CN112672742B - 纤维化治疗用医药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对肺泡上皮细胞不显示损伤性、诱导肺成纤维细胞的选择性细胞死亡并且抑制肺的纤维化的新型纤维化治疗药。纤维化治疗用医药组合物含有式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物。(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。式(II)中，n表示8～12的整数。)
Description
技术领域
本发明涉及一种纤维化治疗用医药组合物。
背景技术
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis；IPF)是预后不良的顽症，诊断后的中位生存期非常短，至2.8－4.2年。迄今为止，作为IPF治疗药，可以使用类固醇或免疫抑制剂，但在大规模的临床试验中，都报道称没有效果。另外，作为抗纤维化药，近年来上市了吡非尼酮和尼达尼布这样的2种新药。这些医药在临床试验中抑制了IPF患者的用力肺活量(forced vital capacity；FVC)下降(非专利文献1～3)，但关于长期使用时的有效性，尚不明确。另外，两种药物都引起高频且严重的副作用、特别是肠胃障碍已成为问题(非专利文献2、3)。因此，开发更安全且有效的新型IPF治疗药非常重要。
IPF的发作和恶化机理尚不明确，考虑主要原因在于各种刺激损伤了肺泡上皮细胞，因此肺成纤维细胞异常增殖、活化(非专利文献4～6)。具体而言，在IPF患者的肺组织中，作为成纤维细胞活化后的结果，有报道称肌成纤维细胞增加并蓄积(非专利文献7)。另外，也有报道称在动物的IPF模型中，与人同样，肌成纤维细胞增加并蓄积(非专利文献8)。作为其结果，考虑是由于胶原蛋白等细胞外基质异常产生并蓄积，进行了异常的修复或重塑，从而肺进行纤维化。
肌成纤维细胞的来源已有若干报道，大致分为由成纤维细胞分化的细胞和由上皮间质转化(epithelial－mesenchymal transition；EMT)分化的细胞。具体而言，有报道称通过转化生长因子(transforming growth factor(TGF))－β1等的刺激作用于成纤维细胞，分化为肌成纤维细胞(非专利文献9)。另一方面，也明确了在TGF－β1作用于肺泡上皮细胞时，上皮间质转化被诱导，肺泡上皮细胞转化成肌成纤维细胞(非专利文献10、11)。因此，认为对肺泡上皮细胞不显示损伤性并抑制向肌成纤维细胞的诱导的化合物或者抑制成纤维细胞产生胶原蛋白的化合物是IPF的良好的治疗药。实际上，有报道称近年来已上市的吡非尼酮和尼达尼布抑制从成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化、肺泡上皮细胞的EMT以及活化后的成纤维细胞产生胶原蛋白(非专利文献12～14)。
现有技术文献
专利文献
非专利文献1：Am.J.Respir.Crit.Care Med.192,e3－e19(2015)
非专利文献2：Lancet 377,1760－1769(2011)
非专利文献3：N.Engl.J.Med.370,2071－2082(2014)
非专利文献4：Am.J.Pathol.170,1807－1816(2007)
非专利文献5：Chest 122,286S－289S(2002)
非专利文献6：Chest 132,1311－1321(2007)
非专利文献7：Int.J.Mol.Med.34,1219－1224(2014)
非专利文献8：Physiol.Rep.2,(2014)
非专利文献9：Proc.Am.Thorac.Soc.5,338－342(2008)
非专利文献10：Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol 293,L525－534(2007)
非专利文献11：Respir Res.6,56(2005)
非专利文献12：Eur.J.Pharm.Sci.58,13－19(2014)
非专利文献13：BMC Pulm Med.12,24(2012)
非专利文献14：J.Pharmacol.Exp.Ther.349,209－220(2014)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题在于：提供一种对肺泡上皮细胞不显示损伤性、诱导肺成纤维细胞的选择性细胞死亡并且抑制肺的纤维化的新型纤维化治疗药。
用于解决技术问题的技术方案
因此，为了发现具有上述作用的药物，本发明的发明人利用对人的安全性被充分确认了的已批准药物进行了各种研究，结果发现下述式(I)或(II)所示的化合物对肺泡上皮细胞不显示损伤性，选择性地对肺成纤维细胞发挥作用，并且具有优异的体内(in vivo)肺纤维化抑制作用，从而完成了本发明。
即，本发明提供如下的发明〔1〕～〔14〕。
〔1〕一种纤维化治疗用医药组合物，其含有式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物。
(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
式(II)中，n表示8～12的整数。)
〔2〕如〔1〕所述的医药组合物，其含有式(I)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物。
〔3〕如〔2〕所述的医药组合物，其中，在式(I)中，l为4或5，R1为甲基、乙基或三氟甲基。
