CN112703008A - 治疗癫痫、发作和cns疾病的经口抗炎肽 - Google Patents

Abstract

治疗个体中的发作、癫痫或脑功能丧失的方法，包括制备包含全‑D氨基酸肽和药学上可接受的载体的组合物的步骤。D肽具有一般结构：A‑B‑C‑D‑E，其中A是Ser、Thr、Asn、Glu、Ile。B是Ser、Thr、Asp、Asn，C是Thr、Ser、Asn、Arg、Lys、Trp，D是Tyr，并且E是Thr、Ser、Arg、Gly。并且其中D肽中的所有氨基酸都是D立体异构构型，并且所述肽组合物以治疗有效剂量施用，其中所述组合物起抑制脑功能丧失背后的炎症的作用。D肽可以在E处酯化、糖基化或酰胺化，以通过促进从循环中流出和渗透到脑中来增强组织分布。

Description

治疗癫痫、发作和CNS疾病的经口抗炎肽

本申请要求2017年7月18日提交的美国临时申请序列号62/533,854的权益。

技术领域

本发明广泛地涉及治疗或预防自发或诱发的癫痫(epilepsy)或发作(seizure)，其可能发生于癫痫持续状态开始之后、创伤性癫痫(PTE)之后或作为以下的并发症：头部创伤，例如轻度、中度或重度创伤性脑损伤，由于震荡、颅骨骨折、创伤性脑病、震荡冲击(concussive blast)和神经变性而引起的颅内出血，包括由神经外科手术和一般脑损伤事件引起的那些，包括有机磷(OP)神经剂暴露、脑感染(细菌、病毒、寄生虫)、脑炎、中毒性休克、子痫、颅内出血、脑性瘫痪、低氧、低钠血症、药物过量、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sDisease)、脑肿瘤、卒中、自闭症谱系障碍、先天性疾病如唐氏综合征(Down’s syndrome)、安格曼综合征(Angleman’s syndrome)、结节性硬化症、神经纤维瘤病或具有不确定原因的遗传形式。

附图说明

图1A-D说明全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)阻断了TLR4介导的抗原呈递树突细胞的成熟。

图2说明全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)分别在CCR2和CCR5受体处有效地阻断了MCP-1(CCL2)和MIP-1β(CCL4)引起的人单核细胞的趋化性。

图3说明三种另外的全-D氨基酸肽在低浓度下阻断CCL2(MCP-1)趋化性的作用。

图4A-F说明全-D-五肽TTNYT(SEQ ID NO:1)降低了大鼠中趋化因子CCL2和CCL3、趋化因子受体CCR2和CCR5以及细胞因子IL-1和TNFα的表达。

引言

癫痫是脑的神经系统疾病，由于脑中不受控制的电活动，使人易于复发性无故发作。每年，有约15万美国人被诊断出患有这种中枢神经系统疾病。一生中，26人中有1人被诊断患有癫痫。癫痫的病因很多，并非所有发作都被认为是癫痫，因为还有许多其它的脑紊乱和损伤会促进发作活动。发作的四种最常见原因是头部创伤、卒中、脑肿瘤和脑感染。其它原因包括神经剂毒性、药物作用或中毒、遗传和代谢紊乱。

TBI是普通人群中多达20％的癫痫的病因。创伤后发作(PTS)和创伤后癫痫(PTE)是使功能预后显著恶化的创伤性脑损伤(TBI)引起的并发症。据估计，每年有170万美国人遭受轻度至重度的创伤性脑损伤(TBI)，并且在美国，这还不算有约360,000名参与战斗行动的士兵和幸免于恐怖袭击的公共安全工作人员出现继发于爆炸(震荡)冲击的TBI。创伤性脑损伤后癫痫的风险范围为从轻度损伤的1.5至严重损伤(包括硬膜下血肿、颅骨骨折、意识丧失或健忘症1天或更久)后和65岁以上的17.2。穿透性头部损伤的患者在受伤后数十年有高风险出现PTE，并且80,000至90,000美国人遭受TBI引起的长期残疾。

CNS感染也是癫痫的主要危险因素。多种CNS感染，包括细菌(脑膜炎、结核病)、病毒(例如单纯疱疹、HHV-6、HIV)、寄生虫(例如脑弓形虫病、疟疾)、真菌(例如念珠菌病、球孢子菌病、曲霉病)和朊病毒感染，可导致癫痫持续状态。30％至50％的HSV-1脑炎个体会发展为发作，并且微小RNA病毒科的病毒(例如肠病毒、柯萨奇病毒A和B、parechoviruses和艾柯病毒(echoviruses)已经与热性惊厥(febrile seizure)相关联。肠病毒是儿童病毒性脑炎的主要原因，可导致严重的发作。CNS感染与脑部炎症有关，并且任何原因的脑部炎症都有发作的风险。

暴露于有机磷(OP)神经剂(NA)也导致脑损伤和炎症状态，其诱发癫痫持续状态(SE)疾病，引起可能导致死亡的发作的脑损伤性级联。SE的特征在于多次或长时间的发作，并伴有以小胶质细胞和星形胶质细胞的激活以及明显增加的脑促炎调节因子(包括趋化因子和细胞因子)水平为特征的快速且持续的神经炎性反应(1、2)。神经炎症在OP神经剂的发病机理中起关键作用，后者通常会导致永久性脑损伤。

在非致死性暴露中，癫痫持续状态(SE)可能引起发作相关的脑损伤，导致持续的认知和行为缺陷，包括抑郁症，以及睡眠觉醒障碍、感觉运动相关合并症，并伴有减少的神经发生。

当前用于神经剂诱导的暴露(阿托品、肟和大剂量苯二氮卓类)的暴露后治疗是不足的，并且仅在暴露后数分钟内施用才有效。幸存者即使接受治疗，也经常遭受长期的不良作用，包括记忆力的轻度至重度下降和行为改变、情感障碍和复发性发作。目前尚无任何治疗NA暴露引起的神经变性后遗症的药物，并且对于具有高度难治性、复发性或地西泮抗性发作的急性神经毒剂中毒幸存者，仍然有显著的治疗需求。

