CN111518903A

CN111518903A - Inpp5b基因在乳腺癌检测中的应用

Info

Publication number: CN111518903A
Application number: CN202010373405.5A
Authority: CN
Inventors: 钟晓力; 刘洪涛; 孙东瑞; 顾晓
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2040-05-06
Also published as: CN111518903B

Abstract

本发明属于基因诊断和治疗技术领域，公开了一种INPP5B基因及其表达产物在乳腺癌诊断和治疗中的应用，用于制备乳腺癌诊断及治疗的产品。本发明中的INPP5B基因及其蛋白表达产物，可作为诊断乳腺癌的特异性标志；本发明的INPP5B基因及其表达产物，还可作为制备治疗乳腺癌的基因治疗工具，从而提供了一种新的乳腺癌治疗途径。

Description

INPP5B基因在乳腺癌检测中的应用

技术领域

本发明属于基因诊断和治疗技术领域，特别是涉及INPP5B基因在乳腺癌检测中的应用。

背景技术

2015年中国恶性肿瘤流行情况分析显示:乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率居女性恶性肿瘤第五位。随着现代医学的发展，乳腺癌的诊治情况取得了极大地改善。但乳腺癌病理诊断，特别是早期浸润性乳腺癌的诊断仍然存在很大的困难，主要通过细胞形态学进行判断，缺乏有效的特异性的分子标记。部分患者在诊断癌症病变时已有转移，预后不良。因此，寻找新型有效的肿瘤标志物具有重要意义。

发明内容

本发明公开了一种用于乳腺癌检测的试剂盒，可以作为第一个有效地区别正常乳腺上皮细胞和癌变的上皮细胞的病理分子标记物。

本发明公开了一种用于乳腺癌检测的试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的检测试剂，所述检测试剂用于检测INPP5B基因或INPP5B蛋白。

进一步的，所述的试剂盒包括：对INPP5B蛋白进行免疫组化定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

进一步的，所述的试剂盒包括：对INPP5B基因mRNA定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

进一步的，所述的试剂盒包括：对INPP5B基因启动子甲基化进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

进一步的，所述的检测试剂包括：INPP5B特异性引物，甲基化探针和 Methylight扩增引物，以及自制的INPP5B特异性抗体。

进一步的，所述的INPP5B蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明公开了一种INPP5B基因及其表达产物在乳腺癌诊断和治疗中的应用，用于制备乳腺癌的诊断及治疗产品。

本发明提供了一种INPP5B基因或INPP5B蛋白的用途，用于制备检测乳腺癌的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括：对INPP5B蛋白，mRNA或INPP5B基因启动子甲基化进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

在另一优选例中，所述的试剂包括INPP5B特异性引物，特异性的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂包括INPP5B启动子甲基化探针和Methylight PCR的扩增引物。

在另一优选例中，所述的INPP5B蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明还提供了一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有几种容器，所述容器中含有检测INPP5B蛋白，INPP5B基因mRNA和/或INPP5B基因启动子甲基化的检测试剂以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测乳腺癌。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的INPP5B相对参照蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的INPP5B 相对参照蛋白的mRNA表达量之比≤0.5，则提示该检测对象患肝癌的几率高于普通人群。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象正常乳腺上皮INPP5B抗体免疫组化染色显示(+++～++++)而可疑镜下区域乳腺上皮染色显示(0～+)，提示镜下区域癌变的可能性显著增高。侵袭性乳腺癌上皮细胞染色显著性降低(0～+)，提示镜下区域癌西部的侵润性可能性显著增高。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的基因组DNA中INPP5B启动子甲基化与周围正常组织的甲基化log比值≥2.0提示检测对象乳腺组织癌变可能性增高。

在另一优选例中，所述参照蛋白包括GAPDH。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：特异性RT-PCR引物、特异性抗体、甲基化探针和Methylight-qPCR引物。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人乳腺组织样品。

在另一优选例中，所述的乳腺组织样品包括乳腺癌组织、癌旁组织。

本发明还提供了一种INPP5B蛋白的用途，用于制备抑制乳腺癌细胞生长或增殖的基因治疗工具，或用于制备治疗乳腺癌的药物。

本发明还提供了INPP5B基因或INPP5B蛋白的检测试剂在制备检测乳腺癌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种体外非治疗性抑制肝癌细胞生长增殖或侵袭的方法，包括步骤：INPP5B过表达腺病毒载体转染乳腺癌细胞，从而抑制乳腺癌细胞生长增殖或侵袭。

