CN112675234A - 一种治疗动物湿热泻痢证制剂、制备方法及质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗动物湿热泻痢证制剂、制备方法及质量检测方法，以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片150～220份、桃金娘根饮片260～370份、南刘寄奴饮片60～100份、救必应饮片300～420份、辅料500～750份和乙醇45‑70份；所述辅料由蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。本发明以苦玄参、桃金娘根、南刘寄奴和救必应四味药，再选择合适的辅料和工艺，制备的药剂有效成分含量提高，可用于鸡、猪、牛的湿热泻痢证；制成兽用颗粒剂，运输方便、储存方便、使用方便，与饮用水混饮或与饲料混饲皆可，尤其适用于群体给药，适合规模化养殖的预防和保健用药。本发明同时还提供简便、定量准确，能全面检测本制剂内在质量及稳定性的HPLC‑PAD质量检测方法。

Description

一种治疗动物湿热泻痢证制剂、制备方法及质量检测方法

技术领域

本发明属于禽畜药技术领域，具体是一种治疗动物湿热泻痢证制剂、制备方法及质量检测方法。

背景技术

随着养殖业的发展，因养殖密度大和环境的高温高湿所诱导的动物湿热泻痢证愈发严重，成为动物常见多发病证，证见精神短少，蜷腰卧地，食欲减少甚至废绝，鼻镜干燥；弓腰努责，泻粪不爽，里急后重，下痢稀糊，赤白相杂，或呈白色胶冻状，是西南部湿热地区易发证侯，给养殖业造成巨大经济损失。

目前用于治疗动物湿热泻痢证的药物主要以西药抗菌药消炎药、中药、中西药组合药为主。中国专利CN200710059537.5公开了一种治疗禽类肠炎、湿热泻痢的中药组合物，该组合药物组分白头翁、龙胆、黄连。中国专利CN201611148635.1公开了一种用于治疗畜禽湿热泻痢的药物及其制备方法，该组合药物组分为黄芪、黄芩、防风、板蓝根、黄连、木香、马齿苋、柴胡、苍术、陈皮、泽泻、当归。中国专利CN201910511092.2公开了一种治疗禽类湿热泻痢的中药组合物，该组合药物组分为白头翁、板蓝根、黄连、黄柏、黄芩、蒲公英、金银花、连翘、甘草。中国专利CN200810100646.1、CN201010246979.2、CN201410074276.4、CN201010193279.1以及相关文献报道了各种采用黄芩、木香、金银花、甘草、大叶白头翁、白果叶等中药材中的一种或是几种与其他重要配伍治疗湿热泻痢证的研究。

目前，收载于《中华人民共和国兽药典》用于治疗湿热泻痢证的中药制剂主要有：四黄止痢颗粒，其组分为黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、甘草；白龙散，其组分为白头翁、龙胆、黄连；郁金散，其组分为郁金、诃子、黄芩、大黄、黄连、黄柏、栀子、白芍；金根注射液，其组分为金银花、板蓝根；穿白痢康丸。中药组方一直以来便有组方复杂，药理作用不明确，随着环境的改变，有些药材趋向于衰竭，如黄连、黄柏、黄芩、龙胆、诃子、甘草等，均列为国家重点保护野生药材植物。长期使用西药则会引起细菌耐药性、动物机体药物残留等通过环境或食物链影响食品安全甚至人类健康的严重后果。中西药组合用法仍无法从根源上解决细菌耐药性以及西药残留的问题。因此，一种价格低廉、生产工艺简单的中药组方制剂则成为最具潜力的西药代替药物。

