CN105037300A - 一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，包括将新鲜的马尾藻或冰冻保存的马尾藻通过反复冻融和离心过程控制褐藻的水分；将有机试剂加入到海藻中，避光浸提1-24小时后抽滤，得到浸提液，重复操作将海藻反复浸提直至浸提液为无色，合并浸提液，将浸提液于浓缩，直至溶液中出现大量沉淀，过滤除去沉淀得滤液的步骤；将滤液于低温结晶过滤得岩藻黄素的步骤；在滤液中加入脂溶性溶剂，进行多次液液萃取直至脂溶性溶剂层无色，合并多次萃取所得脂溶性溶剂层进行低温浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，即为褐藻多酚提取物，优点是原料利用率和提取效率高，操作简单。

Description

一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法

技术领域

本发明涉及一种综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，主要是涉及一种从马尾藻中综合提取高纯度岩藻黄素和褐藻多酚的方法。

背景技术

岩藻黄素（fucoxanthin），又称褐藻黄素、墨角藻黄素，是褐藻中马尾藻科海藻的主要类胡萝卜素类成分。药理研究表明，岩藻黄素具有抗肿瘤、减肥、抗氧化、消炎、预防糖尿病等多种活性；同时毒理学研究表明，岩藻黄素具有毒副作用小、不影响脂代谢循环等优点，因此，岩藻黄素是一种具有极大潜在药用价值和经济价值的海洋活性天然产物。

褐藻多酚（phlorotannins）是发现于褐藻且仅存于褐藻的一族天然产物，是海洋褐藻中重要的活性次级代谢产物。化学结构上，褐藻多酚是一类以间苯三酚为基础骨架的独特的多酚类化合物，其聚合度可以几个至几百个，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、治疗心血管疾病、抗糖尿病综合症、保肝以及抑制赖氨酸激酶等多种生物活性，是值得开发的新型海洋功能性产品。褐藻多酚因其潜在的生物活性已被广泛应用于食品、药品及化妆品等多个产业。

目前，提取岩藻黄素的专利有：名称为一种从海藻中分离岩藻黄素的方法（公开号为CN1706836A），名称为一种纯化岩藻黄素的方法（公开号为CN101735178A），名称为一种由褐藻中提取岩藻黄素的方法（公开号为CN101565411A）等；提取褐藻多酚的专利有：名称为一种褐藻多酚的提取方法（公开号为CN102397300A），名称为一种褐藻多酚的提取方法（公开号为CN103610704A）。

上述专利中的提取方法皆是单独提取岩藻黄素或褐藻多酚的方法，提取效率和原料利用率低；同时，生产成本普遍偏高，无法实现技术普及和大规模生产，难以实现应用的经济价值。目前，国内外还没有公开任何关于从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种原料利用率和提取效率高，操作简单、高效、安全的从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，包括以下步骤：

（1）将新鲜马尾藻在温度为-5～-80℃的条件下进行冻结，冷冻1天～30天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至马尾藻中心温度达到0～2℃后即完成冻融过程；将马尾藻放入离心机，于转速为800rpm～10000rpm的条件下离心3-10min去除水分；

（2）重复上述步骤1～4次后，将有机试剂加入到马尾藻中，避光浸提1-24小时后抽滤，得到浸提液，将马尾藻反复浸提直至浸提液为无色，合并浸提液，待用；

（3）将浸提液于15-40℃条件下进行浓缩，直至溶液中出现大量沉淀，过滤除去沉淀得滤液，待用；

（4）将滤液于4℃-30℃低温结晶2-72h，过滤即得纯度高于75%的红色固体岩藻黄素；

（5）在步骤（4）得到的滤液中加入脂溶性溶剂，进行多次液液萃取直至脂溶性溶剂层无色，合并多次萃取所得脂溶性溶剂层，待用；

（6）将上述步骤（5）所得脂溶性溶剂进行低温浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，即为褐藻多酚提取物。

步骤（2）中所述的有机试剂为丙酮、甲醇或60—99V/V%的乙醇水溶液。

步骤（5）中所述的脂溶性溶剂为二氯甲烷、正己烷、环己烷、乙醚中的一种或几种。

步骤（1）中所述的马尾藻为羊栖菜、海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝马尾藻、铜藻、裂叶马尾藻、半叶马尾藻、弱枝马尾藻。