本发明还提供了一种可以过表达INPP5B基因的腺病毒载体，转染乳腺癌细胞，从而抑制乳腺癌细胞生长，可以体外非治疗性的抑制乳腺癌细胞生长或增殖。

在另一优选例中，所述的腺病毒载体包括AAV 2型改造抗体，转染乳腺癌细胞MDA231效率强于其他通用病毒载体15倍。

在另一优选例中，所述的转染试剂包括腺病毒颗粒包装。

本发明还提供了一种体外非治疗性的抑制肝癌细胞生长或增殖的方法，包括步骤：体外INPP5B基因腺病毒载体转染乳腺癌细胞，从而抑制乳腺癌细胞生长或增殖。

在另一优选例中，所述的方法包括INPP5B基因腺病毒载体转染乳腺癌细胞。

本发明还提供了一种乳腺癌分子标记，所述分子标记为INPP5B，INPP5B基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示；INPP5B基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

有益效果

我们通过广泛的深入研究，发现基因INPP5B可能是乳腺癌诊断的一个有效分子标记。INPP5B基因位于染色体1p34.3，该基因编码肌醇聚磷酸-5-磷酸酶，编码的蛋白质定位于胞质和线粒体。INPP5B属于5-肌醇蛋白酶家族，能够调节下游信号分子IP3,从而影响PI3K-AKT信号通路。我们首次发现INPP5B在人乳腺癌细胞中具有抑癌基因功能；与正常乳腺上皮细胞相比，INPP5B在乳腺癌细胞中表达量显著降低，因此可以作为乳腺癌病理诊断的重要标志；INPP5B启动子高度甲基化是INPP5B基因表达降低的重要原因；我们同时也发现，体外扩增 INPP5B的表达，可以抑制癌细胞的生长和侵袭，因此INPP5B可以成为乳腺癌治疗的重要基因治疗工具。

本发明公开了一种有效的新型乳腺癌分子标记物INPP5B，可以作为第一个有效地区别正常乳腺上皮细胞和癌变的上皮细胞的病理分子标记物。并且首次公开了INPP5B基因扩增可以有效地抑制乳腺癌细胞生长增殖和侵袭。本发明首次公开了INPP5B基因在乳腺癌诊断及治疗方面的用途，为乳腺癌诊断和治疗提供了新的方法。

本发明公开了一种有效的新型乳腺癌分子标记物INPP5B，可以作为第一个有效地区别正常乳腺上皮细胞和癌变的上皮细胞的病理分子标记物。通过 INPP5B免疫组化实验，mRNA表达测定，以及基因组DNA中INPP5B启动子甲基化三种不同方法可以区别乳腺癌和正常乳腺组织；本发明首次公开了INPP5B 基因扩增可以有效地抑制乳腺癌细胞生长，增殖和侵袭。进而提供了一种可用于乳腺癌治疗的INPP5B基因过表达载体。总之，本发明首次公开了INPP5B基因在乳腺癌诊断及治疗方面的用途，为乳腺癌诊断提供新的标记物，并且为乳腺癌治疗提供了新的方法和工具。

附图说明

图1为INPP5B在乳腺癌中低表达；

图1A为中实时定量PCR检测INPP5B基因在乳腺癌细胞系中表达量低于正常细胞系；

图1B为中实时定量PCR检测INPP5B基因在38例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，其中“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织。结果显示38 例病人的癌组织中INPP5B基因表达量低于相应的癌旁组织；

图1C为Westenblot实验显示INPP5B蛋白表达在乳腺肿瘤细胞系中明显低于乳腺上皮正常细胞系；

图1D和图1E显示了免疫组化手段检测INPP5B基因在人肝癌组织样本和癌旁组织的表达差异，其中，“N”指癌旁组织,“C”指肝癌组织，病人的癌组织中INPP5B基因表达量显著高于相应的癌旁组织；

