JP6055845B2 - ペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
5’-AGU GUU ACU GAA CAA GGU GCU GAG UUA UCU AAU GAG GAG AGA-3’(配列番号2);
あるいは
5’-AGC GUC ACC GAG CAG GGC GCC GAA UUG UCC AAC GAA GAG AGG-3’(配列番号3)
である。
〔アディポネクチンは、末梢血リンパ球(PBL)の経内皮細胞移動を抑制する〕
内皮細胞を、低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下でTNF-α/IFN-γで24時間刺激した。PBLを単離して、0.0001〜15μg/mlのアディポネクチンで1時間処理した。
内皮細胞を、低血清培地中で培養し、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。コンパウンドCを10μg/mlにて30分間 PBLに加えた後、アディポネクチンを15μg/mlにて1時間加えた。アディポネクチン処理は、遊出の減少を誘導し、これはコンパウンドCの存在下では正常な対照レベルまで回復された。結果は図2に示されており、そこではデータは3回の実験を表すものであって、一元配置ANOVAおよびダネットの多重比較ポストテストを用いて解析された。**p≦0.001、***p≦0.0001。
内皮細胞を、低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下でTNF-α/IFN-γで24時間刺激した。結果を図3に示す。a)の部分は、T1DにおいてPBL遊出に対するアディポネクチン媒介性抑制が消失していることを示し、b)の部分は、アディポネクチン処理による遊出のパーセンテージを未処理PBLの遊出のパーセンテージで割ることによって抑制のパーセンテージが計算されたことを示す。HC(健常者対照)群についてはn= 13であり、T1D群についてはn=12である。データは、t検定および一元配置ANOVA、ならびにボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。***p≦0.0001。
アディポネクチン受容体AR1またはAR2を発現するPBLの頻度を、健康被験者または疾患被験者の各々について決定し、それぞれ図4a)および4b)に示している。データは、平均±SEMとして表され、t検定、またはデータがコルモゴロフ・スミルノフ正規性検定を通らない場合にはマン・ホイットニーt検定を用いて解析した。
図5a)は、AR1の発現とリンパ球移動の抑制との間の相関を示し、図5b)は、AR2の発現とリンパ球移動の抑制との間の相関を示す。相関は、線形回帰分析を用いて決定された。
図6a)およびb)は、異なる細胞型上のAR1(図6a)およびAR2(図6b)の発現を示す。データは平均±SEMであり、7人の健常者対照を表す。データは、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストホックテストを用いて解析された。***p≦0.0001。
図7a)は、PBLからB細胞(Bs)を枯渇させるとPBLの移動が消失し、単離T細胞にB細胞を加え戻すと回復することを示す。図7b)は、ナチュラルキラー細胞(NKs)の移動はアディポネクチンによって影響されず、NKsをT細胞に添加してもT細胞の移動は制御されないことを示す。データは平均±SEMであり、少なくとも3回の独立した実験を表す。データは、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。**p≦0.001、***p≦0.0001。
B細胞を単離して、15μg/mlのアディポネクチンの存在下または非存在下でインキュベートした。1時間後に上清(Sup)を採取してBs-ve PBLに添加したところ、PBL遊出のアディポネクチン抑制が有意に回復した。いくつかの実験では、B細胞は、B細胞分泌の阻害剤であるブレフェルジンA(BrefA)で処理された。これらの上清はT細胞の移動を制御することができなかった。このことは図8に示されているが、そのデータは平均±SEMとして示され、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された3つの独立した実験を表す。***p<0.001、ns=非有意。
m/z 774.88イオンは、解析プロトコールのフラグメンテーション産物であり、一般的にMS/MSを使用した同定のためにのみ使用されるが、比較のための重要なパラメータになり得る。