癫痫是指由脑中的阵发性过度神经元放电引起的许多类型的复发性发作；两种主要的全身性发作是：癫痫小发作(petit mal)，其与肌阵挛性抽搐、无动性发作、暂时性意识丧失有关，但是没有惊厥；和癫痫大发作(grand mal)，其表现为伴有意识丧失的连续发作和惊厥。任何引起脑生理的结构或功能紊乱的因素都可能导致发作，并且反复发作事件可能被标记为“癫痫”。

发作疾病的主要治疗是长期坚持施用抗惊厥药物，并且今天许多这样的药物是众所周知的。多种抗癫痫药(例如苯妥英、苯巴比妥、卡马西平和丙戊酸)对预防早期PTS有效，但对晚期PTS或PTE无效。不幸的是，尽管有许多可用的药物治疗剂，但是相当大比例的患有癫痫或相关疾病的人群的管理依然不良。此外，目前没有可用的药物能够实现完全发作控制，也不能治疗发作活动背后的病因(即急性和持续性炎症)，并且大多数具有不利的副作用，这限制了它们的使用。

详细说明

本发明涉及用于治疗或预防癫痫或发作的组合物，以及用于在动物中，例如人或其他哺乳动物中，特别是在脑中，调节(特别是降低)由于损伤、创伤或感染引起的过度免疫反应方法，该损伤、创伤或感染导致先天性免疫炎性通路的激活，引起过度的细胞因子、趋化因子和TLR4/MyD88受体激活，从而导致发作、正常功能丧失、神经元损失、认知障碍和甚至死亡。

越来越多的数据表明，适应性免疫系统通路和先天性免疫系统通路直接参与癫痫发生的致病机制(3)，并且炎症反过来又影响发作和发作相关神经元死亡的发生和严重程度。支持先天性免疫炎性反应在发作活动的癫痫、神经变性和认知病理中作为病因的作用，在患有颞叶癫痫(TLE)的人的血清中(4)以及患有难治性癫痫的人的切除脑组织中(5)，检测到了升高的IL-1、TNFα和IL-6。在暴露于OP剂的动物中，在皮质和海马中具有显著升高的IL-1、TNF、IL-6、前列腺素E2和趋化因子(CCL2、CCL3、CCL5)，升高持续数天(6)。

脂多糖(LPS)的海马输注在具有升高的IL1β、TNFα和神经元一氧化氮合酶表达的大鼠中诱导了癫痫发作(7)，表明TLR4/MyD88先天免疫通路是急性发作活动的诱导剂。甚至在小鼠出生后早期全身性暴露于炎症刺激性LPS也会引起星形胶质细胞、小胶质细胞的脑激活，并促进兴奋性突触的发育，导致以MyD88依赖性的方式增强发作的易感性(8)。因此，早期发育炎症损伤可导致对发作发生的终生易感性。在星形胶质细胞中缺失MyD88或抑制Erk1/2拯救了LPS诱导的发育异常，表明这些通路可以成为抗癫痫药物干预的有效靶点。

在上述发作和癫痫的神经炎性过程中，外周炎性刺激也可以影响发作倾向，并且趋化因子可能在白细胞向脑的迁移中起作用。趋化因子MCP-1(CCL2)是药物耐受性癫痫患者中最升高的炎性调节因子之一，并且CCL2具有促惊厥作用(9)。在慢性癫痫动物中脑内施用抗CCL2抗体消除了LPS介导的发作增强。这些结果表明，CCL2是联系外周炎症与神经元过度兴奋的分子通路中的关键调节因子，并证明了CCL2及其受体CCR2在发作控制中的关键作用。

由于头部受伤而引起的皮质挫伤会引起兴奋性神经递质(谷氨酸、乙酰胆碱和天冬氨酸)的释放，其产生可以杀死神经元并引起发作的自由基和兴奋性毒性。谷氨酸类似物海人酸(kainic acid，KA)被实验性地用于在大鼠中引起发作相关脑损伤模型，其非常类似于在人癫痫中观察到的。

基于腹膜内KA施用的实验大鼠模型显示，诱发的发作提高了微血管中CCR5配体MIP-1α(CCL3)和RANTES(CCL5)的表达，并增加CCR5+细胞的脑浸润，这是与海马中的神经元损失、炎症和神经胶质增生相关的作用(10)。CCL5促进了兴奋性神经递质天冬氨酸从小鼠突触小体的释放，这是促发作作用，其被DAPTA(11)、CCR2/CCR5双受体拮抗剂(12)阻断。降低的CCR5强烈保护免受兴奋性毒素引起的发作、BBB渗漏、CNS损伤、炎症，并且促进神经源性修复(10)。

已知IL-1b、IL-6和TNFα是在对神经剂毒性、CNS应激和损伤的急性期反应期间上调的主要细胞因子。TNFα和其它炎性细胞因子的释放加剧了神经胶质细胞的激活和以下生理反应：Th1切换为Th2周期，以及促进神经胶质增生，抑制星形细胞谷氨酸摄取并诱导凋亡，特别是在少突胶质细胞中，从而促进了损伤性脱髓鞘。在创伤性CNS损伤的早期阶段抑制TNFα和其它炎性激活因子的作用的能力可能产生有益的临床结果，以阻止或限制发作的风险。

对与脑损伤有关的发作中这些受体靶标的进一步支持来自以下报道：阻断CCR2/CCR5在卒中(13,14)和创伤性脑损伤(TBI)(15)中具有保护作用，其中双重CCR2/5拮抗剂显著改善了老年TBI动物中损伤诱导的后遗症。

这些发现表明，通过阻断细胞因子的产生、趋化因子的释放、MyD88通路的激活、抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活、外周单核细胞向脑的浸润以及防止趋化因子介导的兴奋性氨基酸释放来治疗潜在的先天性免疫炎症将提供一系列独特的治疗效果，从而在各种起源的发作和癫痫病症中产生新的治疗机会(16)。