图2为INPP5B启动子高度甲基化；

图2A显示了在乳腺癌细胞株的INPP5B启动子硫化后甲基化测序结果；

图2B Methylight PCR实验显示INPP5B基因启动子在乳腺癌组织中甲基化升高；

图2C-E显示INPP5B基因启动子5-aza去甲基化增强了乳腺癌细胞株INPP5B 基因的表达；

图3显示了INPP5B基因过表达AAV载体的构建；

图4为INPP5B影响乳腺癌细胞的生长增殖和凋亡；

图4A显示了过表达INPP5B蛋白抑制了乳腺癌细胞MCF-7，MDA231，ZR751 的增长能力；

图4B显示了通过RNA干扰的方法沉默INPP5B表达促进了乳腺癌细胞MCF- 7，MDA231，ZR751的增长能力；

图4C显示了过表达的INPP5B蛋白促进了乳腺癌细胞MCF-7，MDA231， ZR751的凋亡；

图4D和图E显示了INPP5B蛋白改变了乳腺癌细胞MCF-7，MDA231，ZR751 的生长周期；

图5为INPP5B影响乳腺癌细胞的粘附，迁移和侵袭；

图5A-D显示了通过INPP5B表达促进了乳腺癌细胞MCF-7和MDA231的粘附，迁移和侵袭能力；

图5E-F显示了通过INPP5B表达抑制了乳腺癌细胞MCF-7和MDA231在软琼脂中的克隆形成能力，进而说明INPP5B抑制乳腺癌细胞的恶性表征；

图6为INPP5B影响乳腺癌皮下成瘤；

图6A-C显示了过表达的INPP5B基因抑制乳腺癌细胞无论在体积和肿瘤重量上INPP5B过表达组都比对照组小和轻，同时两组具有统计学意义；

图6D-F显示了沉默INPP5B基因抑制乳腺癌细胞MDA231在裸鼠皮下形成肿瘤的能力。无论在体积和肿瘤重量上INPP5B沉默表达组都比对照组大和重，同时两组具有统计学意义。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，INPP5B在乳腺癌组织中低表达，而在癌旁组织及正常乳腺组织中呈高表达，因此INPP5B可作为乳腺癌检测的标志物用于检测或辅助性检测乳腺癌。在此基础上完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1

免疫组化技术检测INPP5B在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况

1.样品收集：收集38例乳腺癌组织及正常乳腺组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2.对每例样本进行HE染色及免疫组化染色

HE染色及免疫组化染色的方法可根据本领域常规技术进行，可采用以下步骤进行：

HE染色

1)脱蜡和水化：二甲苯I:10min→二甲苯II:5min→无水乙醇I:5min→无水乙醇II:5min→95％乙醇:1min→90％乙醇:1min→70％乙醇:1min

2)苏木精染色：5min，自来水充分冲洗

3)伊红染色：3-10s，自来水充分冲洗

4)温水反蓝(显微镜下可清楚看到细胞核即可)

5)脱水、透明：95％乙醇:30s→无水乙醇：30s→二甲苯I：5min→二甲苯II： 5min

6)封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

免疫组化染色

第一天

1)脱蜡和水化：二甲苯I:10min——二甲苯II:5min——无水乙醇I:5min— —无水乙醇II:5min——95％乙醇:1min——90％乙醇:1min——70％乙醇:1min

2)TBS:2x5min

3)抗原修复:切片放入装有0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)的小容器中，后放入蒸锅,30min

4)冷却至室温(20min)后,蒸馏水：5min

5)3％过氧化氢室温孵育(新配)：10min

6)PBS：3x5min，

7)含1％TritonX-100的TBS(不易溶，稍提前配制):15min

8)5％BSA封闭液3滴：37℃，30min，甩干，勿洗

9)按说明书用TBS按1:100比例稀释INPP5B一抗，孵育：4℃过夜(湿盒)

第二天

1)恢复室温，蒸馏水：3min

2)TBS:3x5min

3)二抗孵育：37℃，30min

4)TBS:3x5min

5)滴加SABC:37℃，30min(提前30min准备)

6)TBS:3x5min

7)新鲜配制DAB溶液，显微镜下观察3-10min，自来水充分冲洗

8)苏木素复染2～3min，自来水充分冲洗。

9)0.5％-1％氨水返蓝：30-60s，显微镜下观察

10)脱水、透明：95％乙醇:30s→无水乙醇：30s→二甲苯I：5min→二甲苯 II：5min

11)封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

3.结果

结果显示，INPP5B蛋白阳性反应主要位于细胞质/核，呈棕黄色颗粒状染色(如图1所示)，在乳腺癌组织中低表达，而在正常乳腺组织中呈高表达。

4.乳腺癌组织RNA提取方法参照酚氯仿Invitrogen RNA提取试剂盒

5.乳腺癌组织基因组DNA提取方法参照Promega DNA提取试剂盒。

实施例2

INPP5B RT-PCR定量检测

INPP5B基因Sybergreen RT-PCR定量检测引物序列：

正向引物：5′-CAGAGCCGCCTCCTGGGACT-3′

反向引物：5’-TGGCCATCCTCCGGTGCGTA-3′

ACTB基因Sybergreen RT-PCR定量检测引物序列：

正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′

反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′

INPP5B的相对表达量＝INPP5B表达量/ACTB表达量

实时定量PCR反应使用Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒

(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd.Dalian,China)的反应体系，利用ThermalCycler DiceTMReal Time System(TP800实时荧光定量PCR仪，TaKaRa)进行操作。

