CN112679449A

CN112679449A - 羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法

Info

Publication number: CN112679449A
Application number: CN202011371710.7A
Authority: CN
Inventors: 卢延斌; 聂景贵
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了一种羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，依次进行以下步骤：选择新鲜的羊栖菜或者选择解冻后的冷冻羊栖菜；在容器中加入羊栖菜和固定提取溶剂混合均匀，于暗处浸泡2±0.5h；浸泡完成后，先预热，然后进行超声提取；提取完成后离心，离心所得的上清液中含有岩藻黄质。本发明的提取过程中不使用任何有毒溶剂，因此具有绿色环保的技术优势。

Description

羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法

技术领域

本发明涉及一种羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，属于食品功能性成分提取技术领域。

背景技术

羊栖菜属于褐藻门马尾藻科，主要分布于热带及亚热带沿海，生长在低潮带或中潮带的岩石上，由固着器、主干、分枝和藻叶几部分组成。马尾藻含有复杂的营养成分，如多糖、蛋白质、脂质、色素、微量元素等。岩藻黄质是羊栖菜的主要色素，它是一种类胡萝卜素，具有各种有益的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗肥胖、抗血管生成和神经保护活性。现存的提取岩藻黄质的方法大多是利用有机溶剂提取，然而有机溶剂具有毒性，对人的身体健康具有危害。现有的提取岩藻黄质的方法大多是利用丙酮、甲醇、乙酸乙酯等具有微毒或剧毒的有机溶剂提取，这些有机溶剂对人的身体健康具有危害。因此，如何利用绿色方法从羊栖菜中分离获得岩藻黄质并将其应用于食品、化妆品、医药等领域引起了广泛关注。

乳酸乙酯是一种无腐蚀性、非致癌性和非致畸性、可生物降解的溶剂。它通过生物质原料中产生的乙醇和乳酸的酯化反应合成，可持续生产，因此被公认为是一种绿色溶剂。目前，乳酸乙酯一般用于替代空气污染物MEK、MIBK和甲苯，作为脱漆剂和涂鸦清除剂，或者用于清除油脂、粘合剂和固体燃料。作为一种新兴绿色提取溶剂，已经有用乳酸乙酯提取植物甾醇、角鲨烯和香紫苏醇的研究，但是目前尚未用于褐藻中岩藻黄质等类胡萝卜素的提取。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种绿色高效的羊栖菜岩藻黄质的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，依次进行以下步骤：

1)、选材：

为以下任一方式：

方式一、选择新鲜的羊栖菜，直接进行后续的步骤2)；

方式二、选择冷冻(约-20℃)羊栖菜，先解冻，然后用纸吸干羊栖菜表面的水(即，羊栖菜表面无明显水渍)，再进行后续的步骤2)；

2)、浸泡：按照液固比40～60mL/1g，在容器中加入羊栖菜和固定提取溶剂混合均匀，于暗处浸泡2±0.5h；

3)、预热：

浸泡完成后，将装有羊栖菜和固定提取溶剂的容器于65～80℃的预热温度(恒温水浴)中，预热5±1min；

4)、提取：

预热完成后，于65～80℃提取(超声提取)20～30min；

上述步骤3)和步骤4)优选暗处进行操作；

5)、离心：

提取(超声提取)完成后，将装有提取物的容器置于暗处冷却至室温，再离心；

离心所得的上清液中含有岩藻黄质。

作为本发明的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法的改进：

步骤2)中的固定提取溶剂为乳酸乙酯。

作为本发明的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法的进一步改进：

步骤4)的提取为：预热完成后，将超声钻头伸到液面以下，距离容器底1～2厘米，超声条件为：时间20～30min、温度70～80℃、振幅40～60％、运行10s，间隔10s。

步骤5)的离心为：温度4±1℃、转速8000±800rpm/min；时间10±2min。

步骤2)中的液固比40mL/1g；

步骤3)的预热温度为75℃；

步骤4)的超声，时间为25min，温度为75℃；振幅为50％。

所述步骤2)中，容器的外表面包裹锡纸。

本发明针对离心所得的含有岩藻黄质的上清液进行如下操作：

定容：在离心所得的上清液中加入固定提取溶剂定容至同步骤2)所用固定提取溶剂的体积量，然后均匀混合；作为提取液；

检测：提取液用无水乙醇稀释4倍(即，提取液：乙醇＝1：3的体积比)，用注射器吸取2mL，过0.45μm的尼龙膜，作为样液，装入进样瓶，然后用HPLC检测样液液中岩藻黄质的含量。