〔4〕如〔2〕或〔3〕所述的医药组合物，其中，在式(I)中，l为5，R1为甲基或乙基。
〔5〕如〔1〕所述的医药组合物，其含有式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物。
〔6〕如〔5〕所述的医药组合物，其中，在式(II)中，n为10。
〔7〕如〔1〕～〔6〕中任一项所述的医药组合物，其中，上述纤维化为肺纤维化。
〔8〕如〔7〕所述的医药组合物，其中，上述肺纤维化为特发性肺纤维化。
〔9〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的医药组合物，其被制剂化而用于经呼吸道给药。
〔10〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的医药组合物，其被制剂化而用于经口给药。
〔11〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的医药组合物，其被制剂化而用于经静脉给药。
[12]一种式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物，其用于治疗纤维化。
(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
式(II)中，n表示8～12的整数。)
[13]式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物在制造纤维化治疗用医药组合物中的用途。
(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
式(II)中，n表示8～12的整数。)
[14]一种纤维化的治疗方法，其特征在于：给药有效量的式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐或它们的溶剂合物。
(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
式(II)中，n表示8～12的整数。)
发明效果
式(I)或式(II)所示的化合物都已作为药品使用的化合物，是对人的稳定性已被确认了的化合物。而且，这些化合物显示与目前已知的药理作用完全不同的作用，即以对肺泡上皮细胞不显示损伤性的量，对肺成纤维细胞显示选择性的细胞死亡诱导作用，并且显示肺纤维化抑制作用，作为纤维化治疗药、特别是特发性肺纤维化治疗药是有用的。
附图说明
图1A表示艾地苯醌(idebenone)对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图1B表示艾地苯醌对LL29细胞和A549细胞的LDH活性的作用。
图1C表示艾地苯醌对LL29细胞的细胞死亡的作用。
图1D表示艾地苯醌对A549细胞的细胞死亡的作用。
图2表示吡非尼酮和尼达尼布对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图3A表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图3B表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(阿希克罗夫特评分(Ashcroftscore))的作用。
图3C表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图3D表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的作用。
图4A表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图4B表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(阿希克罗夫特评分)的治疗效果。
图4C表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的治疗效果。
图4D表示艾地苯醌(Ide)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的治疗效果。
图5A表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图5B表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(阿希克罗夫特评分)的作用。
图5C表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图6A表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图6B表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(阿希克罗夫特评分)的作用。
图6C表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图7A表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对肌成纤维细胞(α－SMA细胞染色)的效果。
图7B表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对肌成纤维细胞(α－SMA阳性细胞数)的效果。
图8A表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对胶原蛋白的作用。