一种从马尾藻中提取褐藻多酚的检测方法，包括以下步骤：

（1）称取新鲜马尾藻1.000g于锥形瓶中，加入50mL的体积浓度为60%的乙醇水溶液，40℃超声提取30min，过滤至50mL容量瓶，加入体积浓度为60%的乙醇水溶液定容至50mL得到马尾藻提取液，待用；

（2）量取马尾藻提取液1.0mL，加1.25mLFolin-Ciocalteu试剂，混匀3min后，加入4.0mL0.1g/mLNa₂CO₃溶液，加水定容至10mL，混匀，30℃避光反应60min，以试剂空白为对照，在760nm波长处测定吸光度；以没食子酸为标准品绘制得到标准曲线，线性回归方程为Y=0.0138X+0.0267，相关系数R²=0.9993，其中X为马尾藻提取液中褐藻多酚的浓度，单位为μg/mL；Y为吸光值；计算马尾藻供试液中褐藻多酚的含量，计算公式如下：

褐藻多酚含量（mg/g）=X×V/m

X：马尾藻提取液中褐藻多酚浓度（mg/mL）；

V：马尾藻提取液总体积（mL）；

m：马尾藻总质量（g）。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供一种从马尾藻中综合提取高纯度岩藻黄素和褐藻多酚的方法，将滤去岩藻黄素的滤液用乙酸乙酯萃取，进而得到较纯净的褐藻多酚提取物。本发明还具有以下优点和积极效果:

1、操作简单、成本低、分离效果好；

2、采用多次冻融和离心方法，除去马尾藻中水分，可有效避免马尾藻中的岩藻黄素等有效成分被破坏和分解，且马尾藻样品表面和内部含水量差异小，处理后得到的马尾藻含水量为50%～90%，含水量低于50%，岩藻黄素受到光、热、空气的影响，易于氧化，不利于岩藻黄素的提取，含水量高于90%，造成生产成本的急剧上升，生产效率下降，不利于马尾藻高值化产品的规模化生产，获得的岩藻黄素产品具有很好的产量和质量，得率为85%～100%；

3、产品安全、健康、纯度高。本发明采用常用溶剂从马尾藻中提取岩藻黄素，常用试剂甲醇、乙醇或丙酮不会影响天然岩藻黄素的化学结构。通过本发明的提取工艺，可得到安全、健康、纯度高于75%的岩藻黄素和纯度10%左右的褐藻多酚；

4、为工厂化生产奠定基础。本发明提出了一种简单、高效的岩藻黄素和褐藻多酚综合提取方法，其提取工艺适用于工业化的大规模生产。

综上所述，本发明首次提出一种综合利用提取高纯度岩藻黄素和褐藻多酚的方法，为一种简单、安全、低成本的高纯度岩藻黄素和褐藻多酚粗品的制备方案。本发明为满足国内、外高纯度岩藻黄素和褐藻多酚市场提供了安全、低毒的提取分离技术，对于综合利用岩藻黄素和褐藻多酚开发功能性食品及天然药物，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明从马尾藻中提取高纯度岩藻黄素和褐藻多酚粗品的工艺流程图；

图2为实施例1从铜藻中提取得到的岩藻黄素紫外/可见吸收光谱图；

图3为实施例1从铜藻中提取得到的岩藻黄素的高效液相色谱图；

图4为实施例1从铜藻中提取得到的褐藻多酚的紫外/可见吸收光谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验方法

液相色谱条件：

所用仪器：Waters2695高效液相色谱仪

液相条件：固定相为YMC-PackODS-A柱（250×4.6mm，5μm）；柱温：25℃；流速：1mL/min；检测波长：450nm；进样量：10μL；流动相：A:甲醇，B:水，梯度洗脱：A相（体积%），0-40min（20-90），40-50min（90）。

Folin-Ciocalteu比色法测定褐藻中褐藻多酚的含量：

（1）称取新鲜马尾藻1.000g于锥形瓶中，加入50mL的体积浓度为60%的乙醇水溶液，40℃超声提取30min，过滤至50mL容量瓶，加入体积浓度为60%的乙醇水溶液定容至50mL得到马尾藻提取液，待用；

