CN112662755A

CN112662755A - 一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用

Info

Publication number: CN112662755A
Application number: CN202110108834.4A
Authority: CN
Inventors: 赵晓娟; 张雪茹; 于剑虹
Original assignee: Qingdao Central Hospital
Current assignee: Qingdao Central Hospital
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112662755B

Abstract

本发明提供了一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用，属于生物医药和细胞生物学技术领域。本发明发现在PE患者的胎盘组织中的LINC01962的表达量显著下调。同时，本发明发现在人绒毛膜滋养层细胞中过表达LINC01962能够有效的促进滋养层细胞的迁移和侵袭能力。

Description

一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和细胞生物学技术领域，尤其涉及一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用。

背景技术

子痫前期是妊娠期特发的高血压疾病，是孕产妇发病率和死亡率高的重要原因。患者常常会出现肾功能不全、肝脏损害、神经或血液系统并发症，胎盘功能障碍和胎儿生长受限。因此，实现子痫前期的早诊断，将有助于实现患者的早治疗。

滋养层细胞是构成胎盘的主要实体细胞，其执行着物质交换和胎盘屏障等功能。滋养层细胞的浸润行为与胎盘的发育密切相关。滋养细胞浸润行为受到多种因素的调控，任何因素的调节失控均会引起滋养细胞浸润能力的改变。当滋养细胞浸润不足时，会导致子痫前期的发生。因此，研究调节滋养细胞浸润能力的机制将有助于我们更好的治疗子痫前期疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种子痫前期生物标志物，所述生物标志物为LINC01962，所述LINC01962的RNA核酸序列为NR_108031.1。

此外，本发明提供了检测LINC01962的试剂在制备子痫前期疾病诊断试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂包括特异性检测LINC01962表达量的引物。

优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

此外，本发明提供了一种诊断子痫前期疾病的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的引物。

此外，本发明提供了LINC01962过表达试剂在制备治疗子痫前期药物中的应用。

优选地，所述LINC01962过表达试剂包括LINC01962过表达质粒。

此外，本发明提供了一种用于子痫前期治疗的药物，所述药物包括LINC01962过表达试剂。

除此之外，本发明提供了LINC01962过表达试剂在制备滋养层细胞浸润促进剂中的应用。

优选地，所述LINC01962过表达试剂包括LINC01962过表达质粒。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现LINC01962基因在PE患者胎盘组织中的表达量显著的低于正常产妇胎盘组织中的表达量，且这种差异具有优异的AUC值，因此可以将LINC01962作为子痫前期的诊断标志物。

其次，本发明发现，在人绒毛膜滋养层细胞中过表达LINC01962能够有效的促进滋养层细胞的迁移和侵袭能力，从而有效的促进滋养层细胞的浸润。

附图说明

图1 LINC01962在PE患者和正常产妇胎盘组织中的表达差异；

图2 LINC01962表达差异的ROC曲线；

图3 pET28a-LINC01962质粒的过表达效果；

图4 过表达LINC01962对于滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移能力的影响；

图5过表达LINC01962对于滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移能力影响的统计结果；

图6 过表达LINC01962对于滋养层细胞HTR-8/SVneo侵袭能力的影响；

图7 过表达LINC01962对于滋养层细胞HTR-8/SVneo侵袭能力影响的统计结果。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

收集本院2020年1月-2020年12月间首次接受剖宫产分娩的35例子痫前期患者（PE组）和35例正常产妇（正常组）的胎盘组织。两组均排除多胎妊娠、感染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形以及其他妊娠合并症及并发症。PE患者的诊断标准为：20孕周后第一次出现高血压综合征，至少2次连续测量血压≥140/90mmHg，母体蛋白尿≥300mg/24h或随机尿蛋白（+）。组织收集和实验均经医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意。

实施例1

qRT-PCR检测胎盘组织中LINC01962基因表达

（1）引物设计

根据LINC01962的序列NR_108031.1（SEQ ID NO.1）设计引物序列，引物序列如下：

（2）总RNA提取

1.称取50mg胎盘组织于液氮预冷处理的研钵中，快速研磨为粉末，加入1mlTrizol，使用移液枪快速的吹打混匀；

2.静置10min后，转移至离心管中，将离心管放入到低温高速离心机中，4℃12000rpm转速离心10min；

3.离心后，将上清转移至新的离心管中，加入200μl氯仿，颠倒混匀30s，室温静置5min；

4.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 12000rpm转速离心15min，离心完成后可见溶液分为三层，吸取400μl上层的上清至新的离心管中，加入400μl预冷的异丙醇，混匀后室温静置10min；

5.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 12000rpm离心15min，弃去上清，加入1mlDEPC水配置的75%乙醇重悬沉淀；

6.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃，7500rpm离心15min，去除上清，超净工作台中静置待乙醇完全蒸发，加入40μl DEPC水溶解沉淀，并测定RNA的浓度和纯度。