图8B表示艾地苯醌(Ide)和CoQ10对α－SMA、COL1A1的作用。
图9A表示托哌酮(tolperisone)对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图9B表示吡非尼酮和尼达尼布对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图10A表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图10B表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图10C表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图10D表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的作用。
图11A表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图11B表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图11C表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图11D表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的作用。
图12A表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图12B表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图12C表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的治疗效果。
图12D表示托哌酮(Tol)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的治疗效果。
图13A表示同种同效药(乙哌立松(eperisone)、替扎尼定(tizanidine))对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图13B表示同种同效药(兰吡立松(lanperisone)、依那立松(inaperisone))对LL29细胞和A549细胞的活细胞数(％)的作用。
图14A表示乙哌立松(Epe)和替扎尼定(Tiza)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图14B表示乙哌立松(Epe)和替扎尼定(Tiza)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的作用。
图14C表示乙哌立松(Epe)和替扎尼定(Tiza)对BLM依赖性肺纤维化(羟脯氨酸量)的作用。
图14D表示乙哌立松(Epe)和替扎尼定(Tiza)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的作用。
图15表示托哌酮(Tol)和乙哌立松(Epe)对α－SMA、COL1A1的作用。
图16A表示托哌酮(Tol)、吡非尼酮(Pir)和尼达尼布(Nin)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图16B表示托哌酮(Tol)、吡非尼酮(Pir)和尼达尼布(Nin)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图16C表示托哌酮(Tol)、吡非尼酮(Pir)和尼达尼布(Nin)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的治疗效果。
图17A表示乙哌立松(Epe)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图17B表示乙哌立松(Epe)对BLM依赖性肺纤维化(胶原蛋白染色)的治疗效果。
图17C表示乙哌立松(Epe)对BLM依赖性肺纤维化(全肺和肺泡的弹性阻力、FVC)的治疗效果。
具体实施方式
本发明的纤维化治疗用医药组合物所含的有效成分为式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的医药上能够允许的盐或它们的溶剂合物。
(式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
式(II)中，n表示8～12的整数。)
已知式(I)所示的化合物为镇痉药的一种，作用于中枢神经系统和血管平滑肌两者，通过缓和骨骼肌的疼痛、改善缺血、减轻紧张而改善肌肉紧张症，具有消除肌肉的硬块和痉挛的作用。然而，对纤维化的作用完全未知。特别而言，式(I)所示的化合物对于成纤维细胞、更优选肺成纤维细胞，具有特异性地诱导细胞死亡的效果。另外，式(I)所示的化合物具有特异性地抑制成纤维细胞、更优选肺成纤维细胞活化的效果。另外，式(I)所示的化合物具有抑制组织纤维化、特别是肺组织纤维化的效果。另外，式(I)所示的化合物具有抑制呼吸功能下降的效果。另外，式(I)所示的化合物具有抑制组织的损伤、特别是肺组织的损伤的效果。
式(I)中，作为R1的可以被卤原子取代的C1－4烷基，可以列举可以被1～3个氯原子、氟原子、溴原子或碘原子取代的C1－4烷基。具体可以列举甲基、乙基、三氟甲基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基等，更优选甲基、乙基、三氟甲基，进一步优选甲基、乙基。
