CN112661623B

CN112661623B - 紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的高效液相色谱拆分方法

Info

Publication number: CN112661623B
Application number: CN202110004346.9A
Authority: CN
Inventors: 丁莉坤; 崔家华; 杨燕; 钱嘉珺
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2041-01-04
Also published as: CN112661623A

Abstract

本发明公开了一种紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的高效液相色谱拆分方法：采用高效液相色谱法，以直链淀粉‑三[(S)‑α‑甲基苄基氨基甲酸酯]为填料，以正己烷‑异丙醇混合溶剂为流动相，从紫草素外消旋体中拆分出高纯度的R‑(+)‑紫草素，以及从紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物中拆分出高纯度的S‑(+)‑紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物，并结合一定的分离纯化手段，从而提高了R‑(+)‑紫草素的生产效率以及提高了利用中间体拆分法生产光学纯紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的效率。

Description

紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的高效液相色谱拆分方法

技术领域

本发明涉及一种手性药物的拆分方法，特别涉及高效液相色谱法拆分紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物。

背景技术

紫草(Lithospermum erythrorhizon)属于紫草科(Boraginaceae)多年生药用草本植物，山野自生，因其花、根、皮均显紫色，故名“紫草”。紫草始载于《神农本草经》，被列为中品，其“味苦，性寒”。紫草在《本草纲目》中也有记载，“花紫，根紫，可以染紫故名”。紫草是药典一部所收载的临床常用中药，有凉血、活血、解毒和透疹的功能，主治血热毒盛、麻疹不透、疮疡、湿疹、火热烫伤等(2020年版.中国医药科技出版社，2020，355)。硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc)主要有效成分为紫草素(Shikonin)及其衍生物，其侧链羟基手性碳的构型为R型。软紫草(Arnebia euchroma Johnst)，其主要有效成分为阿卡宁(Alkannin)及其衍生物(Zhou,W.et al.,Comparative study onenantiomeric excess of main alkannin/shikonin derivatives isolated from theroots of three endemic Boraginaceae plants in China.BiomedicalChromatography,2011,25(10),1067-1075)，阿卡宁是紫草素的对映异构体，其手性碳的绝对构型为S型。

近年来的研究表明，紫草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗甲状腺功能亢进、抗免疫力低下、降血糖、保肝护肝等多种生物学活性(夏玲红等，紫草素及其衍生物的药理作用研究进展。药学进展，2011，30(3):339-341)。临床上烧、烫伤用治疗药紫草油剂及软膏剂的主要成分即为紫草素。近期的研究表明，紫草素靶向新型冠状病毒在宿主细胞中进行复制、装配所必须的3CL蛋白酶，可能对新型冠状病毒有效(Jin,Z.et al.Structure of M^pro fromSARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors.Nature,2020,582,289–293)，其抗人免疫缺陷病毒HIV的作用，也是近年来的研究热点之一。因此，以紫草素为先导化合物开发抗炎、抗肿瘤、抗病毒新药依然是药学领域研究的热点课题。此外，紫草素作为一种良好的天然色素，已广泛用于食品、化妆品和印染工业。

目前，硬紫草已经实现大面积的人工栽培，紫草的组织培养已进入工业化生产。采用提取分离的手段，从紫草药材中获得紫草素是目前制备该化合物的主要手段。然而，由于紫草产地、采收季节等存在差异，有效活性成分提取分离过程中有消旋化的问题，因此天然来源的紫草素光学纯度较低。采用有效的拆分方法，制备高光学纯度的紫草素，对开展其药用研究以及结构修饰研究具有重要意义。

在以紫草素为先导物的药物开发研究中，发现了在体外具有良好抗细胞增殖活性的阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物S-(+)-DMAKO-20。S-(+)-DMAKO-20在体外对某些肿瘤细胞显示了较紫草素更强的抗肿瘤活性及良好的选择性(Cui,J.et al.DMAKO-20as a new multi-target anticancer prodrug activated by the tumor specificCYP1B1 enzyme.Molecular Pharmaceutics,2019,16(1),409-421)。在体内的动物移植瘤抑制试验中，S-(+)-DMAKO-20表现出与阳性对照药物5-氟尿嘧啶(5-FU)相同的抑瘤作用，但完全没有5-FU同样的毒副作用，具有良好的开发前景。S-(+)-DMAKO-20分子结构中具有一个手性碳，存在对映异构体R-(-)-DMSKO-20。根据化学药物临床前研究指导原则对手性药物研发的相关要求，目前S-(+)-DMAKO-20的开发研究关注于其单一异构体，需要制备高光学纯度的异构体。S-(+)-DMAKO-20的合成目前所采用的方法是通过中间体拆分或不对称氢化的手段，制备(S)-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1,4,5,8-四甲氧基萘中间体。该中间体在强碱性条件下，其侧链羟基与碘代异戊烷反应使侧链羟基烷基化；侧链烷基化产物经硝酸铈铵氧化及羰基肟化制备目标化合物S-(+)-DMAKO-20。在S-(+)-DMAKO-20的合成反应及产物的重结晶纯化过程中，存在中间体(S)-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1,4,5,8-四甲氧基萘或目标化合物光学纯度发生变化的问题，因此，中间体的光学纯度值不能完全反映目标化合物S-(+)-DMAKO-20的光学纯度。此外，已报道的中间体拆分方法需要采用硅胶柱层析手段，实现非对映异构体的分离，反应路线较长、总收率低。而不对称氢化路线，又存在光学纯度较低的问题。

