份、玉竹1份、砂仁1份分别粉碎；
(2)在粉碎后的各原料中加入水在95℃下提取1.5h，膜过滤，得到上清液；之后将滤渣再次按照上述过程提取，得到上清液；其中各原料和水的质量比为1：6；
(3)将两次得到的上清液合并，浓缩至固含量为10％，在-50℃下冷冻干燥48h，得到中药组合物。
实施例6
调整实施例5中各组分的配比如表4所示，其他和实施例5保持一致，得到中药组合物。
对照例3
调整实施例5中中药组合物为砂仁，其他和实施例5保持一致，得到中药组合物。
将实施例5、6和对照例3得到的中药组合物进行性能测试，测试结果如下：
表4实施例5、6和对照例3的测试结果
黑玛咖：黄精：黄芪：陈皮：党参：当归：玉竹：砂仁 细胞的存活率(％) ROS荧光强度降低比例(％)
1：2：2：1：2：1：1：1(实施例5) 98.7 60.8
1：2：2：1：2：1：1：0(实施例3) 90.9 52.2
1：2：2：1：2：1：1：2 91.8 45.2
仅砂仁 59.9 25.2
实施例7
一种药物片剂的制备方法，包括如下步骤：
在实施例1、3、5的中药组合物浓缩为固含量为80％，之后加入淀粉、硬脂酸镁、山梨糖醇，混合均匀，之后将混合配料经过制粒与整粒、过筛、压片，得到药物片剂；其中中药组合物、淀粉、硬脂酸镁、山梨糖醇的质量比为100：3：13：3。
将得到的药物片剂压碎，复溶进行细胞实验，测试结果如下：
表5实施例7的测试结果
例 细胞的存活率(％) ROS荧光强度降低比例(％)
实施例5 98.7 58.8
实施例3 90.8 50.5
实施例1 86.0 43.8
人参皂苷(阳性对照) 72.4 35.0
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种改善肌细胞氧化应激的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物按照重量份数计，原料组成为：黑玛咖1份、黄精2份、黄芪2份、陈皮1份、党参2份、当归1份、玉竹1份、砂仁1份。
2.一种制备权利要求1所述的改善肌细胞氧化应激的中药组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将各原料分别粉碎；
（2）在各原料中加入水进行提取，过滤，得到上清液；之后在滤渣中再次加入水进行提取，过滤，得到上清液；其中各原料和水的质量比为1：6-10；
（3）将两次得到的上清液合并，浓缩，干燥，得到中药组合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取的温度为90-100℃；所述提取的时间为1.5-2.5h。
4.一种药物制剂，其特征在于，其组分包括权利要求1所述的中药组合物。
5.一种饮料，其特征在于，其组分包括权利要求1所述的中药组合物。
6.一种茶包，其特征在于，其组分包括权利要求1所述的中药组合物。
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