结果见附图1A-B。

实施例3

INPP5B启动子甲基化Methylight-qPCR检测：

组织或细胞基因组DNA双硫化实验参照Qiagen双硫化试剂盒。

INPP5B(正向引物-5′GTTTTGGAAGTATGAGGGTGACG-3′,探针 6FAM5′TCTTTCTTAGGCGTGCGTGACGAGGGTAGGCGGGT,

反向引物-5′TTCCCGCCGCTATAAATCG-3′)

ACTB(正向引物-5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′,探针 6FAM5′ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3′TAMRA,反向引物- 5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′).

qPCR反应参照Qiagen试剂盒。

计算Methylation ratio＝INPP5B Methylation PCR值/ACTB Methylation PCR值 ×1000

结果见附图2B。

实施例4

MTT法检测INPP5B基因对乳腺癌细胞增殖的影响

1.细胞培养

人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A，以含10％胎牛血清、1％P/S和1％生长因子的ZQ-1311培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养；人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在 37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在 6孔板中，保证细胞数为5×10⁵个/孔，加入细胞培养基，过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70-90％可进行转染。

2.转染

对于MCF10A：空白对照组(转染NC)、实验组(转染St-h-INPP5B)；对于MDA- MB-231：空白对照组(转染质粒NC)、实验组(转染质粒OE)，NC和OE转染浓度均为(0.5–5μg/μL)。使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。

3.24h或48h将细胞取出，显微镜下观察细胞生长情况，加入胰酶，进行细胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入细胞培养基混匀使细胞悬浮，然后进行细胞计数。

4.将细胞悬液稀释，之后往96孔板中进行接种，每孔加入细胞悬液200μ L左右，细胞控制在1000个左右，实验组和对照组各接种4个复孔。共铺7块 96孔板分别用于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天7个检测时间点。

5.24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入20μL的MTT检测液，将96 孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h，用酶标仪检测各孔在490nm波长处的吸光度值并记录数据。

6.在2天、3天、4天、5天、6天、7天后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。

7.统计学分析

实验都是按照重复4次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

8.结果

结果如图所示，对于MCF10A：与对照相比，实验组在转染St-h-INPP5B后，细胞的增殖明显加快；对于MDA-MB-231：与对照相比，实验组在转染质粒OE 后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明INPP5B具有抑制细胞增殖的作用。

结果见附图。

实施例5

INPP5B过表达AAV载体的构建设计见附图3。表达载体选择PGMAAV-CAG- MCS-T2A-ZsGreen。利用限制性内切酶在Spe1克隆位点插入基因INPP5B全长放读码框。INPP5B基因的mRNA序列如Genebank Ref Sequence:NM_005540.3

实施例6

AAV过表达载体的体外转染方法：AAV2 Rep-Cap plasmid,AAV Helper Plasmid,pGMAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen各5ug。体外肿瘤组织注射病毒滴度1X10¹² vg/ml,10ul/点,总共4个注射点。

实施例7

利用Transwell小室检测INPP5B基因对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

1.Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μL/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μL的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2.细胞培养与转染步骤同前

3.配置细胞悬液

对细胞进行消化处理，终止消化后进行离心，去除上层培养液。用无血清培养基对其进行重悬并计数。

4.细胞接种

取细胞悬液200μL(迁移实验为100μL，侵袭实验为200μL)加入到Transwell 小室中，调整细胞的密度至1-5×l0 ⁵个/小室。在24孔板下室加入500μL含 FBS的ZQ1311或1640培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

5.染色

用4％多聚甲醛固定小室15-20min，PBS冲洗小室。将小室置于结晶紫染液中，染色15min，PBS冲洗小室。用棉拭子轻轻擦去小室内部非转移细胞，空气晾干，放入显微镜下观察并计数。

6.结果

结果如图所示，对于MCF10A：与对照相比，实验组在转染St-h-INPP5B后，细胞的迁移和侵袭能力明显增强；对于MDA-MB-231：与对照相比，实验组在转染质粒OE后，细胞的迁移和侵袭能力明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果说明INPP5B能够抑制乳腺癌的迁移及侵袭。