申请人之前递交了名称为：一种防治鸡白痢的制剂及其制备方法，专利申请号：201510345091.7，该制剂包含以下重量份的原料：苦玄参160～210份、桃金娘根140～80份、辅料Ⅰ130～170份或辅料Ⅱ4～6份、水适量；所述的苦玄参为玄参科植物苦玄参Picriafel-terrae Lour的干燥全草；所述桃金娘根为桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtustomentosa的干燥根，所述辅料Ⅰ为蔗糖、糊精；所述辅料Ⅱ为苯甲酸钠、聚山梨酯。该产品仅限于沙门氏菌引起的鸡白痢，制备的产品苦玄参中有效成分的含量低。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种治疗动物湿热泻痢证制剂、制备方法及质量检测方法。本发明以苦玄参、桃金娘根、南刘寄奴和救必应，再选择合适的辅料和工艺，制备的药剂有效成分含量提高，产品的用途扩宽，可用于由鸡沙门氏菌、鸡大肠杆菌、猪沙门氏菌、猪大肠杆菌、牛大肠杆菌等)、病毒(如猪传染性胃肠炎、猪病毒性腹泻等)、霉菌等引起，用于鸡、猪、牛的湿热泻痢证。同时还提供简便、定量准确，能全面检测本制剂内在质量及稳定性的HPLC-PAD质量检测方法。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种治疗动物湿热泻痢证制剂，以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片150～220份、桃金娘根饮片260～370份、南刘寄奴饮片60～100份、救必应饮片300～420份、辅料500～750份和乙醇45-70份；所述辅料由蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。

进一步地，所述辅料中蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯的质量比为5-10:2-5:0.01-0.2:0.05-0.15。

进一步地，所述苦玄参饮片、桃金娘根饮片、南刘寄奴饮片和救必应饮片为市售产品，饮片是经过清洗、切段、烘干等炮制而成。

本发明还提供所述治疗动物湿热泻痢证制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取液制备：取苦玄参饮片150～220份置于提取罐内，加入1500份pH＝11的碱性水，95～99℃下搅拌加热50～70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得苦玄参提取液；取桃金娘根饮片260～370份、南刘寄奴饮片60～100份、救必应饮片300～420份合并置于提取罐内，加入水6200份的水，95～99℃下搅拌加热50～70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得混合提取液；

(2)浸膏粉制备：将步骤苦玄参提取液以及混合提取液分别在0.06Pa、80℃下浓缩成相对密度1.02的浓缩液，2000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液30μm滤膜精滤，喷雾干燥，分别得到苦玄参浸膏粉和混合浸膏粉，混合均匀，得总浸膏粉；

(3)颗粒制剂制备：在总浸膏粉加入辅料500～750份、乙醇45-70份，搅拌15-30min制得软材，将软材过16目筛得湿颗粒，将湿颗粒放入干燥机中80-100℃干燥30-60分钟，得到含水量≤5％的干颗粒，将干颗粒在14目筛中制粒，即为治疗动物湿热泻痢证的颗粒剂。

进一步地，步骤(2)所述喷雾干燥是提取液在进风温度170℃，出风温度80℃条件下进行。

进一步地，所述治疗动物湿热泻痢证制剂不仅可以制成颗粒剂，还能制成片剂、口服液、粉剂、胶囊剂、微囊剂等剂型。

本发明的另一目的还提供所述治疗动物湿热泻痢证制剂的质量检测方法，是采用HPLC-PAD同时测定制剂中紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA三种成分的含量，具体步骤如下：

S1:色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％磷酸水溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相，梯度洗脱，检测波长为200-300nm，柱温30-40℃，流速为1-3mL/min，进样量10-40μL；

S2:对照品溶液制备：取紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA对照品适量，精密称定，加甲醇稀释定容，混合均匀，即得混合对照品溶液；

S3:供试品溶液制备：精密取颗粒制剂适量，加入55％甲醇25mL，称重；超声提取30min，冷却到室温，称重，用55％甲醇补足，摇匀；用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

S4:测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。

进一步地，所述流动相A和流动相B的初始体积比为90:10。

进一步地，所述对照品溶液中每1mL含紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA为100μg。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

1、本发明以苦玄参、桃金娘根、南刘寄奴和救必应四味药，再选择合适的辅料和工艺，制备的药剂有效成分含量提高，产品的用途扩宽，可用于由鸡沙门氏菌、鸡大肠杆菌、猪沙门氏菌、猪大肠杆菌、牛大肠杆菌等)、病毒(如猪传染性胃肠炎、猪病毒性腹泻等)、霉菌等引起，用于鸡、猪、牛的湿热泻痢证；避免养殖生产中因长期使用西药所产生的耐药性问题、以及西药药物残留问题，降低对人类健康的危害，绿色健康养殖。