（3）qRT-PCR检测

1.按照如下反应系统配置反应液：

2.按照如下反应条件进行逆转录反应：

37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 保持；

3.按照如下反应系统配置反应液：

4.按照如下反应条件进行qRT-PCR反应：

95℃ 30s预变性；95℃ 5s，62℃ 30s，重复38个循环；

5. 以β-actin为内参，采用2^-∆∆Ct的方法计算LINC01962的相对表达量。

从图1和图2的实验结果中可以看出，PE组中LINC01962的相对表达量显著低于正常组（PE组为0.418±0.182，P value<0.0001），而且二者之间差异的AUC值为0.9408（Std.Error为0.02516，, P value <0.0001），说明通过检测LINC01962的表达可以辅助诊断孕妇是否患有子痫前期疾病。

实施例2

检测LINC01962过表达质粒的过表达效果

1.按照LINC01962的全长序列和pET28a的XbaI和EcoRI酶切位点设计引物，引物序列如下：

上游引物：TCTAGAGTGCCACGGACGCACG,SEQ ID NO.4

下游引物：GAATTCGCCAGCATACCTTAGT,SEQ ID NO.5

2.将人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo接种于6孔板中，过夜培养后，按照Lip2000说明书指示去转染pET28a质粒和pET28a- LINC01962质粒；

3.转染48h之后，去除培养基，加入1ml Trizol，后续RNA提取步骤参照实施例1；

4.逆转录反应和qRT-PCR反应参照实施例1。

实验结果如图3所示，从图中可以看出过表达LINC01962能够显著的提高LINC01962的相对表达量（pET28a-LINC01962组的LINC01962的相对表达量为4.057±0.942）。

实施例3

检测过表达LINC01962对于HTR-8/SVneo细胞迁移的影响

1.将HTR-8/SVneo细胞接种于6孔培养板中，按照lip2000说明书指示去转染pET28a质粒和pET28a- LINC01962质粒；

2.待细胞密度达到90%时，使用200μl的枪头在培养孔的正中央划一条直线；

3.使用PBS清洗细胞，将脱落的细胞去除，将培养板放入细胞培养箱中继续培养24h，之后置于倒置显微镜下进行拍照。

实验结果如图4和图5所示，从图中可以看出，过表达LINC01962的滋养层细胞中间的间隔更小（相对迁移水平为1.245±0.033），说明过表达LINC01962能够有效的促进滋养层细胞的迁移。

实施例3

检测过表达LINC01962对于HTR-8/SVneo细胞侵袭的影响

1.将Matrigel胶放入4度冰箱中过夜融化，之后使用预冷的无血清培养基按照1:3的比例稀释Matrigel胶；

2.将稀释后的Matrigel胶加入到Transwell小室中，轻轻摇晃使胶平铺于小室中，将小室放入24孔板中，之后将24孔板中放入细胞培养箱中凝固Matrigel胶；

3.将转染pET28a质粒和pET28a-LINC01962质粒的HTR-8/SVneo细胞制成5×10⁴/ml的单细胞悬液；

4.将200μl的单细胞悬液加入到铺有Matrigel胶的Transwell小室中；

5.在24孔板中加入500μl含有10% FBS的DMEM培养基，之后将24孔放入到细胞培养箱中培养24h；

6.培养结束后，取出Transwell小室，使用PBS进行清洗，并使用棉签轻轻擦去小室内膜上的细胞；

7.在24孔板中加入多聚甲醛固定细胞，固定后使用结晶紫细胞染色液染色；

8.去除染色液，使用PBS清洗细胞，之后在倒置显微镜下进行拍照。

实验结果如图6和图7所示，从图中可以看出，过表达LINC01962的细胞穿过Transwell小室的数量显著增多（相对侵袭水平为1.280±0.041），说明过表达LINC01962能够有效的促进滋养细胞的侵袭能力。

序列表

<110> 青岛市中心医院

<120> 一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 467

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

gtgccacgga cgcacgggca agatggctgc ggccgtggga ggagcttggg tccagcagcc 60

acagaactcg gccgagggtt cagcggactg cggctgcgcg gcgccggcga cagcgtcaac 120

tgcttttgtg tcaaaaggaa accaacagcc ggctccatag ctcagggggg gagacgatgg 180

cactaccgcg ccccttcccg ccatgcgttt gtttgcggcg ttccccgacg cgcgcgctga 240

ggctctggtc tgcggctctg cgcttggcgg ctgcgcgccc tcggccttcg ggtccccgcc 300

gcctccgtgc tgcaaggtct gatttcttcc tgtggagtta acacggaaaa gcgcagacgg 360

ccacattcat gacccgggag taacggctct acctgtcaca ttcgctttca gcctaaaaca 420

aaattttagt ttattttaga caaaatatat aactaaggta tgctggc 467

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatgcgttt gtttgcggc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgttactcc cgggtcatga a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctagagtgc cacggacgca cg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcgcca gcatacctta gt 22

Claims

1.一种子痫前期生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为LINC01962，所述LINC01962的RNA核酸序列为NR_108031.1。

2.检测LINC01962的试剂在制备子痫前期疾病诊断试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性检测LINC01962表达量的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

5.一种诊断子痫前期疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的引物。

6. LINC01962过表达试剂在制备治疗子痫前期药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述LINC01962过表达试剂包括LINC01962过表达质粒。

8.一种用于子痫前期治疗的药物，其特征在于，所述药物包括LINC01962过表达试剂。

9. LINC01962过表达试剂在制备滋养层细胞浸润促进剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述LINC01962过表达试剂包括LINC01962过表达质粒。