DAPTA和本发明的肽阻断趋化因子受体CCR2和CCR5并使细胞因子平衡从炎症(M1)转变为修复(M2)反应(12、17、18)，部分地是通过阻断转录因子NFkB(19)和STAT3(20)。在5名患有HIV的受试个体中，DAPTA特异性降低细胞因子TNFα、IL-1、6和8，并且升高IL-4、10和13(18)(表1)。降低的TNFα、IL-1、6和8以及转移至IL-4、IL-10反应在TBI中具有神经保护作用并提高了生存率(21、22)。

DAPTA和本发明的相关类似物具有有用且新颖的作用，因为它们不仅是“炎症拮抗剂”，而且它们具有更细微差别的作用以使细胞因子谱从“M1”状态转变至“M2”状态(表1)，这在神经变性疾病中具有独特的有益治疗作用(23)。预期这种作用在脑损伤中具有益处并且在人中具有抗发作作用。更广泛地讲，通过转变在神经变性疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和多发性硬化症(MS)中起重要作用的脑小胶质细胞的细胞因子谱(M1至M2)(23)，本发明的肽将在这些和其它神经变性疾病中提供治疗益处。

在特定的实施方案中，本发明涉及预防或治疗与经由细胞因子、趋化因子和toll受体/MyD88炎性通路发生的脑损伤后发生的慢性免疫激活相关的神经元损伤、神经元损失和神经元过度兴奋。一个具体的实施方案是包含抗惊厥有效量的根据本发明的肽的治疗组合物。

本发明还涉及与认知能力的增强或改善相关或抵消认知能力下降的化合物、组合物和疾病治疗方法，以使其更类似于年龄匹配的正常、未受损的受试者中的功能。在本发明的一个实施方案中，人具有增强的正常认知功能。在另一个实施方案中，人表现出与由于神经炎症而引起的脑损伤有关的认知障碍，例如在衰老中发生，其得到了改善。

在又一个实施方案中，可以改善患有认知障碍的人，该认知障碍与例如以下的疾病或病症相关：阿尔茨海默病、轻度认知障碍(MCI)、自闭症、阅读障碍、注意力缺陷多动障碍、强迫症、精神病、双相障碍、抑郁症、妥瑞综合征(Tourette's syndrome)以及儿童、青少年和成人的学习障碍、年龄相关的记忆障碍、年龄相关的认知能力下降、帕金森病、唐氏综合征、创伤性脑损伤、神经-AIDS、亨廷顿病、进行性核上性麻痹(PSP)、HIV、卒中、血管疾病、Pick's或Creutzfeldt-Jacob疾病、多发性硬化症(MS)、其它白质疾病、精神分裂症和药物引起的认知恶化。

在临床前动物模型中，DAPTA和根据本发明的肽防止了衰老引起的神经元损失，并阻断了活化的小胶质细胞介导的神经毒性以及与认知能力下降有关的细胞因子和趋化因子的释放。在人中，DAPTA改善神经-AIDS中的认知、信息处理速度和功能性脑成像(24、25)。因此，相信由于共有的神经变性炎性机制，本发明的化合物具有在指定病症中改善认知障碍的强大潜力。

运动障碍是一组通常涉及基底神经节的疾病，其中发生不需要的多余运动。基底神经节中的缺陷可能会导致活跃、抽搐、无目的的运动，类似于随意运动的片段。运动障碍可包括以下的任意组合：非自愿、快速、随机不规则的抽搐运动(舞蹈症)；相对缓慢扭动运动，似乎彼此融合(手足徐动症)；具有重复、弯曲、模式化运动和扭曲姿势的肌肉张力增加(肌张力障碍)；以及臂、腿或两者的无法控制的猛动运动(投掷症)。

原发性运动障碍发生在许多不同的疾病中。西德纳姆舞蹈症(Sydenham'schorea)是通常与毒性或感染性疾病有关的疾病，表观上引起纹状体暂时性功能障碍，并通常影响儿童。亨廷顿舞蹈症(HD)是显性遗传疾病，其开始于中年，并导致受影响个体的智力退化和纹状体进行性变性。脑性瘫痪是一个通用术语，指的是由数种类型的脑损伤引起的运动功能或协调能力的缺陷，其可能是由于异常的脑发育或与出生相关的损伤引起。脑性瘫痪的某些症状(例如手足徐动症)与基底神经节功能障碍有关。

在多种疾病中观察到继发性运动障碍，作为继发性症状(头部损失、多发性硬化症)或作为药物治疗的结果。帕金森病(PD)的特征是肌肉僵硬、面部表情丧失、震颤、缓慢曳行步态以及一般缺乏运动，其由黑质功能障碍引起。帕金森病中增加的肌肉僵硬是由于黑质对某些基底神经节的不良抑制所致。运动障碍最常见的类型是舞蹈症和肌张力障碍，并且这些通常混合在一起。对亨廷顿舞蹈症的研究表明了改变的免疫应答，具有活化的小胶质细胞以及IFNα、IL-10、IL-8和IL-1β的分泌(26)，确定了运动障碍中可以用本发明的肽进行正常化的特定免疫病理学靶标。

在又一个实施方案中，患有头痛的人可能受益，因为疼痛可能具有炎性原因(炎性头痛)。血管性头痛的最常见类型是偏头痛。在偏头痛之后，血管性头痛的最常见类型是发烧引起的头痛。肺炎、麻疹、腮腺炎和扁桃体炎是可以引起严重中毒性血管性头痛的疾病。体内外来化学物质的存在也可能导致中毒性头痛。其它类型的血管性头痛包括“丛集性”，其可导致剧烈疼痛的反复发作和因血压升高而引起的头痛。相信根据本发明的化合物具有在指定病症中改善头痛的强大潜力，这是因为癫痫药物在这些病症中的功效，以及显示了发作倾向的炎症刺激的最近研究。