2、本发明先用碱水单提苦玄参饮片，再水提桃金娘根、南刘寄奴、救必应，分别浓缩煎液，分别喷雾干燥获得浸膏粉，混匀得总浸膏粉，再制成颗粒剂，通过单提苦玄参，使君药苦玄参中有效成分的含量明显提高，制成兽用颗粒剂，运输方便、储存方便、使用方便，与饮用水混饮或与饲料混饲皆可，尤其适用于群体给药，适合规模化养殖的预防和保健用药。

3、本发明在颗粒制剂的制备过程中加入由蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯组成的辅料，使得药物的吸湿率更低、流动性更好，提高药物的稳定性和加工性能。

4、中药制剂一般只检测一种或两种指标成分，不能全面检测药物内在质量，本发明方法利用高效液相色谱仪结合PAD检测器的优点进行定量分析，能够同时测定苦玄参苷IA、长梗冬青苷、紫丁香苷3种成分的含量，可起到全面检测制剂内在质量及稳定性的作用，以保证该产品用药的安全性和有效性，对药品能够实现全面的质量控制。

附图说明

图1为紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA混合对照品色谱图；

图2为紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA混合供试品色谱图；

图2中：紫丁香苷Rt＝16.341min；长梗冬青苷Rt＝26.965min；苦玄参苷IA Rt＝32.198min。

图3为紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

实施例1

一种治疗动物湿热泻痢证制剂，以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片150份、桃金娘根饮片260份、南刘寄奴饮片60份、救必应饮片300份、蔗糖350份、糊精145份、聚丙烯酸钠3份、羟丙基二淀粉磷酸酯2份和70％乙醇47份。

其制备方法，包括如下步骤：

(1)提取液制备：取苦玄参饮片150份置于提取罐内，加入1500份pH＝11的碱性水，95～99℃下搅拌加热60分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得苦玄参提取液；取桃金娘根饮片260份、南刘寄奴饮片60份、救必应饮片300份合并置于提取罐内，加入水6200份的水，95～99℃下搅拌加热60分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得混合提取液；

(2)浸膏粉制备：将步骤苦玄参提取液以及混合提取液分别在0.06Pa、80℃下浓缩成相对密度1.02的浓缩液，2000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液30μm滤膜精滤，滤液在进风温度170℃，出风温度80℃条件下进行喷雾干燥，分别得到苦玄参浸膏粉和混合浸膏粉，混合均匀，得总浸膏粉；

(3)颗粒制剂制备：在总浸膏粉加入蔗糖350份、糊精145份、聚丙烯酸钠3份、羟丙基二淀粉磷酸酯2份、乙醇47份，搅拌15min制得软材，将软材过16目筛得湿颗粒，将湿颗粒放入干燥机中80℃干燥30分钟，得到含水量≤5％的干颗粒，将干颗粒在14目筛中制粒，即为治疗动物湿热泻痢证的颗粒剂。

实施例2

一种治疗动物湿热泻痢证制剂，以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片220份、桃金娘根饮片370份、南刘寄奴饮片80份、救必应饮片380份、蔗糖600份、糊精140份、聚丙烯酸钠6份、羟丙基二淀粉磷酸酯4份和70％乙醇70份。

其制备方法，包括如下步骤：

(1)提取液制备：取苦玄参饮片220份置于提取罐内，加入2200份pH＝11的碱性水，95～99℃下搅拌加热70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得苦玄参提取液；取桃金娘根饮片370份、南刘寄奴饮片80份、救必应饮片380份合并置于提取罐内，加入水8300份的水，95～99℃下搅拌加热70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得混合提取液；

(2)浸膏粉制备：将步骤苦玄参提取液以及混合提取液分别在0.06Pa、80℃下浓缩成相对密度1.02的浓缩液，2000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液30μm滤膜精滤，滤液在进风温度170℃，出风温度80℃条件下进行喷雾干燥，分别得到苦玄参浸膏粉和混合浸膏粉，混合均匀，得总浸膏粉；