式(I)中，l表示3～6的整数。其中，更优选3～5的整数，进一步优选4或5，进一步优选5。作为式(I)所示的化合物，更优选l为4或5且R1为甲基、乙基或三氟甲基的化合物，进一步优选l为5且R1为甲基或乙基的化合物。其中，l为5且R1为甲基的化合物为托哌酮。l为5且R1为乙基的化合物为乙哌立松。l为4且R1为乙基的化合物为依那立松。l为4且R1为三氟甲基的化合物为兰吡立松。
式(II)所示的化合物作为阿尔茨海默型认知症或认识障碍的治疗药而已知。
这些式(II)所示的化合物对纤维化的作用完全未知。特别而言，式(II)所示的化合物对于成纤维细胞、更优选肺成纤维细胞，具有特异性地诱导细胞死亡的效果。另外，式(II)所示的化合物具有特异性地抑制成纤维细胞、更优选肺成纤维细胞活化的效果。另外，式(II)所示的化合物具有抑制组织纤维化、特别是肺组织纤维化的效果。另外，式(II)所示的化合物具有抑制呼吸功能下降的效果。另外，式(II)的化合物具有抑制组织的损伤、特别是肺组织的损伤的效果。
式(II)中，n为8～12的整数，更优选9或10，进一步优选10。其中，n＝10的化合物为艾地苯醌。
作为式(I)或式(II)所示的化合物的盐，只要是医药上能够允许的盐，就没有特别限定，例如可以列举盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐、乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等有机酸盐。其中，更优选式(I)所示的化合物的盐酸盐。
作为式(I)或式(II)所示的化合物或该化合物的医药上能够允许的盐的溶剂合物，可以列举水合物、醇合物等，更优选水合物。
式(I)或式(II)所示的化合物如上所述，为已知的化合物，可以利用公知的制造方法进行制造。
式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的医药上能够允许的盐或它们的溶剂合物如后述实施例所示，以对肺泡上皮细胞不显示损伤性的量，对肺成纤维细胞显示选择性的细胞死亡诱导作用，还显示优异的肺纤维化抑制作用。因此，这些化合物作为各种纤维化治疗药是有用的。其中，作为纤维化，可以列举肺纤维化、特发性肺纤维化、硬皮病、肾纤维化、肝纤维化、心脏纤维化和其他脏器或组织的纤维化，优选用于肺纤维化、特发性肺纤维化，特别优选用于特发性肺纤维化。
因此，含有式(I)或式(II)所示的化合物、该化合物的医药上能够允许的盐或它们的溶剂合物的医药组合物作为纤维化治疗用医药组合物、更优选肺纤维化治疗用医药组合物、进一步优选特发性肺纤维化治疗用医药组合物是有用的。
作为本发明的医药组合物的形态，可以例示经口给药用制剂(片剂、包衣片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂等)、经呼吸道给药用制剂、腹腔内给药用制剂、经静脉给药制剂、注射剂、栓剂、贴剂、软膏等，优选经口给药用制剂、经呼吸道给药用制剂或经静脉给药用制剂。其中，由于动物的腹腔内给药被本领域技术人员认为是与人的经静脉给药同等的给药途径，因此动物的腹腔内给药的结果可以视为人的经静脉给药的结果。
这些给药方式除了上述有效成分以外，还可以使用药学上能够允许的载体，利用通常公知的方法进行调制。作为这样的载体，可以例示通常的医药所通用的各种物质，例如赋形剂、结合剂、崩解剂、光滑剂、稀释剂、溶解辅助剂、悬浮剂、等渗剂、pH调整剂、缓冲剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。
本发明医药组合物的给药量因给药途径、性别、体重、年龄、症状等而不同，作为上述有效成分量，通常优选使成人1日给药量为0.5mg～3000mg，更优选为1mg～300mg。关于1日给药量，可以单次给药，也可以多次给药。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更详细地说明。
实施例1
a.实验方法
(1)博来霉素(BLM)、艾地苯醌、托哌酮和乙哌立松的给药
对于正常饲养下的雄性ICR小鼠，首日经呼吸道给药BLM，制作BLM肺损伤模型小鼠。
前给药：从首日起至第7日为止，以1日1次经呼吸道给药艾地苯醌。首日在BLM给药1小时前经呼吸道给药艾地苯醌。
后给药：从第10日起至第18日为止，以1日1次经呼吸道给药艾地苯醌。两种药物均悬浮在0.9％NaCl中后使用。
后给药：从第10日起至第19日为止，以1日1次给药托哌酮。两种药物均悬浮在0.9％NaCl中后使用。
后给药：从第10日起至第19日为止，以1日1次给药乙哌立松。两种药物均悬浮在0.9％NaCl中后使用。
其中，由于动物的腹腔内给药被本领域技术人员认为是与人的经静脉给药同等的给药途径，因此动物的腹腔内给药的结果可以视为人的经静脉给药的结果。
(2)实时(Real－time)RT－PCR
使用RNeasy kit(Qiagen)提取细胞的总RNA(total RNA)。对于Total RNA 2.5μg，使用第一链cDNA合成试剂盒(first－strand cDNA synthesis kit)(TAKARA)，按照TAKARA公司的方案进行逆转录反应。对于所合成的cDNA，使用SsoFast EvaGreen Supermix，利用CFX96TM实时系统(Real time system)进行分析。为了使各自的反应中的总RNA量可比较，使用甘油醛－3－磷酸脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase(GAPDH))基因作为内部标准。