アディポネクチン(陽性対照として、15μg/ml)または0.001〜10ng/mlの濃度のペプチドでPBLを処理し、スクランブル化ペプチドを陰性対照として使用した(10ng/mlで使用)。本ペプチドの特異性を実証するために、その他の生活性ペプチドも使用した(すなわち、10ng/mlの破傷風トキソイドペプチド(TTp)および10ng/mlのプロインスリン(PI))。結果を図11に示す。図11 a)は、PBL遊出は本ペプチドの存在下では用量依存的に減少したが、スクランブル化ペプチド対照、TTp対照、またはPI対照の存在下では減少しなかったことを示している。図11b)は、非線形回帰分析を用いて本ペプチドのEC50(18.6pM)を算出したことを示す。データは3回の独立した実験を表し、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。*p≦0.01、**p≦0.001、***p≦0.0001。
本ペプチドもしくはスクランブル化ペプチドの有りまたは無しでザイモサン(または対照としてのPBS)を48時間注入した後に、腹膜から白血球を採取した。T細胞はCD3の発現により同定した。本ペプチドまたはスクランブル化ペプチドは、300μg/マウスの最終濃度にて注射した。結果を図12に示すが、そこでは、各群についてデータは平均であり、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。*p≦0.01。
この実施例は、さらなる実験を行った結果を示すものであり、従って実施例1を補足する。
図13を参照。内皮細胞を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。PBLを単離して、0.0001〜15μg/mlのアディポネクチンで1時間処理した。(a)の部分は、静的接着アッセイにおいてPBL遊出がアディポネクチンにより有意にかつ用量依存的に減少したこと、および、アディポネクチンは線形回帰により決定されるEC50が約40nMであることを示している。(b)の部分は、アディポネクチンが、フローベースの接着アッセイにおいても、PBL移動を抑制することに関して同等に効果的であったことを示している。(c)の部分は、アディポネクチンが、異なる組織、例えばHUVEC(臍帯)、HSEC(肝臓類洞内皮細胞)、およびDMEC(真皮微小血管上皮)から単離された上皮細胞に対して有効であるが、HSAVEC(伏在静脈)からのものに対しては有効ではないことを示している。(d)の部分においては、AMPキナーゼ阻害剤であるコンパウンドCを10μg/mlにて30分間 PBLに添加された後、アディポネクチンを15μg/mlにて1時間添加した。AMPKは、アディポネクチン受容体シグナル伝達のために必要とされるシグナル伝達アダプターである。アディポネクチン処理は、遊出の減少を誘導したが、これはコンパウンドCの存在下では正常な対照レベルまで回復された。これらのデータは、アディポネクチンが、PBL上に発現されるその受容体に対する作用を通じて、リンパ球の遊出を制御する強い能力を有することを示している。データは、少なくとも3回の独立した実験をまとめたものであり、t検定、一元配置ANOVA、およびダネットの多重比較ポストテストを用いて解析された。**p≦0.01、***p≦0.001。
前の実験の最も単純な解釈は、T細胞がAqの直接的制御下にあるということである。しかしながら、T細胞は適切な受容体を欠いている。しかしながら、他の白血球はAdipo- R1/2を有しており、単球およびB細胞はどちらも高いレベルの発現を示す。
図14を参照。内皮細胞を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。ビーズによるポジティブ選択を用いたB細胞の除去後、および、ビーズによるネガティブ選択を用いて単離したB細胞による再構成後に、アディポネクチン(15μg/ml)の存在下または非存在下でPBL遊出を測定した。アディポネクチン処理B細胞、またはタンパク質分泌を遮断するためにブレフェルジンAで処理したB細胞からの上清を、PBLに添加した。
図15を参照。B細胞は、ネガティブ選択を用いて単離し、アディポネクチンとともに1時間インキュベートした。上清を回収して、C18カラムで精製して大きなサイズのタンパク質を除去し、質量分析器によって獲得した。AQ刺激B細胞からの上清の質量分析を用いたプロテオミクス解析により、SVTEQGAELSNEERという配列を有する14アミノ酸のペプチドが明らかとなった。これを、刊行された配列および予測されている配列のインシリコライブラリーと比較したところ、このペプチドは、単一のヒトタンパク質に対する正確な配列相同性を示し、すなわち14.3.3ゼータ/デルタ(14.3.3.ζδ)タンパク質の第28〜41アミノ酸を表し、このタンパク質はYWHAZ遺伝子の245アミノ酸産物である。このペプチドは、既知の免疫調節ペプチドのファミリーのいずれの構成員でもないし、それらのいずれかと関係していたり、配列類似性を有していたりもしない。質量分析による合成ペプチドの分析は、天然ペプチドと同一の質量:電荷比を示し(m/z=774.88)、このことは、B細胞由来の産物は放出に先立っていかなる形態の翻訳後修飾も受けていなかったことを実証している。これらのデータは、同定された14アミノ酸ペプチドが、アディポネクチン刺激下におけるB細胞から放出されるメディエーターであることを示している。