(3)颗粒制剂制备：在总浸膏粉加入蔗糖600份、糊精140份、聚丙烯酸钠6份、羟丙基二淀粉磷酸酯4份、乙醇70份，搅拌25min制得软材，将软材过16目筛得湿颗粒，将湿颗粒放入干燥机中80℃干燥30分钟，得到含水量≤5％的干颗粒，将干颗粒在14目筛中制粒，即为治疗动物湿热泻痢证的颗粒剂。

实施例3

一种治疗动物湿热泻痢证制剂，以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片185份、桃金娘根饮片310份、南刘寄奴饮片80份、救必应饮片350份、蔗糖500份、糊精100份、聚丙烯酸钠5份、羟丙基二淀粉磷酸酯5份和70％乙醇60份。

其制备方法，包括如下步骤：

(1)提取液制备：取苦玄参饮片185份置于提取罐内，加入1850份pH＝11的碱性水，95～99℃下搅拌加热60分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得苦玄参提取液；取桃金娘根饮片310份、南刘寄奴饮片80份、救必应饮片350份合并置于提取罐内，加入水7400份的水，95～99℃下搅拌加热60分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得混合提取液；

(2)浸膏粉制备：将步骤苦玄参提取液以及混合提取液分别在0.06Pa、80℃下浓缩成相对密度1.02的浓缩液，2000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液30μm滤膜精滤，滤液在进风温度170℃，出风温度80℃条件下进行喷雾干燥，分别得到苦玄参浸膏粉和混合浸膏粉，混合均匀，得总浸膏粉；

(3)颗粒制剂制备：在总浸膏粉加入蔗糖500份、糊精100份、聚丙烯酸钠5份、羟丙基二淀粉磷酸酯5份、乙醇60份，搅拌30min制得软材，将软材过16目筛得湿颗粒，将湿颗粒放入干燥机中80℃干燥30分钟，得到含水量≤5％的干颗粒，将干颗粒在14目筛中制粒，即为治疗动物湿热泻痢证的颗粒剂。

二、实验性临床试验

(一)本发明实施例1-3制得的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂对鸡湿热泻痢的临床疗效试验

1.试验药物

应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂、对照例为201510345091.7实施例1制得的苦玄参桃金娘颗粒剂。

2.试验菌株

大肠杆菌标准菌株CVCC1555。

3.试验动物

广西南宁良凤花鸡14日龄幼鸡，体重139～188g。

4.饲料

不含药物的漓源511饲料。

5.试验方法

(1)分组与处理：经摸索试验，给予14日龄雏鸡腹腔注射大肠杆菌CVCC1555菌液0.5mL/只(1×10¹¹CFU/mL)，建立鸡湿热泻痢证模型。然后，将上述纳入病例的250只病雏鸡随机分为5组，每组50只，分别阳性对照组(感染不给药)、实施例1-3试验组(感染给药)、对比例组(感染给药),所述对比例组为专利201510345091.7实施例1制得的苦玄参桃金娘颗粒剂，实施例1-3、对比例试验组在感染后24h混饮给药，给药剂量均为1g/L/d，连用5d，限水后混饮。另设空白对照组，为健康14日龄雏鸡50只，不给药不给菌、隔离饲喂。

(2)试验时间及疗效判断标准：试验在停止给药后继续观察14天；记录并计算总有效率、死亡率、相对增重率，并与对照组进行比较。①治愈：用药后灰白色下痢或血痢，肛门潮湿，里急后重，角膜混浊，体温升高等主要症状消失，精神食欲恢复正常，且不复发判为治愈，计算治愈率。②显效：用药后主要症状有所改善，精神食欲恢复正常，判为有效，计算显效率。③有效：用药后主要症状有所改善，精神食欲明显改善，判为有效，计算有效率。总有效率＝治愈率+显效率+有效率。④无效：在用药后发病症状无改善或加重、死亡或者在停药观察期内复发，判为无效。⑤死亡率：感染动物死亡，或发病动物在观察期内死亡。死亡率＝死亡动物数/试验动物数×100％。⑥增重：试验期内动物体重的增长情况。增重率(％)＝(试验后平均体重－试验前平均体重)/试验前平均体重×100％。