(3)细胞培养
使用含有10％FBS的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、含有15％FBS的Ham’s F－12K(Kaighn’s)培养基，在37℃、5％CO2的条件下分别培养A549细胞(人肺泡上皮细胞)、LL29细胞(来自IPF患者的肺成纤维细胞)。
关于活细胞数的测定，利用MTT法或使用CountessTM自动细胞计数仪(AutomatedCell Counter)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的锥虫蓝染色进行测定。关于细胞死亡的评价，基于检测试剂盒的方案测定培养基中的LDH活性。
(4)组织染色法和组织免疫染色法
将所摘出的肺组织在10％福尔马林(formalin)中固定24小时后，包埋在石蜡中，制作厚度4μm的石蜡切片。
关于H&E染色，首先，利用迈尔苏木精(Mayer’s hematoxyline)进行染色后，利用1％曙红(eosin)溶液进行染色。染色后，封入malino，使用NanoZoomer－XR数字切片扫描仪(digital slide scanner)(Hamamatsu Photonics，Shizuoka，Japan)或Olympus BX51microscope(Tokyo，Japan)进行组织学分析。
使用第一媒染液(5w/v％重铬酸钾(potassium dichromate)，5w/v％三氯乙酸(trichloroacetic acic))、魏格特铁苏木精(Weigert’s iron hematoxylin)、第二媒染液(1.25w/v％磷钨酸(phoaphotangstenic acid)，1.25w/v％磷钼酸(phosphomolybdicacid))、0.75w/v％橙黄G(orenge G)、丽春红/二甲苯胺混合液(0.12w/v％xylidineposeau，0.04w/v％酸性品红(acid fchsin)，0.02w/v％偶氮红(azophloxin))、苯胺蓝(aniline blue)，进行马森三色(Masson’s trichrome)染色。染色后，封入malinol，使用NanoZoomer－XR数字切片扫描仪(digital slide scanner)进行组织学分析。关于肺纤维化，利用阿希克罗夫特评分进行评分。另外，阿希克罗夫特评分参考了J.Clin.Pathol.41,467－470(1988)。
关于α－SMA的免疫染色法，利用2.5％山羊血清(goat serum)进行10min封闭后，进行一次抗体处理(againstα－SMA、1：100稀释(dilution))。12h后，利用Alexa Fluor 594山羊抗兔免疫球蛋白(goat anti－rabbit immunoglobulin)G和DAPI对切片进行2h培养。之后，封入VECTASHIELD。对于切片，利用显微镜(Olympus DP71)进行摄影。
α－SMA阳性区域利用Image J软件(software)(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)进行定量。另外，8－OHdG阳性细胞数利用Definiens TissueStudioTM software(CTC Life Science Corporation，Tokyo，Japan)进行定量。
(5)肺功能和用力肺活量的测定
使用计算机控制型小动物用呼吸机(FlexiVent；SCIREQ，Montreal，Canada)，按照现有文献测定肺功能。向水合氯醛(500mg/kg)麻醉下的小鼠的气管插入金属管(外径和内径分别为1.27mm、0.84mm)8mm，利用8.7ml/kg的一次换气量和2－3cm H2O的呼气末正压换气，以150breaths/min的速度使其机械呼吸。
总呼吸弹性阻力(total respiratory elastance)和组织弹性阻力(tissueelastance)分别利用快速发射(snap shot)和强迫振荡技术(forced oscillationtechnique)进行测定。另外，使用上述的计算机控制型小动物用呼吸机以及负压容器(SCIREQ，Montreal，Canada)，按照Chest142,1011－1019(2012)测定用力肺活量。利用FlexiVent software(version 5.3；SCIREQ，Montreal，Canada)分析所有数据。
(6)羟脯氨酸(Hydroxyproline)的定量
将所摘出的小鼠左肺上叶在0.5mL的5％TCA中均质化后，向离心分离而得到的沉淀物中加入浓盐酸0.5mL，以110℃加热16小时。由此，将沉淀物水解，提取羟脯氨酸(hydroxyproline)。对于所提取的羟脯氨酸(hydroxyproline)，加入1.4w/v％氯胺(chloramine)T并静置20分钟后，与Ehrich’s试剂(1M DMBA，70v/v％异丙醇(isopropanol)和30v/v％高氯酸(perchloric acid))一起以65℃加温10分钟，使其显色为红～紫。之后，测定吸光度(550nm)。
(7)统计学分析
用平均值±标准误差(standard error of the mean；SEM)表示所有值。显著性差异检验是通过单因素方差分析(One－way ANOVA)进行，多组间使用Dunnett检验(Dunnett’s test)进行，两组间使用Student t检验(Student’s t－test)进行。另外，检验使用SPSS22 software。P的值小于0.05时，判定为有显著性差异。