図16を参照。内皮細胞を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。PBLは、アディポネクチン(陽性対照として、15μg/ml)、または0.001〜10ng/mlの濃度の本ペプチドで処理し、スクランブル化ペプチドを陰性対照として使用した(10ng/ml)。本ペプチドの特異性を実証するために、その他の生活性ペプチドも使用した(すなわち、10ng/mlの破傷風トキソイドペプチド(TTp)および10ng/mlのプロインスリン(PI))。a)の部分は、PBL遊出が本ペプチドの存在下では用量依存的に減少したが、スクランブル化ペプチド対照、TTp対照、またはPI対照の存在下では減少しなかったことを示している。b)の部分は、非線形回帰分析を用いて本ペプチドのEC50(18.6pM)を算出したことを示す。これらのデータは、PEPITEMが、アディポネクチンと同様に、PBL遊出を抑制することができることを示している。データは少なくとも3回の独立した実験をまとめたものであり、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001。
図17を参照。内皮細胞を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。PBLおよび異なるサブセットならびにPEPITEMを、異なる内皮細胞に添加し、遊出を測定した。異なるサブセットは、Treg、CD4+およびCD8+メモリーT 細胞ならびにナイーブT細胞についてのネガティブ選択を用いて単離した。ポジティブ選択を用いて異なる単球サブセットを単離した。
図18を参照。内皮細胞(EC)を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。PEPITEMをPBLとともに内皮細胞に加えるか、または、内皮細胞をPEPITEMで前処理して洗浄後にPBLを加えるか、または、PBLをPEPITEMで前処理して洗浄して内皮細胞に加えた。
図19を参照。IFN-γ/TNF-α処理したHUVECを通したPBLまたはB細胞枯渇化PBLの遊出を、S1PRアンタゴニスト(W146、10μM)を用いてS1Pシグナル伝達を遮断した後に、アディポネクチン(15μg/ml)(a)またはPEPITEM(b)の存在下または非存在下において測定した。B細胞枯渇化PBLは、異なる濃度(0〜100μM)のS1Pで前処理され、IFN-γ/TNF-α処理HUVECを通した遊出を測定した(c)。SPHK1およびSPHK2のmRNA発現のレベルは、B細胞およびHUVEC(dの部分、n=2)からのRNAのリアルタイムPCRにより決定した。PEPITEM(10 ng/ml)の存在下、SPHK1特異的阻害剤(5μM)で前処理したIFN-γ/TNF-α処理HUVECを通したPBL遊出を測定した(e)。
図20を参照。96ウェルプレートを50ug/mlの組換えICAMで4℃にて一晩コーティングした。PBS 4% BSAを用いて1時間室温にてプレートをブロッキングし、IP-10(10ng/ml)および/またはS1P(10uM)で処理したPBLを30分間添加した。剰余の未結合PBLを洗い流し、リンパ球インテグリンLFA-1(CD11a/CD18;αLβ2)の中間親和性部位についてはKIM127抗体(10ug/ml)を使用して、高親和性部位については抗体24(10ug/ml)を使用して、4℃にてPBLを標識した。平均蛍光強度(MFI)を使用して、メモリーT細胞について両方の親和性部位の発現を測定した。データは、IP-10刺激により増加した中間親和性部位および高親和性部位の両方の発現が、S1Pの存在下で下方調節されることを示している。このデータは、S1Pが、リンパ球遊出にとって重要であるインテグリンLFA-1の親和性を調節することにより、リンパ球遊出を制御することを示している。データは2つの独立した実験をまとめたものである。