(3)数据分析：采用X2检验并借助SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析。

6.结果与分析

表1 实施例1-3颗粒剂对鸡湿热泻痢证的治疗效果

注：▲表示自愈，与阳性对照组比较，P*<0.05；P**<0.01；与对比例比较，P^#<0.05；P^##<0.01。

由表1可知，实施例1-3与对比例实验组治愈率分别为70.0％、68.0％、66.0％、50.0％，总有效率分别为94.0％、92.0％、92.0％、82.0％，实施例1-3、对比例实验组的治愈率、总有效率与阳性药物组比较差异均极显著(p<0.01)，表明实施例1-3、对比例对鸡湿热泻痢证均有良好的疗效。在总有效率分析中，实施例1-3、对比例组与阳性药物组差异极显著(p<0.01)；实施例1-3组的治愈率、总有效率与对比例组相比较，差异均显著(P＜0.05)，表明实施例1-3的疗效优于对比例。结论：本发明实施例制得的颗粒剂和对比例对人工诱发鸡湿热泻痢证均有良好的治疗效果，但实施例1-3明显优于对比例。

(二)本发明实施例1-3制得的颗粒对猪湿热泻痢的临床疗效试验

1.试验药物

应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂、市售白龙散。

2.试验动物

自然感染湿热泻痢的8～15日龄三元杂小猪120头，未经任何药物治疗。

3.试验地点

广西某猪场。

4.试验方法

(1)病例的选择

①主症：里急后重，泻粪稀薄或呈水样，腥臭甚至恶臭，排粪次数明显增多，肛门红肿，体温升高。

②次症：精神沉郁，食欲减少或废绝，口渴多饮，尿短赤，口色红，舌苔黄厚。

③纳入标准：符合主症3-4项，次症1-2项，即为试验猪。

(2)试验动物分组及处理

选择8～15日龄符合纳入病例标准的供试猪，随机分为4组：分别为治疗试验药物(实施例1-3)组、白龙散对比例组。供试验动物随机分组，每组30头。

实施例1-3和白龙散，按2g/kg，灌服，一日2次，连续用药三天。

(3)试验时间及疗效评价标准

试验在停止给药后继续观察15天；记录并计算痊愈率、总有效率、无效率，并与对照组进行比较。

①痊愈：治疗后患猪泻粪稀薄或呈水样或腥臭甚至恶臭，排粪次数，肛门红肿，体温升高等主要症状消失，精神食恢复正常且观察期内无复发判为痊愈。根据痊愈头数占该组头数的比例计算痊愈率。

②有效：治疗后患猪粪便变稠，排便次数减少，肛门红肿有所改善，精神、食欲改善。有效头数与痊愈头数之和为总有效头数，根据总有效头数与该组头数的比例计算总有效率。

③无效：治疗后患猪粪便、排便次数、肛门红肿、舌苔、精神、食欲仍无明显改善，甚至死亡。根据无效头数占该组头数的比例计算无效率。

5.结果与分析

实施例1-3对猪湿热泻痢的痊愈率分别为80.0％、80.0％、76.6％，总有效率分别为：93.3％、93.3％、93.3％；对比例组的痊愈率和总有效率分别为60％和86.7％。结果详见表2。

表2 实施例1-3颗粒剂对猪湿热泻痢的临床疗效

注：与白龙散对比例比较，P*<0.05；P**<0.01。

经生物统计(X2检验)对用药各组的疗效进行差异性检验，结果：实施例1-3组的痊愈率与白龙散对比例组之间比较，差异显著(P<0.05)，而实施例1-3组与对比例组在总有效率方面差异并不显著(P>0.05)，但仍高出6.6个百分点。结果表明：实施例1-3颗粒制剂临床上对猪湿热泻痢的治愈效果优于对比例白龙散。