本发明还涉及一类肽化合物用于治疗与过度兴奋有关的疾病，例如与可过度兴奋组织有关的疾病，并且还可能与离子通道(例如谷氨酸-NMDA受体)的功能障碍有关的疾病的用途。过度兴奋被定义为中枢或外周神经系统神经元对突触输入的反应性的异常增加，并且可能是由病理生理性炎症事件引起的。与过度兴奋有关的疾病的实例是通道病、肌张力障碍、肌强直、肌无力、共济失调、长QT综合征以及焦虑和应激疾病。

本发明化合物的作用方式不同于用于治疗过度兴奋的常用药物，后者通常影响离子通道以影响信号在可兴奋组织中的传播。相反，本发明的肽阻断趋化因子的作用，趋化因子促进释放促进癫痫发生的兴奋性神经递质(27)。

动物模型中支持的与本发明有关的DAPTA抗炎益处的一些实例包括创伤性脑损伤(28)，多种起源的神经病(29、30)，包括糖尿病性神经病，阻断神经毒性兴奋性毒素的释放(11)并从卒中/脑缺血中恢复(14)。由于脑损伤后具有致癫痫活性的常见炎性机制，使用DAPTA或主题全-D-肽在这些和其它病症中可能是有益的治疗。

公开的实施方案教导了如何制备五至二十个氨基酸的小受体活性肽的通用方法，所述肽在许多导致发作和癫痫风险增加的病症中通过转变细胞因子平衡来减轻炎性反应。这些包括：脑损伤、神经剂暴露、阿尔茨海默病、颅内出血、脑肿瘤、卒中、自闭症、先天性疾病(例如唐氏综合症、安格曼综合征、结节性硬化症、神经纤维瘤病或病因不明的遗传形式)，病毒、细菌、真菌或其它感染；并且尤其是可能以机会性方式表现出感染的任何疾病，例如在抗病毒或免疫抑制治疗期间，或在存在免疫抑制状态的任何情况下，或在免疫重建炎症综合征中。

建立经口生物利用度的方法

肽设计领域的技术人员理解，绝大多数情况下对肽主链的修饰(包括D-氨基酸的替换，特别是在肽中受体活性位点)会引起活性的损失，并且在一些修饰中会完全无活性。实际上，采用D-氨基酸替换通常用于通过功能损失来鉴定肽中的关键药效团残基。

因此，本发明的出乎意料且非显而易见的方面是全-D氨基酸在制备靶向手性分子(例如细胞表面GPCR受体)的经口生物活性肽中的用途。对治疗性蛋白质和多肽的经口递送的最新综述(31)指出：“尽管进行了广泛的研究努力，但治疗性肽或蛋白质的经口递送仍是制药行业和研究人员的挑战。因此，由于肽在体内表现出的短循环半衰期，其需要频繁施用，导致治疗费用增加和患者依从性降低”，并且在许多情况下甚至不可能经口递送。通常，蛋白质和肽类药物会因胃介质的低pH环境或胃肠道中的水解酶而迅速变性或降解，并且经口施用是通常难以用受体靶向肽实现的优选途径。

受体处配体作用的手性选择性不足为奇，并且被充分理解为酶学的原理。例如，在大多数NSAID(非甾体类抗炎药)中发现了手性特异性。对于NSAID，具有S构型的对映异构体几乎仅具有抑制前列腺素活性的能力。NSAID的R对映体具有差的COX抑制活性(32)。阿片受体是显示配体立体选择性的G蛋白偶联受体的一个实例，其中左啡诺(levorphanol)是消旋混合物消旋吗啡的活性止痛成分，而其立体异构体右啡烷(dextrorphan)则无活性。

存在全-D-肽活性的一些实例，例如抗微生物人θ-防御素，其是破坏细菌(而不是哺乳动物)细胞膜的阳离子肽。阳离子肽对膜没有立体选择性的生物相互作用。防御素活性源自膜的电荷破坏。这不同于靶向立体特异性细胞表面受体并且对配体构象和形状高度敏感的本发明肽的作用。

考虑到表明线性肽ASTTTNYT(SEQ ID NO:14)中D对L的替换可引起效力极大损失的较早研究Pert(33)图3和图4以及相关的US 5276016，受体活性全-D肽的生物活性是本发明的未曾预料且非显而易见的方面。

在DAPTA中的特定第1位具有一个D替换(D-ala)保留了受体效力，主要是因为肽的该残基对于生物活性不是必需的，确实可以被完全去除。然而，末端五肽负责生物效力，并且这些残基的D氨基酸修饰不能很好地耐受。

因此，在DAPTA中在活性所需的末端五肽中在第8位进行另外的D替换(D-Thr)导致活性损失99％至99.9％。因此表明不能以一般方式引入L至D替换，并且这些修饰可能并且通常确实通过破坏受体效力所需的肽结构来破坏生物效力。

这一点在Brenneman,1988(34)特别参考肽TTNYT(SEQ ID NO:1)进一步进行。参见图2和表1。在第4位(Tyr)上进行L至D替换后，该肽完全失去活性。

肽TTNYT(SEQ ID NO:1)和L至D替换的详细研究公开于Smith,1988(35)，参见图3。在每个位置1、2、3、4中引入单个L至D替换导致效力损失，并且所有D-氨基酸替换具有显著降低的活性(50x)至完全无活性。

考虑到制备激素的全-D肽的Stewart和Woolley(36)的长期接受的技术，全-D肽将保留显著的效力的观点是更加新颖的。例如，在他们的文章中，“与单个残基的变化相反，发现在具有MSH激素活性的五肽中的所有氨基酸残基的转化导致激素活性损失……”

在文章中，作者进一步写道：“由于尚无用于预测制备肽的抗代谢物所需的结构要求的一般方法，因此我们合成了全-D缓激肽(注意是9个氨基酸，大小与Andersen的8个氨基酸的式1肽相似)，目的是找出肽中所有氨基酸的转化是否可能是用于肽拮抗剂合成的普遍适用方法。”