図21を参照。(a)の部分では、野生型マウスまたはB細胞ノックアウト(Jh-/-)BALB/cマウスに100ugのザイモサンを注射した。本ペプチドもしくはスクランブル化ペプチドを伴わせて、または伴わせないで、ザイモサン(または対照としてのPBS)を48時間注入した後に、腹膜から白血球を回収した。T細胞はCD3の発現により同定した。本ペプチドまたはスクランブル化ペプチドは、300μg/マウスという最終濃度にて注射された。その結果を(a)の部分に示しているが、そこでは、各群におけるデータは平均であり、一元配置ANOVAおよびボンフェローニの多重比較ポストテストを用いて解析された。*p≦0.01。(b)の部分では、野生型マウスまたはB細胞ノックアウトC56BL/6マウスにネズミチフス菌(Salmonella typhirium)を注射した。5日後、肝臓を採取して、切片をT細胞について染色した。(b)の部分のデータは、肝臓切片における感染部位あたりのT細胞の数を示す。
図22を参照。アディポネクチン受容体AR1またはAR2を発現するPBLの頻度を、フローサイトメトリーによって各々の健康被験者または疾患被験者について決定し、それぞれ(a)および(b)の部分に示している。データは平均±SEMとして表され、t検定、またはデータがコルモゴロフ・スミルノフ正規性検定を通らない場合にはマン・ホイットニーt検定を用いて解析した。内皮細胞を低血清培地中で培養し、アディポネクチンの非存在下で、TNF-α/IFN-γで24時間刺激した。健常者対照および1型糖尿病の患者からPBLを単離し、15μg/mlのアディポネクチンで1時間処理した。(c)の部分は、AdipoR2の発現とリンパ球移動の抑制との間の相関を示している。相関は線形回帰分析を用いて決定した。(d)の部分は、新たに診断された1型糖尿病患者に由来し、アディポネクチンまたはPEPITEMで前処理されたPBL(n=5)の遊出を示す。データはt検定を用いて解析した。**p<0.01。
Claims (14)
- T細胞媒介性慢性炎症疾患に関連する状態の治療および/または予防における使用のための、ペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは配列N’-SVTEQGAELSNEER-C’(配列番号1)からなりT細胞の移動を抑制する、組成物。
- 前記状態が、T細胞自己反応性、T細胞媒介性慢性炎症疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記状態が、糖尿病(1型)である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記状態が、若年発症糖尿病、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、脂肪性肝炎および肝硬変を含む炎症性および線維性の肝疾患、ならびにブドウ膜炎からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記状態が、腎障害、糖尿病性腎疾患、末梢神経障害、糖尿病性網膜症、および心・脳疾患からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記T細胞の移動は、島細胞を血液供給から隔てる膵臓微小血管系の内皮を通した経内皮移動である、請求項1〜5のいずれかに記載の組成物。
- 前記T細胞は自己反応性T細胞である、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物。
- 前記ペプチドが、膵島への自己反応性T細胞の徴集を抑制する作用をする、請求項7に記載の組成物。
- T細胞媒介性慢性炎症疾患に関連する状態の治療および/または予防における使用のための、ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、配列N’-SVTEQGAELSNEER-C’(配列番号1)からなるペプチドをコードする、組成物。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号2、配列番号3、およびそれらのDNA形態またはDNA/RNAハイブリッド形態からなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結される、請求項10に記載の組成物。
- 前記プロモーターは膵臓特異的プロモーターである、請求項11に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドはプラスミドに含まれる、請求項9〜12のいずれかに記載の組成物。
- 前記プラスミドはウイルスベクターに含まれる、請求項13に記載の組成物。
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