现代中兽医认为，猪湿热泻痢多因形气不足，卫外不固，多雨潮湿，冷热不和，场地污秽，乳汁不化，脾胃失常，疫毒内侵为害，以致清浊不分，水湿下注而泄泻。治宜清热解毒，涩肠止泻。

颗粒制剂由苦玄参为君药，辅以桃金娘根、南刘寄奴和救必应三味南方特色中草药组方而成。根据中兽医辩证施治理、法、方、药的组方原则，针对动物湿热泻痢证，确立了“清热解毒、收敛止泻、利湿止痛”的治疗原则，具有清热解毒，收敛止泻，利湿止痛之功效，用于湿热泻痢的防治。

本试验用实施例颗粒制剂治疗猪湿热泻痢，取得较好的效果，相同剂量下的痊愈率、总有效率均优于对比例组白龙散。因此治疗药物的临床推荐剂量为2g/kg体重，一日2次，连用3日为宜。

(三)本发明实施例1-3制得的颗粒对牛湿热泻痢的临床疗效试验

1.试验药物

应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂、市售白头翁散。

2.试验动物

自然感染湿热泻痢的1-2周龄犊牛200头，未经任何药物治疗。

3.实验地点：广西某奶牛场。

4.试验方法：

(1)病例的选择

①主症：泻粪薄粘腻，污秽腥臭，泻色棕褐或带浓血，泻粪不爽，里急后重，体温升高。

②次症：精神沉郁，食欲减少或废绝，尿色黄少，反刍减少或停止，鼻镜干燥，弓腰努责，口舌赤红稍黄。

③纳入标准：符合主症3-4项，次症1-2项，即为试验牛。

(2)试验动物分组及处理

选择1-2周龄符合纳入病例标准的供试牛200，随机分为4组，每组50头，分别为治疗药物组(实施例1-3)和白头翁散药物对比例组。实施例1-3，按1g/kg进行灌服，一日2次，连续用药3天；对比例为白头翁散2g/kg，灌服，一日2次，连续用药三天。

(5)试验时间及疗效评价标准：试验在停止给药后继续观察4天；记录并计算治愈率、无效率、总有效率与对照组进行比较。

①治愈：泻粪薄粘腻、污秽腥臭、泻色棕褐或带浓血、尿色黄少、泻粪不爽、里急后重等主要症状消失，精神食恢复正常且观察期内无复发判为治愈，计算治愈率。

②有效：治疗后患牛粪便变稠，排便次数减少，里急后重等主要症状有所改善，精神、食欲明显改善，判为有效，根据治愈数、有效数，计算总有效率。总有效率＝(治愈数+有效数)/各组头数*100％。

③无效：在用药后临床证候无改善或加重、死亡或者在停药观察期内复发，判为无效。

5.结果与分析：

各给药组的治疗结果见表3。

表3 实施例1-3颗粒剂对牛湿热泻痢的临床治疗效果

注：与对比例组比较，P*<0.05；P**<0.01。

实施例1-3、白头翁散对比例组的治愈率分别为70.0％、68.0％、70.0％和62.0％，总有效率分别为88.0％、84.0％、88.0％和76.0％。在进行疗效差异检验时，实施例1、实施例3的总有效率与对比例之间比较，差异显著(P<0.05)，表明实施例1、3的总体疗效优于对比例组。同时，实施例1-3为颗粒制剂，易溶于水，可制成溶液剂后灌服，而白头翁散只能制成糊状然后灌服使用，由于中药粉末不易溶于水，因此药物粉末易在口腔或食道中有所滞留，给药剂量不太准确，同时给药亦没有颗粒剂溶于水后形成的溶液灌服方便(白头翁散为中药散剂，是将白头翁等四味药材简单粉碎混合而成，工艺简单，有效成分不易溶出)。实施例的给药剂量亦仅为对比例的一半，用量更少。

实施例1-3颗粒和《中国兽药典》2015年版二部收载的常用药物白头翁散对牛湿热泻痢均有一定的治疗效果，但实施例颗粒剂疗效更优，用量更少，使用更加方便。结果表明，实施例1-3颗粒可以作为牛湿热泻痢的一个新的有效治疗药物。