＊：p<0.05(相对于空白(vehicle))、＊＊：p<0.01(相对于空白(vehicle))、#：p<0.05(相对于BLM单独)、##：p<0.01(相对于BLM单独)
b－1.结果
(1)艾地苯醌对细胞死亡和细胞增殖的效果
在IPF的纤维化机理中，认为肺成纤维细胞的活化是重要的。迄今为止，有报道称在IPF患者的肺中，成纤维细胞异常增殖并活化，以及由活化后的肺成纤维细胞异常产生了胶原蛋白。因此，本发明人对肺泡上皮细胞不显示损伤性而选择性地对肺成纤维细胞发挥作用的已批准药物进行了筛选。在筛选中，将化合物所导致的肺成纤维细胞的细胞生存率的下降用作抑制肺成纤维细胞的活性的简单指标。
关于具体的方法，对来自IPF患者的肺成纤维细胞(LL29细胞)和人肺泡上皮细胞(A549细胞)分别用已批准药物进行处理，利用MTT法评价24小时后的细胞生存率。作为其结果，从LL29细胞的IC50(使细胞生存率下降50％所需的浓度)的值低于A549细胞的化合物中，选出了在两种细胞间能够特别显著地看到IC50值的差的化合物——艾地苯醌。
兼作筛选的再现性实验，筛选时，以更小的用量对艾地苯醌的细胞死亡诱导作用进行了研究。作为其结果，以比看到A549细胞(肺泡上皮细胞)细胞生存率下降的浓度更低浓度的艾地苯醌，使LL29细胞(肺成纤维细胞)的细胞生存率降低(图1A)。接着，通过对从细胞释放的LDH进行定量，评价了细胞死亡，在LL29细胞中，因艾地苯醌(150μM)而在培养基中释放了LDH，但在A549细胞中几乎看不到LDH释放(图1B)。根据这些结果，显示出与A549细胞相比，艾地苯醌选择性地对于LL29细胞诱导细胞死亡。
根据图1A、图1B，可以认为艾地苯醌具有以75～125μM抑制LL29细胞的细胞增殖的可能性。因此，本发明人使用锥虫蓝染色测定了活细胞数和死细胞数。作为其结果，艾地苯醌从75μM开始抑制LL29细胞的增殖，从175μM开始诱导LL29细胞的细胞死亡(图1C)。另一方面，在上皮细胞中，艾地苯醌从175μM开始抑制细胞增殖，在所研究的浓度中，没有看到细胞死亡诱导(图1D)。
另外，使用作为现有的IPF治疗药的吡非尼酮、尼达尼布进行研究后，这两种药物都没有选择性诱导成纤维细胞的细胞死亡(图2)。
(2)艾地苯醌对博来霉素(BLM)依赖性肺纤维化的效果
若考虑艾地苯醌作为IPF治疗药的开发，则在IPF的动物模型中显示效果也是重要的。作为IPF的动物模型，常用博来霉素(BLM)肺损伤模型，有报道称BLM肺损伤模型再现了IPF病征的典型特征，迄今为止，还有报道称通过经呼吸道给药BLM，肺泡上皮细胞被损伤、肺成纤维细胞增殖并蓄积，以及呼吸功能下降。因此，使用BLM肺损伤模型，针对艾地苯醌对肺纤维化的预防效果和治疗效果进行了研究。
向小鼠经呼吸道给药BLM，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色，确认了BLM依赖的肺的损伤(肥厚、肺泡壁或间质的浮肿)和胶原蛋白的蓄积，但通过艾地苯醌的经呼吸道给药，显著抑制了这些损伤和胶原蛋白的蓄积(图3A)。另外，以组织图像为基础，将定量纤维化的阿希克罗夫特评分以及作为肺的胶原蛋白中含量较多的氨基酸的羟脯氨酸量作为指标，评价了艾地苯醌对BLM依赖性肺纤维化的效果。阿希克罗夫特评分和羟脯氨酸量对BLM依赖性地增加了，但通过给药艾地苯醌，显著抑制了它们的增加(图3B、图3C)。
若考虑艾地苯醌的临床应用，则不仅是组织学指标，而且在呼吸功能等指标中显示效果也是重要的。迄今为止，有报道称在IPF患者中，肺因纤维化而变硬，因此肺弹性阻力上升，用力肺活量(FVC)下降。因此，本发明人使用小鼠用呼吸机，测定了这些指标。通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissue elastance(肺泡的弹性阻力)的上升，但通过经呼吸道给药艾地苯醌，抑制了它们的上升(图3D)。另外，FVC虽然对BLM依赖性地下降了，但通过经呼吸道给药艾地苯醌，看到了该下降被抑制的倾向(图3D)。根据以上的结果，显示了通过经呼吸道给药艾地苯醌，抑制了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。另外，即使单独经呼吸道给药艾地苯醌(18.8mg/kg)，对肺纤维化和呼吸功能也不会产生影响(图3A－D)。
(3)艾地苯醌对BLM依赖性肺纤维化的治疗效果
接着，本发明人通过向预先给药BLM而诱发了纤维化的小鼠给药艾地苯醌，对治疗效果进行了研究。迄今为止，已报道了在给药BLM并经过10天左右时，形成肺纤维化。因此，本发明人从给药BLM的10天后开始艾地苯醌的经呼吸道给药，在从给药BLM开始算起20天后评价了肺纤维化和呼吸功能。通过经呼吸道给药艾地苯醌，显著抑制了从给药BLM开始算起20天后的肺损伤或纤维化(图4A－C)。另外，通过经呼吸道给药艾地苯醌，也显著抑制了BLM依赖性的呼吸功能下降(图4D)。根据以上的结果，显示了即使对于预先给药BLM而诱发了纤维化的小鼠，艾地苯醌也改善了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。
(4)艾地苯醌与CoQ10的比较
为了理解决定艾地苯醌效果的机理，本发明人比较了艾地苯醌和CoQ10对博来霉素肺纤维化的效果。如图5A－C所示，通过经呼吸道给药艾地苯醌或CoQ10，抑制了博来霉素所导致的肺损伤、纤维化。
接着，本发明人比较了艾地苯醌和CoQ10对BLM肺纤维化的治疗效果。如图6A－C所示，艾地苯醌抑制了博来霉素所导致的肺损伤和纤维化，但CoQ10没有抑制。