作者然后得出结论：“高达缓激肽标准挑战50,000倍的全-D-缓激肽的量未显示出对缓激肽响应的任何抑制或任何缓激肽样作用。因此，似乎所有氨基酸残基的转化可能不是用于形成生物活性肽抗代谢物的普遍适用方法”。

Michaelis和Trigg(US 5,798,335)要求保护在一些但不是全部位置中引入了D-氨基酸的DAPTA的修饰类似物。Andersen等人(US 6011014和US 6,265,374)还要求保护使用DAPTA和在一些但不是全部位置中引入了D-氨基酸的DAPTA的修饰类似物来治疗炎症和多发性硬化症。没有提出或提供将任何全-D-氨基酸修饰的肽简化至实践，并且没有说明要求保护的使用全-D-氨基酸五肽的益处或治疗用途的实例。在这些现有申请中，没有要求保护本发明的SEQ ID NO:1-13的全-D-肽。

然而，在所有位置进行D对L氨基酸的替换的能力创造了制备经口稳定的肽化合物的可能性。由于消化酶，肽在靶组织中的稳定性限制了其广泛的用途。产生保留效力的全-D肽的能力是产生肽SEQ ID NO:1-13和可能对蛋白质水解稳定同时保留了生物效力的其它肽的出乎意料的一般方法，因此这些肽受益于增强的稳定性。

因此，首先在八肽肽T(ASTTTNYT)(SEQ ID NO:14)中使用D-氨基酸来产生类似物DAPTA(Dala1-肽T-酰胺)的Pert等人(US US 5276016)、或Michaelis和Trigg(US5,798,335)或Andersen等人(US 6011014和US6,265,374)均未教导在肽T或DAPTA中将所有天然存在的L-氨基酸替换为D-氨基酸。

不能推断Michaelis和Trigg或Andersen等人要求保护的在“每个”位置使用D替换意味着是在“所有”位置，并且在所有情况下没有简化为本发明中的实践。Brennemen，1998(34)和Smith，1988(35)的数据表明，在任何情况下，序列ID 1中D对L氨基酸的替换都没有实现与全-L形式可比较的效力，反而，D替换导致位置依赖性方式的活力损失，有时完全丧失生物效力。

因此，不能说使所有氨基酸成为D形式是显而易见的。来自现有公开技术的与本发明的肽有关的具体事实告知了完全相反的观点，即制备全-D肽作为靶向先天免疫系统G蛋白偶联受体(例如趋化因子受体)的抗炎剂不是有效的。

这种类型的结构-功能分析是药物设计的关键，并且在每种情况下必须通过实验确定。我们认识到包含全-D-氨基酸的DAPTA的五肽片段(序列ID 1)保留了实质的效力，使我们确定在特定的趋化因子受体功能测试中，其它五肽作为全-D-氨基酸形式保留了活性。

在US12/688,862中首次公开了使用与SEQ ID NO:1相关的包含全-D-氨基酸的肽(其保留了实质的生物效力)来阻断CCR5受体，但是没有能够进行或要求保护经口使用，并且没有任何在先公开(包括申请号:US13/024324)确定了用于治疗因脑损伤、NA暴露或任何原因引起的癫痫、发作、运动障碍或头痛的用途。

先前已经提出本发明的肽(全-D-TTNYT)(SEQ ID NO:1)可有效调节由CCR5受体引起的炎症(申请号：12/688,862,US 2010/0184705 A1)。已经公开了通过靶向CCR5、CCR2和CX3CR1趋化因子受体来减轻周围神经病的疼痛的进一步用途(13/024324)。这些申请都没有教导在预防发作、癫痫、运动障碍或头痛中的用途。在先专利US 5,248,667教导通过使用肽“DAPTA”和相关的D肽治疗银屑病的方法，但不是全-D组成的肽。

经口递送解决了肽的另一个常见问题，即倾向于在液体溶液中聚集并失去生物效力，因为肽可以以具有较长保存期限的固体形式(例如经口丸剂)复合。

增强液体溶液稳定性的方法

在一些情况下，可能需要液体制剂，例如在无意识的人中通过注射使用。在那种情况下，必须采用限制肽在溶液中聚集的方法。这种改善可以通过添加己醛糖(aldohexose)系列碳水化合物的糖单体(例如D-甘露糖)来实现，并且有效浓度为20mg/ml，但是其它浓度也是有效的。通过添加芳族醇可以实现额外的抗聚集性。苄基与主题肽的酪氨酸部分相互作用，以防止其彼此“堆积”并防止肽溶液聚集。芳族醇的实例是苄醇，其通常在静脉内药物中用作抑菌防腐剂。其在这里的用途是防止肽聚集。0.5％的苄醇浓度是有用的，但是其它浓度也是有效的。甘露糖和苄醇的组合作为优选的实施方案是特别有效的，以稳定主题肽的水性药物组合物并防止其在液体溶液储存时聚集。这样的改善允许在不能摄取经口丸剂的人中通过肠胃外施用来紧急救援使用这些肽，或用作液体鼻喷雾剂。

增强进入脑的方法

水溶性肽(例如本发明的那些)通常不能通过脑毛细血管壁即血脑屏障(BBB)而被运输。嵌合肽可以通过BBB而被运输，并且是通过不可运输的肽(例如β-内啡肽)与可运输的肽载体(例如阳离子化白蛋白)的共价偶联形成的。用于本发明的肽的更简单的方法是通过在生理pH下中和末端COOH部分的电荷来直接使肽“阳离子化”。因此，可以对主题肽进行修饰，例如酯化、糖基化或酰胺化，以增强其组织分布，特别是通过在6至8范围的生理pH下对肽进行电荷阳离子化来进入脑。先前，Pert等人(US US 5276016)引入了末端酰胺修饰，以提供使DAPTA免于羧肽酶降解的保护，并且其他人(包括Michaelis和Trigg或Andersen等人)也采用了这种原理。这不是这里的功能，因为序列ID1已完全受到保护免于降解，并且不需要末端酰胺(-NH2)、酯或糖基部分来阻断蛋白酶并赋予抗降解性。与本发明的酰胺化肽有关的现有技术都没有要求保护或公开在组织分布或进入脑中的任何改善。本发明的另一新颖性质涉及通过酯化、糖基化或酰胺化实现的“阳离子化”肽的提高的组织分布和进入脑。因此，这样的修饰通过增强其从循环中流出并递送到靶组织而提供了对本发明特定肽的额外和新的改善。