（2）量取马尾藻提取液1.0mL，加1.25mLFolin-Ciocalteu试剂，混匀3min后，加入4.0mL0.1g/mLNa₂CO₃溶液，加水定容至10mL，混匀，30℃避光反应60min，以试剂空白为对照，在760nm波长处测定吸光度；以没食子酸为标准品绘制得到标准曲线，线性回归方程为Y=0.0138X+0.0267，相关系数R²=0.9993，其中X为马尾藻提取液中褐藻多酚的浓度，单位为μg/mL；Y为吸光值；计算马尾藻供试液中褐藻多酚的含量，计算公式如下：

褐藻多酚含量（mg/g）=X×V/m

X：马尾藻提取液中褐藻多酚浓度（mg/mL）；

V：马尾藻提取液总体积（mL）；

m：马尾藻总质量（g）。

二、具体实施例

实施例1

工艺流程如图1所示，将新鲜铜藻在温度为-40℃的条件下进行冻结，冷冻15天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至铜藻中心温度达到1℃后即完成冻融过程；将铜藻放入离心机，于转速为800rpm的条件下离心10min去除水分；通过反复冻融和离心3次，控制铜藻水分含量为90%。称取100g铜藻放入1000mL三角烧杯中，加入85%（V/V）乙醇水溶液500mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，过滤。继续向上述浸提处理的铜藻中再次加入85%（V/V）乙醇水溶液500mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，过滤。多次避光浸提直至提取液无色，合并滤液。将上诉滤液于40℃下浓缩，浓缩时当溶液中逐步出现大量沉淀，滤过；滤液继续于40℃下浓缩，直至溶液中析出红色固体，将滤液于5℃低温结晶5h，过滤得红色固体,即为纯度为85%的高纯度岩藻黄素。再向上述滤去岩藻黄素的滤液中加入一定量二氯甲烷进行萃取，直至二氯甲烷层无色；将二氯甲烷层30℃浓缩，直至溶液中有黄绿色固体析出，即为褐藻多酚提取物。

使用紫外—可见分光光度计对得到的高纯度岩藻黄素和褐藻多酚粗品进行200～700nm全波长扫描，以甲醇做空白参照。结果表明，岩藻黄素甲醇溶液在451.4nm处吸收峰值最大，说明提取的物质为岩藻黄素，岩藻黄素紫外吸收光谱见图2；采用Folin-Ciocalteu比色法对褐藻多酚甲醇溶液进行含量测定，发现反应液在760nm处吸收值最大。使用HPLC对得到的高纯度岩藻黄素进行分析，具体液相色谱见图3，根据HPLC系统自生成报告可知，得到岩藻黄素的纯度可以达到85%，并根据Folin-Ciocalteu比色法测定马尾藻提取液中褐藻多酚的含量为10%。褐藻多酚紫外吸收光谱见图4，由图可知，褐藻多酚的最大吸收波长分别在248.5和380.7nm。

实施例2

将新鲜羊栖菜在温度为-5℃的条件下进行冻结，冷冻30天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至羊栖菜中心温度达到2℃后即完成冻融过程；将羊栖菜放入离心机，于转速为10000rpm的条件下离心3min去除水分；通过反复冻融和离心5次，控制羊栖菜水分含量为58%。称取100g羊栖菜放入1000mL三角烧杯中，加入85%（V/V）乙醇水溶液300mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，过滤。继续向上述浸提处理的铜藻中再次加入85%（V/V）乙醇水溶液300mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，过滤，合并滤液。滤液于40℃下浓缩，浓缩时当溶液中逐步出现大量沉淀，滤过；取上述滤液继续于40℃下浓缩，直至溶液中析出红色固体，将滤液于-5℃低温结晶5h,过滤得红色固体,即为纯度为85%的高纯度岩藻黄素。再向上述滤去岩藻黄素的滤液中加入一定量正己烷进行萃取，直至正己烷层液体无色；将正己烷30℃浓缩，直至溶液中有黄绿色固体析出，即为褐藻多酚提取物。