计算提取率：根据HPLC色谱图获得岩藻黄质的峰面积，将其代入检测岩藻黄质的标准曲线中，y＝176603x-105594(R²＝0.9991)，y(μg/mL)为样液中岩藻黄质的浓度，x为色谱图中岩藻黄质峰面积。岩藻黄质的提取率Y＝4y*液固比。

本发明的羊栖菜岩藻黄质制备方法具有如下技术优势为：

1)、在本发明的提取过程中不使用任何有毒溶剂，只采用乳酸乙酯单一溶剂提取羊栖菜岩藻黄质，但传统提取方法通常采用丙酮、甲醇、乙酸乙酯等具有微毒或剧毒的溶剂，所以本发明可以减少对环境的污染。通过本发明提取的羊栖菜岩藻黄质是绿色安全的。

2)、以超声作为提取方法时，乳酸乙酯与乙醇/丙酮(V:V，3:1)的提取效果相当，但是丙酮具有毒性。

3)、乳酸乙酯的沸点很高，在超声辅助提取过程中不易挥发，而乙醇/丙酮易挥发，在提取过程中会不断地损失，且对环境造成污染。

4)、本发明使用探针式超声波辅助提取，超声波的空化作用可以强化对细胞壁的破坏，与传统辅助提取方法(如旋转式恒温振荡)相比，不仅可以提高提取率，而且可以缩短提取时间，节约成本。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为单因素试验中羊栖菜岩藻黄质提取率对比图；

图1中：

A为不同液固比的提取率对比；

B为不同提取时间的提取率对比；

C为不同提取温度的提取率对比；

D为不同增幅的提取率对比。

图2是实施例5、对比例1、对比例2的样液色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

生物材料来源：

新鲜羊栖菜购自浙江省温州市洞头区，于3月左右采摘，保存在-20℃的冰箱中。

检测方法：

利用HPLC检测提取液中岩藻黄质的含量，检测条件为：

C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长449nm，流动性相为乙腈：甲醇：质量浓度0.1％醋酸铵水溶液(V:V:V，75:15:10)，等度洗脱，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，时间15min。

以下案例中，没有明确告知的均为在常规的室温下进行。

实施例1、羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法(研究不同液固比对羊栖菜岩藻黄质提取率的影响)，依次进行如下步骤：

1)、解冻：

将冷冻的羊栖菜置于水中解冻，解冻之后，用纸吸干表面的水(即，羊栖菜表面无明显水渍)，备用；

2)、浸泡：

称取一定量的羊栖菜，按照10/1、20/1、30/1、40/1、50/1和60/1(mL/g)的液固比，分别进行以下操作：加入至装有100mL的乳酸乙酯(作为固定提取溶剂)的烧杯中，将料液混合均匀后，用锡纸包裹烧杯以避免岩藻黄质在光照下被分解，在暗处浸泡2h(即，于暗处使得羊栖菜在乳酸乙酯中被浸泡2h)；

3)、预热：

浸泡之后，将烧杯放置在温度为65℃的恒温水浴锅中，预热5min；

4)、提取：

预热之后，将烧杯置于超声钻头正下方，钻头伸到液面以下，距离杯底1厘米处，设置超声条件为：时间20min、温度65℃(同预热温度)、振幅40％、运行10s，间隔10s；

上述步骤3)和步骤4)均在暗处进行。

5)、离心：

超声完成后，将烧杯置于暗处冷却至室温，再倒入离心管，设置离心条件为时间10min、温度4℃、转速8000rpm/min；

6)、定容：

离心之后将上清液倒入100mL量筒，用乳酸乙酯定容到100mL，再倒入锥形瓶混合均匀，作为提取液；

7)、检测：

提取液用乙醇稀释4倍(即，提取液：乙醇＝1：3的体积比)，用注射器吸取2mL，过0.45μm的尼龙膜，作为样液，装入进样瓶，然后用HPLC检测样液中岩藻黄质的含量。

8)、计算提取率：

根据HPLC色谱图获得岩藻黄质的峰面积，将其代入检测岩藻黄质的标准曲线中，y＝176603x-105594(R²＝0.9991)，y(μg/mL)为样液中岩藻黄质的浓度，x为色谱图中岩藻黄质峰面积。岩藻黄质的提取率Y＝4y*液固比。

经检测，在不同液固比下萃取羊栖菜岩藻黄质的提取率不同，提取率随液固比增加不断上升，超过40mL/g的时候上升趋势减缓(图1A)。出于节约成本的考虑，选择40mL/g作为提取的最佳液固比。