增强肽半衰期和生物利用度的方法

体内肽的快速肾清除限制了疾病的治疗，其需要恒定受体靶向，而这可以通过更长的肽半衰期来实现。延长肽循环时间的一种方法是通过将肽配体与长寿的血清蛋白质白蛋白结合实现的。用脂肪酸酰化是延迟肽清除的最成功策略。肉豆蔻酸或棕榈酸与胰岛素和GLP-1的连接导致产生了每日用酰化肽药物。脂肪酸与短线性肽的组合已被用于产生能够以增加的亲和力结合白蛋白的肽-脂肪酸嵌合体，并将消除半衰期延长了约25倍(Zorzi等人,2017)。

根据该策略，我们建议本发明的肽可以通过酰化修饰，例如通过连接肉豆蔻酸或棕榈酸，并且在一些情况下通过向肽添加N-末端甘氨酸。一个例子是Myr-GTTNYT(SEQ IDNO:15)或Myr-GTTNYT-NH₂(SEQ ID NO:15)形式的肽。这样的配体将具有延长的消除半衰期和增强的组织递送。使用脂肪酸与如Zorzi等人所述的短线性肽“标签”的组合将具有甚至更长的消除半衰期。

通过本发明中公开的多重组合改善，具体地：1)治疗发作、癫痫、运动障碍或头痛，2)通过使用出乎意料保留受体生物效力的全-D氨基酸修饰实现经口生物利用度，3)与DAPTA相比减小了尺寸(五肽与八肽相比)，以简化制造和成本，以及在一些用途中4)肽的“阳离子化”，使得C末端羧酸可以被酯化、糖基化或酰胺化以进一步增强组织分布，以及5)酰化以延长治疗半衰期，可将肽施用于寻求改善过度炎症(例如癫痫、发作和脑损伤)的个体，本发明产生了有效的组合物，其提供了期望且新颖的治疗益处。

其它活性化合物

申请人认为，包含全-D-氨基酸的其它五肽将是有效的，包括以下肽：SSTYR、STNYT、TTSYT、NTSYG、ETWYS、NTSYR、INNYT、IDNYT、TDNYT、TDSYS、TNSYR和NTRYR(分别为SEQID NO 2–13)以及八肽ASTTTNYT(SEQ ID NO:14)。

根据本发明的第一方面，提供了SEQ ID NO:1的线性肽的用途，其中所有氨基酸均为D-立体异构构型：

序列ID 1：A-B-C-D-E，其中：

A是Ser、Thr、Asn、Glu、Arg、Ile、Leu，

B是Ser、Thr、Asp、Asn，

C是Thr、Ser、Asn、Arg、Gln、Lys、Trp，

D是Tyr，并且

E His Thr、Ser、Arg、Gly。

E的候选物可以被酯化、糖基化或酰胺化。

肽或肽制剂可单独使用或与任何其它药物活性化合物或辅料组合使用，以治疗癫痫、发作和脑损伤的炎症。有用的药物组合物可包含本发明的肽和至少一种另外的用于预防、减轻或/和治疗发作的化合物，其中与单独给予的各个化合物的作用相比，该组合物在预防、减轻或/和治疗癫痫发作中的作用是协同的。组合物的实例是肽与拉西(racetam)、拉科酰胺(lacosamide)、二苯并氮卓(dibenzazepine)、氨基磺酸盐、苯妥英或巴比妥盐。

肽可经口、经颊、肠胃外、局部、直肠、阴道、通过鼻内吸入喷雾、通过肺内吸入或以其它方式施用。特别地，根据本发明的肽可以被配制成丸剂用于经口施用、控释制剂、用于注射(例如皮下、肌肉内、静脉内、关节内或脑池内注射)、用于输注，并且可以以单位剂量形式提供于安瓿或片剂、或者多剂量小瓶或具有添加的防腐剂的其它容器中。组合物可以采取诸如混悬剂、溶液剂或乳剂或凝胶剂的形式，并且可以包含诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。或者，活性成分可以是粉末和/或冻干形式，以直接施用或在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原的水、生理盐水或5％右旋糖)配制。包含肽的药物组合物还可以包含其它活性成分，例如抗微生物剂或防腐剂，并且在丸剂的情况下，粘合剂和填充剂，可能是定时释放形式。组合物可包含0.001-99％(w/v或优选w/w)的活性物质。

组合物以治疗或预防有效剂量施用，即每天0.05-1000mg肽，特别是每天5-250mg。可以使用非常大的剂量，因为根据本发明的肽是无毒的。但是，通常这是不需要的。当然，每天施用的剂量取决于炎症和炎性反应的程度。

通过注射或输注施用组合物以治疗约70kg体重的成年人通常为2-250mg活性物质，其可以以每天1至4个剂量的形式施用。

本发明将用于预防或治疗疾病或医学病症，特别是涉及脑部炎症的那些，例如癫痫、发作、脑损伤、卒中、脊髓损伤、神经病、认知能力下降、阿尔茨海默病、帕金森病、神经-AIDS、痴呆症、双相障碍和抑郁症，以及具有潜在的炎性发病机理的其它疾病，例如眼中的葡萄膜炎和黄斑变性，肠炎性疾病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、引起“肠漏(leakybowel)”的失调，以及皮肤炎性疾病，例如银屑病、酒渣鼻、湿疹、皮炎或口腔牙周炎，以及与代谢和内分泌障碍相关的全身性炎症，尤其是肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和动脉粥样硬化。