使用紫外—可见分光光度计对得到的高纯度岩藻黄素和褐藻多酚提取物进行200～700nm全波长扫描，以甲醇做空白参照。结果表明，岩藻黄素甲醇溶液在451.4nm处吸收峰值最大,说明提取的物质为岩藻黄素；采用Folin-Ciocalteu比色法对褐藻多酚甲醇溶液进行含量测定，溶液在760nm处吸收峰最大，该结果与褐藻多酚含量测定相关文献的报道一致。使用HPLC系统对得到的高纯度岩藻黄素进行分析，根据HPLC系统自生成报告可知，得到岩藻黄素的纯度可以达到85%，并根据Folin-Ciocalteu比色法测定马尾藻提取液中褐藻多酚含量为11%。

实施例3

同上述实施例1，其区别在于：将新鲜铜藻在温度为-80℃的条件下进行冻结，冷冻1天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至铜藻中心温度达到0℃后即完成冻融过程；将铜藻放入离心机，于转速为5000rpm的条件下离心5min去除水分；通过反复冻融和离心5次，控制铜藻水分含量为50%；避光浸提时间为3小时；低温浓缩的温度为15℃；有机试剂为丙酮；铜藻与有机试剂的比例为100g：400ml。

实施例4

同上述实施例2，其区别在于：羊栖菜反复冻融和离心4次，控制水分含量为70%；避光浸提时间为3小时；温浓缩的温度为20℃；有机试剂为甲醇；羊栖菜与有机试剂的比例为100g：450ml。

实施例5

同上述实施例2，其区别在于：羊栖菜反复冻融和离心3次，控制水分含量为79%；有机试剂为60%(V/V)的乙醇水溶液；羊栖菜与有机试剂的比例为100g：500ml

上述海藻除铜藻和羊栖菜外，所述的马尾藻为海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝马尾藻、裂叶马尾藻、半叶马尾藻、弱枝马尾藻。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将新鲜马尾藻在温度为-5～-80℃的条件下进行冻结，冷冻1天～30天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至马尾藻中心温度达到0～2℃后即完成冻融过程；将马尾藻放入离心机，于转速为800rpm～10000rpm的条件下离心3-10min去除水分；

（2）重复上述步骤1～4次后，将有机试剂加入到马尾藻中，避光浸提1-24小时后抽滤，得到浸提液，将马尾藻反复浸提直至浸提液为无色，合并浸提液，待用；

（3）将浸提液于15-40℃条件下进行浓缩，直至溶液中出现大量沉淀，过滤除去沉淀得滤液，待用；

（4）将滤液于4℃-30℃低温结晶2-72h，过滤即得纯度高于75%的红色固体岩藻黄素；

（5）在步骤（4）得到的滤液中加入脂溶性溶剂，进行多次液液萃取直至脂溶性溶剂层无色，合并多次萃取所得脂溶性溶剂层，待用；

（6）将上述步骤（5）所得脂溶性溶剂进行低温浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，即为褐藻多酚提取物。

2.根据权利要求1所述的一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的有机试剂为丙酮、甲醇或60—99V/V%的乙醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的脂溶性溶剂为二氯甲烷、正己烷、环己烷、乙醚中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种从马尾藻中综合提取岩藻黄素和褐藻多酚的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的马尾藻为羊栖菜、海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝马尾藻、铜藻、裂叶马尾藻、半叶马尾藻、弱枝马尾藻。

5.一种从马尾藻中提取褐藻多酚的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取新鲜马尾藻1.000g于锥形瓶中，加入50mL的体积浓度为60%的乙醇水溶液，40℃超声提取30min，过滤至50mL容量瓶，加入体积浓度为60%的乙醇水溶液定容至50mL得到马尾藻提取液，待用；

（2）量取马尾藻提取液1.0mL，加1.25mLFolin-Ciocalteu试剂，混匀3min后，加入4.0mL0.1g/mLNa₂CO₃溶液，加水定容至10mL，混匀，30℃避光反应60min，以试剂空白为对照，在760nm波长处测定吸光度；以没食子酸为标准品绘制得到标准曲线，线性回归方程为Y=0.0138X+0.0267，相关系数R²=0.9993，其中X为马尾藻提取液中褐藻多酚的浓度，单位为μg/mL；Y为吸光值；计算马尾藻供试液中褐藻多酚的含量，计算公式如下：

褐藻多酚含量（mg/g）=X×V/m

X：马尾藻提取液中褐藻多酚浓度（mg/mL）；

V：马尾藻提取液总体积（mL）；

m：马尾藻总质量（g）。