结果见附图4。

实施例8

应用成瘤实验检测INPP5B基因对乳腺癌细胞增殖的影响

1.细胞培养与转染步骤同前：空白对照组(转染质粒NC的MDA-MB-231细胞系)、实验组(转染质粒OE的MDA-MB-231细胞系)，

2.选4－5周龄NCG免疫缺陷雌性小鼠4只，腹部褪毛，取下腹两个对称乳房，左、右侧乳房分别皮下注射300－500万个实验组细胞(MDA-MB-231OE) 及对照组细胞(MDA-MB-231NC)。

3.一周后开始观察，观察周期为28天，每日测量左右侧包块的最长横径和最长纵径并记录。

4.最后一次测量后，处死小鼠，将两侧包块完整剥离，测量包块重量并拍照。

结果见附图6。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> INPP5B基因在乳腺癌检测中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 4450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtagtcactg tcccggaacc tggggcagcg gagtcccgtg cgccctgtgg tgacagctca 60

ggagggtgtg tgcgctcagc aggggccagc atggaccagt ctgtggcaat ccaggagacg 120

ctggctgagg gggaatactg cgtcatcgcg gtgcaaggtg tgctgtgtga gggggacagc 180

cggcagagcc gcctcctggg actcgtgcgc taccgcctgg agcacggcgg ccaggaacac 240

gctctcttcc tctatacgca ccggaggatg gccattaccg gggacgatgt ctctctggac 300

cagatagtgc cagtctcgcg ggattttacg ctggaagaag tgtccccaga tggtgaactc 360

tacatccttg gctcagatgt gaccgtccag ctggacacag cagagcttag cctcgtattc 420

caactgccct ttggttcaca aaccaggatg ttcctccacg aagttgccag ggcctgtcca 480

ggcttcgatt ctgcgacccg ggatcctgaa ttcctgtggc tgtctcggta taggtgcgca 540

gagctggagc tggagatgcc aacgccgcgc ggttgtaact cggccctagt tacctggcca 600

gggtacgcga caattggcgg aggtggttct aactttgatg gtttgagacc aaatgggaag 660

ggagtgccta tggaccaaag ctccaggggt caagataaac cagaaagctt gcaaccaaga 720

cagaataaat ccaagtccga aattactgac atggttcgct cctccactat cacagtgtcg 780

gacaaggctc atattttatc catgcagaag tttggactgc gagatacaat tgtgaaatca 840

catctactac agaaagaaga ggattacacc tatatccaga acttcaggtt ttttgcggga 900

acatacaatg taaatgggca gtcccccaaa gaatgcctcc ggctgtggct gagcaatggt 960

atccaggccc cagatgtcta ttgtgtaggg ttccaggagc ttgatctgag taaggaagct 1020

tttttctttc acgatacccc aaaggaggaa gagtggttca aagctgtgtc agagggtctt 1080

catccagatg ccaaatatgc aaaggtgaag cttatccgac tggttgggat tatgctgctg 1140

ttatatgtca aacaggagca tgcagcttat atctcagaag tggaagccga gactgtgggg 1200

acaggaatca tggggaggat gggcaacaag ggaggcgtgg cgatcaggtt ccagttccac 1260

aacaccagca tctgcgttgt gaattctcac ttggcagccc acattgaaga gtatgagagg 1320

aggaaccagg actataagga catttgttct cgaatgcagt tttgtcagcc tgacccaagc 1380

cttccccctc tcaccatcag caaccatgat gtgatcttgt ggctggggga cctcaactac 1440

aggatagaag agctggatgt ggaaaaagtg aaaaagctca tcgaagagaa ggactttcaa 1500

atgctgtatg catatgatca gctgaaaatt caggtggccg caaagactgt ctttgaaggc 1560

ttcacagagg gtgagctcac attccagcct acttacaagt atgatacggg ctctgacgac 1620

tgggatacca gtgagaagtg ccgtgctcct gcctggtgtg atcggattct ctggaaaggg 1680

aagaacatca ctcagctgag ttaccagagc cacatggccc tgaagaccag tgaccacaag 1740

cctgtcagct cagtgtttga catcggggtg agggtcgtaa atgacgagct ttaccggaag 1800

acactggagg aaattgttcg ctccctggat aagatggaaa atgccaacat tccttctgtg 1860

tccctgtcca agcgagagtt ctgttttcag aatgtgaagt acatgcaatt gaaagtagaa 1920

tcctttacaa ttcataatgg acaagtaccc tgtcattttg aattcatcaa caagcctgat 1980

gaagagtctt actgtaagca gtggctgaat gccaacccca gcagaggctt cctcctgcca 2040

gattctgatg ttgagattga cttggagctc ttcgtaaata agatgacagc tacaaagctc 2100