本发明的肽可用于控制所谓的癌症“检查点抑制剂”(如抗CTLA-4抗体)的免疫相关不良事件(irAE)或用于免疫重建炎症综合征，如停止使用免疫抑制疗法如那他珠单抗(针对alpha-4(α4)整联蛋白的人源化单克隆抗体)时可能发生的。

在慢性炎症中，大量的能量消耗通路开始，导致内分泌和激素变化，例如胰岛素/IGF-1抗性、低雄激素血症(hypoandrogenemia)、低维生素D(hypovitaminosis D)、轻度高皮质醇血症以及交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统活动增加，其导致死亡率增加。

如本文所述，所有这些看似完全不同的病症共有特定先天免疫通路的激活，其可以被本发明所调节或抑制。

可以通过以下非限制性实施例来说明本发明。

为了检验以下假设：可以产生保留受体活性的全-D肽，其可用于例如可能在损伤后脑中或身体其它部位中发生的炎性病症，我们首先使用分子和细胞方法来探索分离的未成熟人单核细胞衍生的未成熟树突细胞(iDC)中的炎性反应。DC源自分化的未成熟单核细胞，并充当肝、脑、皮肤和其它组织的先天性和适应性抗原呈递细胞。脑DC被称为小胶质细胞，并且这些前哨细胞的激活是宿主对触发炎症级联的损伤和病原体的早期反应。

为了确定全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)是否阻断抗原呈递树突细胞的成熟，通过Ficoll-Paque离心从外周血中分离人PBMC，然后使用免疫珠(Miltenyi)通过负选择分离单核细胞。然后通过用GM-CSF/IL4处理单核细胞来产生人单核细胞衍生的未成熟树突细胞(iDC)。

用10-12M的全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)(通用名称RAP103(12))处理iDC 30分钟。30分钟后，将LPS(100ng/ml)添加至细胞，并在48小时后通过流式细胞术使用荧光标记的抗体分析细胞的表面成熟标志物。图1中显示的是在有或没有添加的全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)的情况下通过TLR4/MyD88激活(LPS)诱导的CD86、HLA-DR、CD58(粘附分子)和ICAM1(粘附分子)表达的结果。

在脑中，TLR4由所有实质细胞和非实质细胞类型表达，并且促进由多种病因引起的组织损伤。TLR4激活导致激酶激活(ERK1/2、p38、TBK1)、转录因子激活(NFκB、IRF3)和促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)的转录增加，并且所有这些通路都与癫痫发生和发作活动有关(4、9、16、37、38)。还认为该免疫信号传导级联在神经变性和可通过本发明肽治疗的其它脑损伤后遗症中起重要作用。

如在图1A-D中看到的，用全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)预处理细胞降低了图中列出的所有TLR4刺激的成熟标志物的表达。这些表面分子控制T细胞激活和在组织中的定位。小胶质细胞是脑的抗原呈递DC。阻断通过TLR4/MyD88的DC/小胶质细胞成熟和激活，可以抑制发作、癫痫、脑损伤和认知能力下降中的炎症。

我们的结果表明，通过用全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)对细胞进行预处理降低了通过TLR4/MyD88激活(LPS)刺激时的成熟标志物CD86、HLA-DR、CD58(粘附分子)和ICAM1(粘附分子)。这些成熟标志物的表达在组织损伤、神经元毒性、抗原识别、小胶质细胞激活以及细胞因子和趋化因子释放的背景下介导免疫细胞运输和免疫应答中是众所周知的。

然而，全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)对由与胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合的抗微生物肽LL37引起的这四种标志物的DC成熟没有影响(未显示)。因此，全-D-TTNYT(SEQID NO:1)的作用显示出对TLR4/MyD88的特异性。

TLR4信号传导发生在脑的细胞中，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和甚至神经元中，并且这样的信号传导介导了导致神经毒性、SE和发作活动的炎性表型。抑制DC的成熟对败血性休克具有益处，败血性休克也可以促进发作活动或TNF水平升高的其它病症。我们得出结论，全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)和相关类似物可以通过调节脑中抗原呈递树突细胞(小胶质细胞)的激活对发作、癫痫、脑损伤、过度兴奋、运动障碍和认知能力下降产生有益作用。在其它树突细胞中，例如肝Kuppfer细胞或皮肤Langerhans细胞中，这些肽可以减轻非酒精性脂肪性肝炎或银屑病背后的炎症，以引述一些实例。

图2显示了全-D[TTNYT(SEQ ID NO:1)](通用名称RAP-103)是CCR5和CCR2人单核细胞趋化性的双重拮抗剂。用指定剂量的RAP-103处理单核细胞30分钟，然后进行针对人CCL2(MCP-1)或CCL4(MIP-1β)(两者均为50ng/mL)的趋化性持续90分钟。数据(趋化指数)表示为平均值±SEM。没有RAP-103的MCP-1的趋化指数是对照的2.5-3.5倍，而没有RAP-103的MIP-1的趋化指数是对照的约2倍。数据表示为平均值±SEM。(*P<0.05，**P<0.01，相对于未经RAP-103处理)。数据来自(12)，图1。结果显示了这些肽的进一步有用作用，因为阻断CCR2/CCR5在发作、癫痫、脑损伤和认知能力下降中是有益的。双趋化因子CCR2/CCR5受体拮抗剂可通过阻断多种炎症通路而具有额外的治疗价值。

图3显示了DAPTA相关五肽的全-D形式的三个另外的实例：全-D-SSTYR(SEQ IDNO:2)，全-D-TTSYT(SEQ ID NO:4)和全-D-NTSYR(SEQ ID NO:7)，其是CCL2人单核细胞趋化性的类似拮抗剂，并且预期在发作、癫痫、脑损伤和认知能力下降的炎性病因中提供益处。所采用的方法类似于图2中的那些。