三、安全性试验

(一)本发明实施例1-3制得的颗粒对鸡安全性试验。

1.试验药物：应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂。

2.试验对象：广西南宁良凤花鸡14日龄幼鸡，体重139～188g。

3.试验方法：将14日龄的良凤花鸡以临床推荐剂量的10倍量给药，连用5天，停药后观察14天。

4.结果：试验期间无死亡。

5.结论：实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂对鸡无毒性作用，临床使用安全。

(二)本发明实施例1-3制得的颗粒对猪安全性试验。

1.试验药物：应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂。

2.试验对象：8-15日龄的健康仔猪15头。

3.试验地点：广西某猪场。

4.试验方法：8-15日龄的健康仔猪以临床推荐剂量的5倍给药，即10g/kg，一日2次，连续用药三天，停药后观察14天。

5.结果：试验期间无死亡。

6.结论：实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂对猪无毒性作用，临床使用安全。

(三)本发明实施例1-3制得的对牛安全性试验。

1.试验药物：应用实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂。

2.试验对象：1-2周龄的健康犊牛15头。

3.试验地点：广西某奶牛场。

4.试验方法：1-2周龄的健康犊牛以临床推荐剂量的5倍给给予实施例1-3制得的药物，即5g/kg，一日2次，连续用药三天，停药后观察14天。

5.结果：试验期间无死亡。

6.结论：实施例1-3所制备的治疗动物湿热泻痢证颗粒剂对牛无毒性作用，临床使用安全。

四、利用HPLC-PAD法同时测定颗粒制剂中多种有效成分方法

1试验材料

1.1药品

对照品苦玄参苷IA(批号：111745-200501)、紫丁香苷(批号：18080602)、长梗冬青苷(批号：20040803)；三批制剂批号分别为；20190810、20190815、20190819。

1.2试剂

甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

1.3仪器设备

Waters e2695高效液相色谱仪；二级管陈列检测器(PAD)；电子天平Discovery；数控超声波清洗仪(型号：KQ-250DE)；纯水仪(型号：CD-UPT-II-20L)；

2试验方法与结果

2.1试验方法

2.1.1混合对照品溶液的配制

精密称取苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷对照品适量，加甲醇稀释成每1mL分别含苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷100μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

称取颗粒制剂适量，精密加入55％甲醇25mL，称重；超声提取30min，冷却到室温，称重，用55％甲醇补足，摇匀；用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2色谱条件

Inertsil ODS-3 C18(4.6×250mm，5μm)；以0.1％磷酸水溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相，梯度洗脱(见表4)，检测波长为264nm，柱温30℃，进样量20μL。

表4 流动相梯度洗脱条件

2.3专属性考察

2.3.1线性关系考察

苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的标准溶液在10-100μg/mL范围内，各浓度与其响应值(峰面积)成良好的线性相关，对浓度(X)与峰面积(Y)进行线性回归，得出苦玄参苷IA线性方程为：y＝12295x-4800.5，相关系数r＝0.9991；紫丁香苷线性方程为：y＝53917x+35917，相关系数r＝0.9992；长梗冬青苷线性方程为：y＝5192.9x-4468.3，相关系数r＝0.9993。

2.3.2精密度试验

分别取苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷混合对照品溶液100μg/mL，按“2.2色谱条件”进行HPLC-PAD测定，连续进样6次，测定峰面积。结果如表5所示，苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的RSD分别为0.45、0.38和0.73％。说明精密度良好。

表5：精密度试验结果

2.3.3稳定性试验

称取颗粒制剂1g，按供试品制备方法制备样品，按“2.2色谱条件”进行HPLC-PAD测定，于0、2、4、6、8、12h进样测定。结果如表6所示，苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的RSD分别为0.73、0.29和0.65％，表明样品稳定性良好。

表6：稳定性试验结果

2.3.4重复性试验

称取颗粒制剂同一批次样品6份，按供试品制备方法制备样品，按“2.2色谱条件”进行HPLC-PAD测定，测定苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷含量。结果如表7所示，苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的RSD分别为0.94、0.51和0.62％，表明重复性良好。