经过检索，还发现其他类别化合物的外消旋体的HPLC拆分方法，例如，中国专利CN103913526A公开了一种Boc羟基金刚烷氨基酸的高效液相色谱拆分方法：采用高效液相色谱仪，以直链淀粉型手性柱(填料为直链淀粉-三[3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯])为色谱柱，以正己烷与乙醇或正己烷与异丙醇组成的混合液为流动相，控制流动相流速为0.60～1.20mL/min，所述流动相按体积百分比计算，正己烷:乙醇(异丙醇)为70～90％:10～30％；并在色谱柱温度为25～40℃、进样量为5～20μL、检测波长为210～260nm的条件下进行色谱分离，有效的实现了Boc-羟基金刚烷氨基酸消旋体中R、S构型的Boc羟基金刚烷氨基酸的分离和测定，其分离度可达3.25-4.57。但是，紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物外消旋体与Boc羟基金刚烷氨基酸的化学结构差异明显，无法使用专利CN103913526A已报道的手性柱及条件实现色谱拆分。

另外，一些对于外消旋体进行HPLC拆分的方法，流动相中往往添加有酸性、碱性试剂，例如，二乙胺、三氟乙酸，由于这些试剂沸点较高，难以从所收集的洗脱液中除去，影响目标化合物的纯度。目前尚未见到能够对紫草素外消旋体、紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物进行高效拆分并分离纯化的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的高效液相色谱拆分方法，从而实现高光学纯度紫草素及高光学纯度紫草素(阿卡宁)萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的高效制备。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种紫草素外消旋体的拆分方法，包括以下步骤：

a1)将紫草素外消旋体溶于样品溶剂中，得到外消旋体样品溶液A；

a2)将所述样品溶液A中的对映异构体利用手性色谱柱进行分离，分别得到R-(+)-紫草素和S-(-)-阿卡宁的溶液；

a3)将R-(+)-紫草素或S-(-)-阿卡宁的溶液进行浓缩、重结晶，得到高光学纯度的R-(+)-紫草素或S-(-)-阿卡宁。

优选的，所述步骤a1)中，样品溶剂为含2–4个碳原子的脂肪醇，所述样品溶液A中紫草素外消旋体的浓度为0.1–5.0mg/mL。

优选的，所述步骤a2)中，对映异构体的分离采用高效液相色谱，色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系(混合溶剂)，洗脱方式为等度洗脱，洗脱流速为0.8–18mL/min，检测器波长为400–600nm。

优选的，所述流动相中正己烷:异丙醇的体积比为8:1–10:1，所述填料的粒度为2–10μm。

优选的，所述步骤a3)中，将含有R-(+)-紫草素或S-(-)-阿卡宁的洗脱液在减压条件下浓缩，然后采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1–1:2.5)重结晶。

一种紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的拆分方法，包括以下步骤：

b1)将紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物溶于样品溶剂中，得到外消旋体样品溶液B；

b2)将所述样品溶液B中的对映异构体利用手性色谱柱进行分离，分别得到R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物和S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的溶液；

b3)将R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物或S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的溶液进行浓缩、重结晶，得到高光学纯度的R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物或S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物。

优选的，所述步骤b1)中，样品溶剂为含2-4个碳原子的脂肪醇，所述样品溶液B中紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的浓度为0.1–2.5mg/mL。

优选的，所述步骤b2)中，对映异构体的分离采用高效液相色谱，色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系(混合溶剂)，洗脱方式为等度洗脱，洗脱流速为0.8–10mL/min，检测器波长为200–400nm。

优选的，所述步骤b3)中，将含有R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物或S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的洗脱液在减压条件下浓缩，然后采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1–1:2.5)重结晶。

优选的，所述R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物选自R-(-)-DMSKO-20等光学纯紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟的醚衍生物，S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物选自S-(+)-DMAKO-20等光学纯阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟的醚衍生物。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用液相色谱并结合一定的分离纯化手段，分别从紫草素外消旋体及其萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物中拆分出具有高光学纯度的紫草素、阿卡宁及紫草素(阿卡宁)萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物，工艺简单，产品质量稳定，从而提高了诸如光学纯R-(+)-紫草素等对映异构体的生产效率以及提高了利用中间体拆分法生产诸如S-(+)-DMAKO-20等光学纯紫草素(阿卡宁)萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的效率。