如上所述，肌成纤维细胞对IPF患者的肺纤维化和博来霉素诱发性肺纤维化发挥了重要的作用。因此，着眼于肌成纤维细胞，研究了艾地苯醌和COQ10的效果。如图7A、B所示，由于博来霉素的给药，肺的α－SMA阳性细胞(肌成纤维细胞)的数量增加了，但艾地苯醌显著抑制了该增加。另一方面，在CoQ10中没有看到该抑制效果。因此，使用艾地苯醌和CoQ10，比较了对TGF－β1依赖性肺成纤维细胞的活化(向肌成纤维细胞的分化)的影响。在对LL29细胞进行艾地苯醌或CoQ10处理后，进行TGF－β1处理，测定培养基中的胶原蛋白量。如图8A所示，TGF－β1的处置使胶原蛋白量上升了，但该上升被艾地苯醌抑制。另一方面，CoQ10没有抑制。接着，将α－SMA和胶原蛋白的mRNA量作为指标，考查了艾地苯醌的效果。如图8B所示，如果用TGF－β1对LL29细胞进行处理，则诱导了α－SMA和Col1a1 mRNA的表达，但如果进行艾地苯醌处理，则该诱导被抑制。另一方面，CoQ10没有抑制。这些结果显示了艾地苯醌作用于成纤维细胞，抑制了肺成纤维细胞的活化。
b－2.结果
(1)托哌酮对细胞死亡的效果
与上述(b－1)同样，用已批准药物对来自IPF患者的肺成纤维细胞(LL29细胞)和人肺泡上皮细胞(A549细胞)分别进行处理，利用MTT法评价24小时后的细胞生存率。作为其结果，从LL29细胞的IC50(使细胞生存率下降50％所需的浓度)值低于A549细胞的化合物中，选出了在两细胞间能够特别显著地看到IC50的值的差的化合物—托哌酮。
兼作筛选的再现性实验，筛选时，以更小的用量对托哌酮的细胞死亡诱导作用进行了研究。作为其结果，以比看到A549细胞(肺泡上皮细胞)细胞生存率下降的浓度更低浓度的托哌酮使LL29细胞(肺成纤维细胞)的细胞生存率降低(图9A)。接着，使用作为现有的IPF治疗药的吡非尼酮、尼达尼布，对成纤维细胞选择性的细胞死亡进行了研究，这两种药物都几乎没有诱导成纤维细胞选择性的细胞死亡(图9B)。
(2)经呼吸道给药托哌酮对BLM依赖性肺纤维化的效果
使用BLM肺损伤模型，针对托哌酮对肺纤维化的治疗效果进行了研究。
向小鼠经呼吸道给药BLM，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色，确认了BLM依赖的肺的损伤(肥厚、肺泡壁或间质的浮肿)和胶原蛋白的蓄积，但通过经呼吸道给药托哌酮，尽管少但抑制了这些损伤和胶原蛋白的蓄积(图10A、B)。另外，将作为肺的胶原蛋白中含量较多的氨基酸的羟脯氨酸量作为指标，评价了托哌酮对BLM依赖性肺纤维化的效果。羟脯氨酸量对BLM依赖性地增加了，即使经呼吸道给药托哌酮，也几乎没有抑制该增加(图10C)。接着，使用小鼠用呼吸机，测定了呼吸功能。通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissue elastance(肺泡的弹性阻力)的上升，但通过给药托哌酮，看到了这些上升被抑制的倾向(图10D)。另外，FVC虽然对BLM依赖性地下降了，但通过给药托哌酮，抑制了该下降(图10D)。根据以上的结果，显示了通过经呼吸道给药托哌酮，抑制了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。
(3)经口给药托哌酮对BLM依赖性肺纤维化的效果
向小鼠经呼吸道给药BLM，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色，确认了BLM依赖的肺的损伤(肥厚、肺泡壁或间质的浮肿)和胶原蛋白的蓄积，但通过经口给药托哌酮，抑制了这些损伤和胶原蛋白的蓄积(图11A、B)。羟脯氨酸量对BLM依赖性地增加，但如果经口给药托哌酮，则该增加被显著抑制(图11C)。接着，使用小鼠用呼吸机，测定了呼吸功能。通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory systemelastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissueelastance(肺泡的弹性阻力)的上升，但通过给药托哌酮，抑制了这些上升(图11D)。另外，FVC虽然对BLM依赖性地下降了，但通过给药托哌酮，抑制了该下降(图11D)。根据以上的结果，显示了通过经口给药托哌酮，抑制了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。
(4)腹腔内给药托哌酮对BLM依赖性肺纤维化的效果
向小鼠经呼吸道给药BLM，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色，确认了BLM依赖的肺的损伤(肥厚、肺泡壁或间质的浮肿)和胶原蛋白的蓄积，但通过腹腔内给药托哌酮，抑制了这些损伤和胶原蛋白的蓄积(图12A、B)。羟脯氨酸量对BLM依赖性地增加了，但如果腹腔内给药托哌酮，则该增加被显著抑制(图12C)。
接着，使用小鼠用呼吸机，测定了呼吸功能。通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissue elastance(肺泡的弹性阻力)的上升，但通过给药托哌酮，抑制了这些上升(图12D)。另外，FVC虽然对BLM依赖性地下降了，但通过给药托哌酮，抑制了该下降(图12D)。根据以上的结果，显示了通过腹腔内给药托哌酮，抑制了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。
(5)托哌酮同种同效药的效果(对成纤维细胞的选择性)