aactcgggtg aagacaaaat tgaggacatt ctggttctgc acttggacag gggaaaggat 2160

tactttttgt ctgtgtctgg gaactacctg cccagctgtt ttgggtctcc cattcataca 2220

ctgtgttaca tgagagagcc aatcttggac ctaccacttg aaaccattag tgagctgact 2280

ctgatgccag tatggactgg agatgatggg agccagttgg atagccccat ggaaatcccc 2340

aaagagctct ggatgatggt tgattacctg taccgaaatg ctgtccagca ggaagatctg 2400

tttcagcaac caggcctgag gtcagaattt gaacatatca gggactgctt ggatactgga 2460

atgattgata acctctctgc cagcaatcat tctgtagccg aagccctgct gcttttcctg 2520

gagagccttc cagagcctgt catctgttac agcacctacc ataactgctt ggagtgttct 2580

ggcaactaca cagcaagcaa acaggtcatt tctactctcc ccatattcca caaaaatgtc 2640

ttccactact tgatggcgtt tttgcgagaa ctgctgaaaa attcagcaaa aaatcatttg 2700

gatgagaata ttctagctag catatttggc agcttattgc ttcgaaaccc agctggtcac 2760

caaaagcttg atatgacaga gaagaagaag gctcaagaat ttattcacca gttcctctgc 2820

aacccactct gagcctctct ctcctcctat tttacttgag gctgccaatt accagcccca 2880

cctgtttcag ctcaagagat gccttaagat aattatgtga ggccacttgg tagcaagaat 2940

ggcagctatt tcctgagcct agtaccccaa ttaagcccac cattggttag cacactcagc 3000

gctgtgagtc gtgaagacac gggagaaaat ccaccataat aaaactgaca ttcaattttc 3060

aactttagtt atttaacaca gattttttta ttttttattt ttttttattt tgagacggag 3120

ttttgctctg tcgcgcaggg tggagtgcgg tggcacgatc tcggctcact gcaacctctg 3180

cctcctgggt gcaagcaatt atcctgcctc agcctcccga gtagctggga ctgcaggcac 3240

acactgccac gcccagctaa ttttttgcat tttagtagag acggggtttc accgtgttgc 3300

ccaggctgtt ctaaaactcc tgaactcagg taatctgcct gcctcggcct ccccaagtgc 3360

taggattaca gatgtgagcc accacgcccg gccttttttt tttttttttc ttttttgaga 3420

tggagtttca ctcttgttgc ccaggctgga gtgcgttggc gtggtcttgg ctcactgcaa 3480

cctctgcctc cttggttcaa gcaattctcc tgcctcagcc tctcgagtag ctgggattat 3540

aggcgtccgc caccatgcct ggctaatttt tttgtgtgtt tttagtatag acacggtttc 3600

accatgttgg ccaggctggt ctcgaatgcc tggcctcagg tgatccacct gccttggcct 3660

cccaaagtgc tgggattaca ggcatgaacc accacgcctg gcctaaaatg tttttaaata 3720

actgtacttg tactcactca ccctacctcc agggcatagt cagtctgggc tgagatcccc 3780

atgatcagat atttgatgga aagtcctgaa aggccaatga gttggatggc aagaatgcag 3840

gcagaagctg ctggataaaa taggctacag ccacctcaga tgctttcagt gctctgtctg 3900

aggatgtgta tatgcatatg caaactcgac ccccgttcct gcccagataa tggctcaata 3960

actctgaggc tggttgctca gcctctgagg gcaatacagg catttaaaaa attaaaatga 4020

ccaggcacag tggctcacgc ctgtaatctc ggcactttgg gagactgagg tgggagcatc 4080

acttgagacc aggagtttgg gaccaggctg ggcaacacag ggagaccccc tctctacaaa 4140

aacattttta aaaaattagc tgggtgtggt gatgcatgcc tgtggtccca gttacttggg 4200

aggctgacgt gggtggctca cttgagcaca ggagtttgag gctgcagtga cctatgacca 4260

catcactgta cgccagcccg ggtgagagag ggagaccccg tctctaaaaa taaaatgtaa 4320

aatcactgaa aaaatgagtg ttcggtgaaa caagtgggat tttctgggcc agcaagtctt 4380

ccaaactgta tatgatgcat cctgtctcca tgtgtaatat attttaatga taaatgtatt 4440

tttaacagtg 4450

<210> 3

<211> 913

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Gln Ser Val Ala Ile Gln Glu Thr Leu Ala Glu Gly Glu Tyr