进一步的，本发明的高效液相色谱分离系统中，流动相可回收利用，对环境无污染，可实现清洁生产。

进一步的，本发明重结晶收率达90％以上。

附图说明

图1为紫草素(化合物Ⅰ)、阿卡宁(化合物Ⅱ)及S-(+)-DMAKO-20(化合物Ⅲ)的化学结构。

图2为已报道的S-(+)-DMAKO-20的制备方法，其中：(a)拆分路线，(b)不对称合成路线；化合物Ⅳ为(S)-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1,4,5,8-四甲氧基萘。

图3为紫草素外消旋体的色谱拆分结果。

图4为紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的色谱拆分结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例用于解释本发明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。

实施例1

1)高光学纯度紫草素的色谱拆分：

将适量紫草素外消旋体(紫草素外消旋体采用文献Terada A,Tanoue Y,HatadaA,et al.Synthesis of shikalkin(±shikonin)and related compounds[J].Bulletinof the Chemical Society of Japan,1987,60(1):205-213所报道的方法制备)用2mL色谱乙醇溶解，溶液浓度为2.5mg/mL，采用半制备型高效液相色谱仪进行分离纯化，手性色谱柱尺寸为Φ20mm×250mm，直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]填料为上海大赛璐药物手性技术有限公司产品，粒径为5μm，紫草素外消旋体上样量50.0μg，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.8mL/min，洗脱时间12min。采用的紫外光度检测器的检测波长为516nm，收集R-(+)-紫草素(由测定的旋光度确定色谱峰前一段是R-(+)-紫草素，后一段是S-(-)-阿卡宁)，参见图3。

2)浓缩、重结晶得到高光学纯度的R-(+)-紫草素

将所收集的含R-(+)-紫草素的洗脱液在0.1atm的气压下，水浴37℃浓缩至干，残留物用石油醚-乙酸乙酯(体积比例为1:1)1.0mL加热溶解，溶液冷却至室温后放置于4℃冰箱中24小时。R-(+)-紫草素从石油醚-乙酸乙酯溶液中析出，抽滤收集，减压干燥后得目标化合物。使用高效液相色谱法进行R-(+)-紫草素的含量测定，色谱柱为sino-chiral OD柱，流动相为正己烷-异丙醇体系(15:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为516nm。经HPLC分析纯度≥99.5％；光学纯度：99.8％e.e.；[α]²⁵ _D＝+237.0(c 0.004g/mL,EtOH)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ＝12.60(s,1H,ArOH),12.58(s,1H,ArOH),7.19(s,2H,ArH),7.17(s,1H,Hquin),5.21(t,1H,J＝8.1Hz,CH₂CHC),4.91(d,1H,J＝7.2Hz,ArCHOH),2.32-2.37(m,1H,CH),2.64-2.65(m,1H,CH),1.66(s,3H,CH₃),1.75(s,3H,CH₃)。

实施例2

1)高光学纯度紫草素的色谱拆分：

将适量紫草素外消旋体用2mL色谱乙醇溶解，溶液浓度为2.5mg/mL，采用半制备型高效液相色谱仪进行分离纯化，手性色谱柱尺寸为Φ20mm×250mm，直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]填料为上海大赛璐药物手性技术有限公司产品，粒径为5μm，紫草素外消旋体上样量5.0mg，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为18mL/min，洗脱时间20min。采用的紫外光度检测器的检测波长为516nm，收集R-(+)-紫草素。

2)浓缩、重结晶得到高光学纯度的R-(+)-紫草素

将所收集的含R-(+)-紫草素的洗脱液在0.1atm的气压下，水浴37℃浓缩至干，残留物用石油醚-乙酸乙酯(体积比例为1:1)5mL加热溶解，溶液冷却至室温后放置于4℃冰箱中24小时。R-(+)-紫草素从石油醚-乙酸乙酯溶液中析出，抽滤收集，减压干燥后得目标化合物。使用高效液相色谱法进行R-(+)-紫草素的含量测定，色谱柱为sino-chiral OD柱，流动相为正己烷-异丙醇体系(15:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为516nm。经HPLC分析纯度≥99.5％；光学纯度：99.8％e.e.；[α]²⁵ _D＝+237.0(c 0.004g/mL,EtOH)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ＝12.60(s,1H,ArOH),12.58(s,1H,ArOH),7.19(s,2H,ArH),7.17(s,1H,Hquin),5.21(t,1H,J＝8.1Hz,CH₂CHC),4.91(d,1H,J＝7.2Hz,ArCHOH),2.32-2.37(m,1H,CH),2.64-2.65(m,1H,CH),1.66(s,3H,CH₃),1.75(s,3H,CH₃)。