为了阐明托哌酮选择性地作用于成纤维细胞的机理，在图13中分析了使用同种同效药，是否能够看到成纤维细胞选择性的细胞死亡。作为其结果，以比看到A549细胞(肺泡上皮细胞)细胞生存率下降的浓度更低浓度的乙哌立松使LL29细胞(肺成纤维细胞)的细胞生存率降低，但在替扎尼定中，没有看到这样的效果(图13A)。乙哌立松是化学结构与托哌酮非常类似的化合物。因此，使用具有与托哌酮类似的化学结构的化合物，分析了成纤维细胞选择性。作为其结果，在作为托哌酮的化学结构类似体的依那立松、兰吡立松中，看到了与托哌酮相同的成纤维细胞的选择性细胞死亡(图13B)。
(6)腹腔内给药乙哌立松、替扎尼定对BLM依赖性肺纤维化的效果
向小鼠经呼吸道给药BLM，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色，通过腹腔内给药乙哌立松，抑制了BLM依赖性的肺损伤和胶原蛋白蓄积，但在替扎尼定中没有抑制(图14A、B)。通过腹腔内给药乙哌立松，观察到了BLM依赖性的羟脯氨酸量的抑制倾向，但在替扎尼定中没有抑制(图14C)。接着，使用小鼠用呼吸机，测定了呼吸功能。通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissue elastance(肺泡的弹性阻力)的上升、FVC的下降。另一方面，乙哌立松抑制了这些反应，但替扎尼定没有抑制(图14D)。根据以上的结果，显示了在乙哌立松与托哌酮同样抑制了BLM依赖性肺纤维化、呼吸功能的下降。
(7)托哌酮和乙哌立松对成纤维细胞的活化抑制
在图15中，研究了托哌酮、乙哌立松对进行TGF－β1处理时的成纤维细胞的活化(α－SMA和胶原蛋白的mRNA量的增加)的效果。如果用TGF－β1对LL29细胞进行处理，则α－SMA和Col1a1 mRNA的表达增加，但如果进行托哌酮、乙哌立松处理，则该诱导被抑制。这些结果显示了托哌酮、乙哌立松作用于成纤维细胞，抑制了肺成纤维细胞的活化。
(8)托哌酮和现有的IPF治疗药对BLM依赖性肺纤维化的效果
吡非尼酮和尼达尼布在临床现场被用作IPF治疗药。因此，使用BLM肺损伤模型，比较了托哌酮和这些药的有效性。
在第0天(day0)向小鼠给药博来霉素(BLM，1mg/kg)或空白(vehicle)。向小鼠1日1次经口给药吡非尼酮(200mg/kg)、尼达尼布(30mg/kg)、托哌酮(5mg/kg)9天(从第10天起至第18天为止(from day 10to day 18))。20天后制作肺组织切片，通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色。
其结果如图16A和图16B所示，确认了BLM依赖的肺的损伤(肥厚、肺泡壁或间质的浮肿)和胶原蛋白的蓄积，吡非尼酮、尼达尼布几乎没有抑制BLM依赖的肺损伤。另一方面，通过给药托哌酮，看到了BLM肺损伤的显著改善。
接着，使用小鼠用呼吸机，测定了呼吸功能。其结果如图16C所示，通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)(包括支气管、细支气管、肺泡整体在内的全肺的弹性阻力)和tissue elastance(肺泡的弹性阻力)的上升以及FVC的下降，但托哌酮改善了这些变化。另一方面，托哌酮以外的两种药物没有改善这些变化。根据以上的结果，能够期待托哌酮高于现有的IPF治疗药的药效。
(9)经口给药乙哌立松对BLM依赖性肺纤维化的效果
在临床现场，乙哌立松被用作口服的肌紧张改善药。因此，除了前述的腹腔内给药以外，也分析了经口给药的效果。
在第0天(day0)向小鼠给药博来霉素(BLM，1mg/kg)或空白(vehicle)。向小鼠1日1次经口内给药乙哌立松(15或50mg/kg)9天(从第10天起至第18天为止(from day 10to day18))。20天后制作肺组织切片，进行组织学分析。通过H&E染色和马森三色染色对胶原蛋白进行了染色。其结果如图17A和17B所示，通过经口给药乙哌立松，浓度依赖性地抑制了BLM依赖的肺损伤和胶原蛋白蓄积。另外，如图17C所示，通过给药BLM，看到了总呼吸系统弹性阻力(total respiratory system elastance)和肺泡的弹性阻力(tissue elastance)的上升以及FVC的下降，但通过经口给药乙哌立松，浓度依赖性地改善了这些变化。根据以上的结果，乙哌立松在作为临床中的给药方法的经口给药中也显示有效性。
Claims (7)
1.式(I)所示的化合物、该化合物的作为医药能够允许的盐在制造肺纤维化治疗用医药组合物中的用途，
式(I)中，R1表示可以被卤原子取代的C1－4烷基，l表示3～6的整数。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：
在式(I)中，l为4或5，R1为甲基、乙基或三氟甲基。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：
在式(I)中，l为5，R1为甲基或乙基。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：
所述肺纤维化为特发性肺纤维化。
5.如权利要求1～4中任一项所述的用途，其特征在于：
其被制剂化而用于经呼吸道给药。
6.如权利要求1～4中任一项所述的用途，其特征在于：
其被制剂化而用于经口给药。
7.如权利要求1～4中任一项所述的用途，其特征在于：
其被制剂化而用于经静脉给药。
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