经过与岩藻黄质标准品的HPLC色谱图对比，本发明所得确实为岩藻黄质。

实施例2、研究不同超声时间对羊栖菜岩藻黄质提取率的影响：

步骤2)中，设置30/1(mL/g)的液固比；

步骤4)中，超声时间分别为10、15、20、25、30和35min；

其余等同于实施例1。

经检测，在不同时间下萃取羊栖菜岩藻黄质的提取率不同，提取率随时间增加不断上升，在30min达到最大值，但是25min与30min的提取率相差不大(图1B)。出于提取简便的考虑，选择25min作为提取的最佳超声时间。

实施例3、研究不同提取温度对羊栖菜岩藻黄质提取率的影响：

步骤2)中，设置30/1(mL/g)的液固比；

步骤3)中，预热温度分别设置为55、60、65、70、75和80℃；

步骤4)中，超声提取的温度也相应的分别设置为55、60、65、70、75和80℃；其余等同于实施例1。

经检测，在不同温度下萃取羊栖菜岩藻黄质的提取率不同，其中在温度为75℃的条件下，提取效率最高(图1C)。因此，选择75℃作为提取的最佳温度。

实施例4、研究不同超声振幅对羊栖菜岩藻黄质提取率的影响：

步骤2)中，设置30/1(mL/g)的液固比；

步骤4)中，超声提取的振幅分别为20、30、40、50、60和70％；

其余等同于实施例1。

经检测，在不同振幅下萃取羊栖菜岩藻黄质的提取率不同，其中在振幅为50％的条件下，提取效率最高(图1D)。因此，选择50％作为最佳超声振幅。

实施例5、最佳提取条件下羊栖菜岩藻黄质的提取率，试验步骤如下：

步骤2)的浸泡中，设置40/1(mL/g)的液固比；即，羊栖菜的量为2.5g、乳酸乙酯的体积为100mL；

步骤3)的预热中，预热温度75℃，预热5min；

步骤4)的超声提取中，设置超声条件为：时间25min、温度75℃、振幅50％、运行10s，间隔10s；

其余等同于实施例1。

经检测，在最佳提取条件下，获得羊栖菜岩藻黄质的提取率为696.73μg/g。

说明：将实施例5中的“解冻并用纸吸干表面的水后的羊栖菜”改成新鲜的羊栖菜，其余等同于实施例5，所得的提取率与实施例5相比，无明显区别。

对比例1、

将实施例5步骤2)中的固定提取溶剂由乳酸乙酯改成乙醇/丙酮(V:V，3:1)，体积用量保持不变；相应的，将步骤6)定容时所用的乳酸乙酯改成乙醇，体积用量保持不变；

其余等同于实施例5。

经检测，羊栖菜岩藻黄质的提取率为691.04μg/g。但是该对比例1使用的丙酮是具有剧毒的溶剂，对环境和人体健康都有极大的危害。

对比例2、

将实施例5的步骤3)和步骤4)改成为如下：

完成步骤2)的浸泡之后，将烧杯放置在温度已经达到75℃的摇床中，设置转速为120rpm/min，提取1h；然后进行后续的离心步骤；

其余等同于实施例5。

经检测，羊栖菜岩藻黄质的提取率为617.31μg/g。

对比例3、

将实施例5中步骤2)、步骤6)中的乳酸乙酯均改成柠檬烯，体积用量保持不变；

其余等同于实施例1。

经检测，羊栖菜岩藻黄质的提取率为485.67μg/g。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、选材：

为以下任一方式：

方式一、选择新鲜的羊栖菜，直接进行后续的步骤2)；

方式二、选择冷冻羊栖菜，先解冻，然后用纸吸干羊栖菜表面的水，再进行后续的步骤2)；

3)、预热：

浸泡完成后，将装有羊栖菜和固定提取溶剂的容器于65～80℃的预热温度中，预热5±1min；

4)、提取：

预热完成后，于65～80℃提取20～30min；

5)、离心：

提取完成后，将装有提取物的容器置于暗处冷却至室温，再离心；

离心所得的上清液中含有岩藻黄质。

2.根据权利要求1所述的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是：

步骤2)中的固定提取溶剂为乳酸乙酯。

3.根据权利要求2所述的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是所述步骤4)的提取为：

预热完成后，将超声钻头伸到液面以下，距离容器底1～2厘米，超声条件为：时间20～30min、温度65～80℃、振幅40～60％、运行10s，间隔10s。

4.根据权利要求3所述的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是所述步骤5)的离心为：温度4±1℃、转速8000±800rpm/min；时间10±2min。

5.根据权利要求4所述的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是：

步骤2)中的液固比40mL/1g；

步骤3)的预热温度为75℃；

步骤4)的超声，时间为25min，温度为75℃；振幅为50％。

6.根据权利要求5所述的羊栖菜岩藻黄质的绿色制备方法，其特征是：

所述步骤2)中，容器的外表面包裹锡纸。