表7：重复性试验结果

2.3.5加样回收率试验

取已知含量的颗粒制剂，加入已知浓度的对照品溶液，按供试品制备方法制备样品，按“2.2色谱条件”进行HPLC-PAD测定，测定苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷含量。结果如表8所示，苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的平均回收率分别为97.21、96.14和97.12％，RSD分别为0.84、0.90和0.93％，表明回收率良好。

表8：加样回收率试验结果

2.3.6样品测试

取三批颗粒制剂，称取1g，按供试品制备方法制备样品，按“2.2色谱条件”进行HPLC-PAD测定，测定苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷含量。结果如表9所示。

表9：三批颗粒制剂含量测定(n＝3)

从表中可知三批颗粒制剂中苦玄参苷IA、紫丁香苷、长梗冬青苷的含量分别为(0.10±0.01)％、(1.12±0.02)％和(3.82±0.08)％。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种治疗动物湿热泻痢证制剂，其特征在于：以质量份数计包括以下组分：苦玄参饮片150～220份、桃金娘根饮片260～370份、南刘寄奴饮片60～100份、救必应饮片300～420份、辅料500～750份和乙醇45-70份；所述辅料由蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。

2.根据权利要求1所述治疗动物湿热泻痢证制剂，其特征在于：所述辅料中蔗糖、糊精、聚丙烯酸钠和羟丙基二淀粉磷酸酯的质量比为5-10:2-5:0.01-0.2:0.05-0.15。

3.如权利要求1或2所述一种治疗动物湿热泻痢证制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取液制备：取苦玄参饮片150～220份置于提取罐内，加入1500份pH＝11的碱性水，95～99℃下搅拌加热50～70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得苦玄参提取液；取桃金娘根饮片260～370份、南刘寄奴饮片60～100份、救必应饮片300～420份合并置于提取罐内，加入6200份的水，95～99℃下搅拌加热50～70分钟，300目粗滤得滤液，取滤液，重复上述步骤2次，合并滤液，得混合提取液；

(2)浸膏粉制备：将步骤苦玄参提取液以及混合提取液分别在0.06Pa、80℃下浓缩成相对密度1.02的浓缩液，2000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液30μm滤膜精滤，喷雾干燥，分别得到苦玄参浸膏粉和混合浸膏粉，混合均匀，得总浸膏粉；

(3)颗粒制剂制备：在总浸膏粉中加入辅料500～750份、乙醇45-70份，搅拌15-30min制得软材，将软材过16目筛得湿颗粒，将湿颗粒放入干燥机中80-100℃干燥30-60分钟，得到含水量≤5％的干颗粒，将干颗粒在14目筛中制粒，即为治疗动物湿热泻痢证的颗粒剂。

4.根据权利要求3所述治疗动物湿热泻痢证制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述喷雾干燥是提取液在进风温度170℃，出风温度80℃条件下进行。

5.一种用于如权利要求1-4所述治疗动物湿热泻痢证制剂的质量检测方法，其特征在于：所述质量检测方法是采用HPLC-PAD同时测定制剂中紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA三种成分的含量，具体步骤如下：

S1:色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％磷酸水溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相，梯度洗脱，检测波长为200-300nm，柱温30-40℃，流速为1-3mL/min，进样量10-40μL；

S2:对照品溶液制备：取紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA对照品适量，精密称定，加甲醇稀释定容，混合均匀，即得混合对照品溶液；

S3:供试品溶液制备：精密取颗粒制剂适量，加入55％甲醇25mL，称重；超声提取30min，冷却到室温，称重，用55％甲醇补足，摇匀；用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

S4:测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。

6.根据权利要求5所述治疗动物湿热泻痢证制剂的质量检测方法：其特征在于：所述流动相A和流动相B的初始体积比为90:10。

7.根据权利要求5所述治疗动物湿热泻痢证制剂的质量检测方法：其特征在于：所述对照品溶液中每1mL含紫丁香苷、长梗冬青苷、苦玄参苷IA为100μg。

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