图4显示了在啮齿动物的炎症损伤模型中趋化因子CCL2和CCL3、趋化因子受体CCR2和CCR5以及细胞因子IL-1和TNFα的降低。具体的实验细节在Padi,2012(12)中提供。Dala1-肽T-酰胺和全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)共有受体靶标和生物学作用，表明它们是靶向相同病理过程的类似物。因此，预期我们所描述的所有DAPTA相关肽共有相同的作用、益处和治疗机制，如从结构相关类似物预期的。表1总结了与癫痫、发作和脑损伤相关的靶生物分子。

与预防癫痫或发作或一般脑损伤中的炎症相关的主题肽的进一步作用是降低疾病过程背后的炎性细胞因子、趋化因子及其受体的能力。表1说明Dala1-肽T-酰胺(DAPTA)降低了人中炎性细胞因子水平。该作用是向神经损伤大鼠通过灌胃(oral gavage)(0.05-1mg/kg)施用7天的五肽全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)(RAP-103)共有的，所述小鼠还显示出癫痫、发作和脑损伤中鉴定的关键生物标志物的减少。

表1.DAPTA和全-D-TTNYT(SEQ ID NO:1)的生物标志物变化的总结

¹SEQ ID NO：1

本发明的主要应用是用于控制和预防与脑损伤、癫痫或其它中枢神经系统疾病有关的发作，其潜在的致病机理与经由趋化因子CCR2和CCR5、TLR4和细胞因子通路的持续炎症有关，所有这些被主题肽减弱。

可以激活巨噬细胞以表达与选择的生物标志物有关的多种功能表型，通常被称为经典火活化和替代活化，也称为M1和M2。

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序列表

<110> 创新生物肽有限公司（Creative Bio-Peptides Inc.）

迈克尔·鲁夫（Ruff, MIchael）

<120> 治疗癫痫、发作和CNS疾病的经口抗炎肽

<130> 460.021

<140> US 16/038,144

<141> 2018-07-17

<150> US 62/533,854

<151> 2017-07-18

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 1

Thr Thr Asn Tyr Thr

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 2

Ser Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 3

Ser Thr Asn Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 4

Thr Thr Ser Tyr Thr

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 5

Asn Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 6

Glu Thr Trp Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 7

Asn Thr Ser Tyr Arg

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 8

Ile Asn Asn Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 9

Ile Asp Asn Tyr Thr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 10

Thr Asp Asn Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 11

Thr Asp Ser Tyr Ser

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 12

Thr Asn Ser Tyr Arg

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 13

Asn Thr Arg Tyr Arg

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 14

Ala Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 15

Gly Thr Thr Asn Tyr Thr

1 5

Claims (17)

1.一种治疗脑损伤患者中的卒中、癫痫、发作或脑功能丧失的方法，包括以下步骤：

制备包含D肽和可接受的载体的组合物，所述D肽还包含具有一般结构A-B-C-D-E的五个连续氨基酸，其中：

A是Ser、Thr、Asn、Glu、Ile，

B是Ser、Thr、Asp、Asn，

C是Thr、Ser、Asn、Arg、Trp，

D是Tyr，并且

E是Thr、Ser、Arg、Gly，

其中所有氨基酸是D立体异构构型，和

以治疗有效剂量向所述患者施用所述组合物，

其中所述组合物起治疗所述患者中的卒中、癫痫、发作或脑功能丧失的作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述D肽是TTNYT(SEQ ID NO:1)。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括，所述D肽的长度为至多八(8)个全-D氨基酸残基，并且包含具有选自由以下组成的组的序列的五个连续D氨基酸残基：

(SEQ ID NO:1)Thr Thr Asn Tyr Thr，

(SEQ ID NO:2)Ser Ser Thr Tyr Arg，

(SEQ ID NO:3)Ser Thr Asn Tyr Thr，

(SEQ ID NO:4)Thr Thr Ser Tyr Thr，

(SEQ ID NO:5)Asn Thr Ser Tyr Gly，

(SEQ ID NO:6)Glu Thr Trp Tyr Ser

(SEQ ID NO:7)Asn Thr Ser Tyr Arg

(SEQ ID NO:8)Ile Asn Asn Tyr Thr，

(SEQ ID NO:9)Ile Asp Asn Tyr Thr

(SEQ ID NO:10)Thr Asp Asn Tyr Thr

(SEQ ID NO:11)Thr Asp Ser Tyr Ser

(SEQ ID NO:12)Thr Asn Ser Tyr Arg，和

(SEQ ID NO:13)Asn Thr Arg Tyr Arg。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述组合物还包含具有抗炎活性的经口丸剂，并且其中所述组合物中的所述肽以0.05μg至1000μg的浓度存在。

5.根据权利要求1所述的方法，其中E可以被酯化、糖基化或酰胺化以增强组织分布和进入脑。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含具有抗炎活性的经口丸剂，并且其中所述组合物中的所述肽以0.05μg至1000μg的浓度存在。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗炎活性由CCR5或CCR2受体拮抗作用组成。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗炎活性由双重CCR5和CCR2拮抗作用组成。

9.根据权利要求6所述的疾病治疗方法，其中所述抗炎活性引起选自以下的炎性细胞因子的减少：TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和IL-23。

10.根据权利要求6所述的疾病治疗方法，其中所述抗炎活性引起包括IL-4和IL-10的抗炎细胞因子的增加。

11.根据权利要求6所述的疾病治疗方法，其中所述抗炎活性引起趋化因子CLL2、CCL3和趋化因子受体CCR2和CCR5的减少。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含甘露糖和苄醇，以防止在液体肽溶液中聚集。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含Dala1-肽T-酰胺(DAPTA)抗炎活性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物还包含甘露糖和苄醇，以防止在液体肽溶液中聚集。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含全-D-ASTTTNYT(SEQ ID NO:14)抗炎活性。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物还包含甘露糖和苄醇，以防止在液体肽溶液中聚集。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含全-D-ASTTTNYT-NH₂(SEQ IDNO:14)抗炎活性。

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