1 5 10 15

Cys Val Ile Ala Val Gln Gly Val Leu Cys Glu Gly Asp Ser Arg Gln

20 25 30

Ser Arg Leu Leu Gly Leu Val Arg Tyr Arg Leu Glu His Gly Gly Gln

35 40 45

Glu His Ala Leu Phe Leu Tyr Thr His Arg Arg Met Ala Ile Thr Gly

50 55 60

Asp Asp Val Ser Leu Asp Gln Ile Val Pro Val Ser Arg Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Glu Glu Val Ser Pro Asp Gly Glu Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp

85 90 95

Val Thr Val Gln Leu Asp Thr Ala Glu Leu Ser Leu Val Phe Gln Leu

100 105 110

Pro Phe Gly Ser Gln Thr Arg Met Phe Leu His Glu Val Ala Arg Ala

115 120 125

Cys Pro Gly Phe Asp Ser Ala Thr Arg Asp Pro Glu Phe Leu Trp Leu

130 135 140

Ser Arg Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Glu Leu Glu Met Pro Thr Pro Arg

145 150 155 160

Gly Cys Asn Ser Ala Leu Val Thr Trp Pro Gly Tyr Ala Thr Ile Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Asn Phe Asp Gly Leu Arg Pro Asn Gly Lys Gly Val

180 185 190

Pro Met Asp Gln Ser Ser Arg Gly Gln Asp Lys Pro Glu Ser Leu Gln

195 200 205

Pro Arg Gln Asn Lys Ser Lys Ser Glu Ile Thr Asp Met Val Arg Ser

210 215 220

Ser Thr Ile Thr Val Ser Asp Lys Ala His Ile Leu Ser Met Gln Lys

225 230 235 240

Phe Gly Leu Arg Asp Thr Ile Val Lys Ser His Leu Leu Gln Lys Glu

245 250 255

Glu Asp Tyr Thr Tyr Ile Gln Asn Phe Arg Phe Phe Ala Gly Thr Tyr

260 265 270

Asn Val Asn Gly Gln Ser Pro Lys Glu Cys Leu Arg Leu Trp Leu Ser

275 280 285

Asn Gly Ile Gln Ala Pro Asp Val Tyr Cys Val Gly Phe Gln Glu Leu

290 295 300

Asp Leu Ser Lys Glu Ala Phe Phe Phe His Asp Thr Pro Lys Glu Glu

305 310 315 320

Glu Trp Phe Lys Ala Val Ser Glu Gly Leu His Pro Asp Ala Lys Tyr

325 330 335

Ala Lys Val Lys Leu Ile Arg Leu Val Gly Ile Met Leu Leu Leu Tyr

340 345 350

Val Lys Gln Glu His Ala Ala Tyr Ile Ser Glu Val Glu Ala Glu Thr

355 360 365

Val Gly Thr Gly Ile Met Gly Arg Met Gly Asn Lys Gly Gly Val Ala

370 375 380

Ile Arg Phe Gln Phe His Asn Thr Ser Ile Cys Val Val Asn Ser His

385 390 395 400

Leu Ala Ala His Ile Glu Glu Tyr Glu Arg Arg Asn Gln Asp Tyr Lys

405 410 415

Asp Ile Cys Ser Arg Met Gln Phe Cys Gln Pro Asp Pro Ser Leu Pro

420 425 430

Pro Leu Thr Ile Ser Asn His Asp Val Ile Leu Trp Leu Gly Asp Leu

435 440 445

Asn Tyr Arg Ile Glu Glu Leu Asp Val Glu Lys Val Lys Lys Leu Ile

450 455 460

Glu Glu Lys Asp Phe Gln Met Leu Tyr Ala Tyr Asp Gln Leu Lys Ile

465 470 475 480

Gln Val Ala Ala Lys Thr Val Phe Glu Gly Phe Thr Glu Gly Glu Leu

485 490 495

Thr Phe Gln Pro Thr Tyr Lys Tyr Asp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Asp

500 505 510

Thr Ser Glu Lys Cys Arg Ala Pro Ala Trp Cys Asp Arg Ile Leu Trp

515 520 525

Lys Gly Lys Asn Ile Thr Gln Leu Ser Tyr Gln Ser His Met Ala Leu

530 535 540

Lys Thr Ser Asp His Lys Pro Val Ser Ser Val Phe Asp Ile Gly Val

545 550 555 560

Arg Val Val Asn Asp Glu Leu Tyr Arg Lys Thr Leu Glu Glu Ile Val

565 570 575

Arg Ser Leu Asp Lys Met Glu Asn Ala Asn Ile Pro Ser Val Ser Leu

580 585 590

Ser Lys Arg Glu Phe Cys Phe Gln Asn Val Lys Tyr Met Gln Leu Lys

595 600 605

Val Glu Ser Phe Thr Ile His Asn Gly Gln Val Pro Cys His Phe Glu

610 615 620

Phe Ile Asn Lys Pro Asp Glu Glu Ser Tyr Cys Lys Gln Trp Leu Asn

625 630 635 640

Ala Asn Pro Ser Arg Gly Phe Leu Leu Pro Asp Ser Asp Val Glu Ile

645 650 655

Asp Leu Glu Leu Phe Val Asn Lys Met Thr Ala Thr Lys Leu Asn Ser

660 665 670

Gly Glu Asp Lys Ile Glu Asp Ile Leu Val Leu His Leu Asp Arg Gly

675 680 685

Lys Asp Tyr Phe Leu Ser Val Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Ser Cys Phe

690 695 700

Gly Ser Pro Ile His Thr Leu Cys Tyr Met Arg Glu Pro Ile Leu Asp

705 710 715 720

Leu Pro Leu Glu Thr Ile Ser Glu Leu Thr Leu Met Pro Val Trp Thr

725 730 735

Gly Asp Asp Gly Ser Gln Leu Asp Ser Pro Met Glu Ile Pro Lys Glu

740 745 750

Leu Trp Met Met Val Asp Tyr Leu Tyr Arg Asn Ala Val Gln Gln Glu

755 760 765

Asp Leu Phe Gln Gln Pro Gly Leu Arg Ser Glu Phe Glu His Ile Arg

770 775 780

Asp Cys Leu Asp Thr Gly Met Ile Asp Asn Leu Ser Ala Ser Asn His

785 790 795 800

Ser Val Ala Glu Ala Leu Leu Leu Phe Leu Glu Ser Leu Pro Glu Pro

805 810 815

Val Ile Cys Tyr Ser Thr Tyr His Asn Cys Leu Glu Cys Ser Gly Asn

820 825 830

Tyr Thr Ala Ser Lys Gln Val Ile Ser Thr Leu Pro Ile Phe His Lys

835 840 845

Asn Val Phe His Tyr Leu Met Ala Phe Leu Arg Glu Leu Leu Lys Asn

850 855 860

Ser Ala Lys Asn His Leu Asp Glu Asn Ile Leu Ala Ser Ile Phe Gly

865 870 875 880

Ser Leu Leu Leu Arg Asn Pro Ala Gly His Gln Lys Leu Asp Met Thr

885 890 895

Glu Lys Lys Lys Ala Gln Glu Phe Ile His Gln Phe Leu Cys Asn Pro

900 905 910

Leu

Claims

1.一种用于乳腺癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的检测试剂，所述检测试剂用于检测INPP5B基因或INPP5B蛋白。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：对INPP5B蛋白进行免疫组化定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：对INPP5B基因mRNA定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：对INPP5B基因启动子甲基化进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括：INPP5B特异性引物，甲基化探针和Methylight qPCR扩增引物，以及自制的INPP5B特异性抗体。

6.如权利要求2所述的试剂盒，当检测对象正常乳腺上皮INPP5B抗体免疫组化染色显示(+++～++++)而可疑镜下区域乳腺上皮染色显示(0～+)，提示镜下区域癌变的可能性显著增高；侵袭性乳腺癌上皮细胞染色显著性降低(0～+)，提示镜下区域癌西部的侵润性可能性显著增高。

7.如权利要求3所述的试剂盒，当检测对象的INPP5B相对mRNA表达量与癌旁组织的INPP5B的mRNA表达量之比≤0.5，则提示该检测对象患乳腺癌的几率高于普通人群。

8.如权利要求4所述的试剂盒，当检测对象的基因组DNA中INPP5B启动子甲基化与周围正常组织的甲基化log比值≥2.0提示检测对象乳腺组织癌变可能性增高。

9.INPP5B基因或INPP5B蛋白的检测试剂在制备检测乳腺癌的试剂或试剂盒中的应用。

10.一种体外非治疗性抑制肝癌细胞生长增殖或侵袭的方法，其特征在于，包括步骤：INPP5B过表达腺病毒载体转染乳腺癌细胞，从而抑制乳腺癌细胞生长增殖或侵袭。