实施例3

1)高光学纯度阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的色谱拆分：

将适量紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物外消旋体(R-(-)-DMSKO-20及S-(+)-DMAKO-20的混合物)用色谱乙醇溶解，配成600μg/mL的溶液，采用分析型高效液相色谱仪进行分离纯化，手性色谱柱尺寸为Φ4.6mm×250mm，直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]填料为上海大赛璐药物手性技术有限公司产品，粒径为5μm，外消旋体上样量60.0μg，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.8mL/min，洗脱时间15min。采用的紫外光度检测器的检测波长为318nm，收集S-(+)-DMAKO-20，参见图4。

2)浓缩、重结晶得到高光学纯度的S-(+)-DMAKO-20

将所收集的含S-(+)-DMAKO-20的洗脱液在0.1atm的气压下，水浴37℃浓缩至干，残留物用石油醚-乙酸乙酯(体积比例为1:2)1.5mL加热溶解，溶液冷却至室温后放置于4℃冰箱中24小时。S-(+)-DMAKO-20从石油醚-乙酸乙酯溶液中析出，抽滤收集，减压干燥后得目标化合物。使用高效液相色谱法进行S-(+)-DMAKO-20的含量测定，色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为318nm。经HPLC分析纯度≥99.8％；光学纯度：99.9％e.e.；[α]²⁵ _D＝+45.18(c 0.001g/mL,EtOH)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.72(s,2H),7.22(s,1H),5.26(s,1H),4.77(s,1H),4.04(s,3H),3.71(s,3H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.45(s,2H),1.81–1.72(m,1H),1.70(s,3H),1.56(s,3H),1.50(q,J＝6.9Hz,2H),0.91(d,J＝6.5Hz,3H),0.88(d,J＝6.5Hz,3H).

实施例4

将适量紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物外消旋体(R-(-)-DMSKO-20及S-(+)-DMAKO-20的混合物)用色谱乙醇溶解，配成2mg/mL的溶液，采用分析型高效液相色谱仪进行分离纯化，手性色谱柱尺寸为Φ4.6mm×250mm，直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]填料为上海大赛璐药物手性技术有限公司产品，粒径为5μm，消旋体上样量500μg，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为10mL/min，洗脱时间35min。采用的紫外光度检测器的检测波长为318nm，收集S-(+)-DMAKO-20。

2)浓缩、重结晶得到高光学纯度的S-(+)-DMAKO-20。

将所收集的含S-(+)-DMAKO-20的洗脱液在0.1atm的气压下，水浴37℃浓缩至干，残留物用石油醚-乙酸乙酯(体积比例为1:2)6.0mL加热溶解，溶液冷却至室温后放置于4℃冰箱中24小时。S-(+)-DMAKO-20从石油醚-乙酸乙酯溶液中析出，抽滤收集，减压干燥后得目标化合物。使用高效液相色谱法进行S-(+)-DMAKO-20的含量测定，色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系(9:1，V/V)，等度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为318nm。经HPLC分析纯度≥99.6％；光学纯度：99.5％e.e.；[α]²⁵ _D＝+45.10(c 0.001g/mL,EtOH)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.72(s,2H),7.22(s,1H),5.26(s,1H),4.77(s,1H),4.04(s,3H),3.71(s,3H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.45(s,2H),1.81–1.71(m,1H),1.70(s,3H),1.56(s,3H),1.50(q,J＝6.9Hz,2H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H).

Claims

1.一种紫草素外消旋体的拆分方法，其特征在于：包括以下步骤：

a1)将紫草素外消旋体溶于样品溶剂中，得到外消旋体样品溶液A；样品溶剂为含2–4个碳原子的脂肪醇；

a2)将所述样品溶液A中的对映异构体利用手性色谱柱进行分离，分别得到R-(+)-紫草素和S-(-)-阿卡宁的溶液，其中，手性色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系，洗脱方式为等度洗脱，洗脱流速为0.8–18mL/min，所述流动相中正己烷:异丙醇的体积比为8:1–10:1。

2.根据权利要求1所述的拆分方法，其特征在于：所述步骤a1)中，所述样品溶液A中紫草素外消旋体的浓度为0.1–5.0mg/mL。

3.根据权利要求1所述的拆分方法，其特征在于：所述步骤a2)中，对映异构体的分离采用高效液相色谱，检测器波长为400–600nm。

4.根据权利要求3所述的拆分方法，其特征在于：所述填料的粒度为2–10μm。

5.根据权利要求1所述的拆分方法，其特征在于：将通过步骤a2)分离得到的R-(+)-紫草素或S-(-)-阿卡宁的溶液进行减压浓缩、重结晶，得到R-(+)-紫草素或S-(-)-阿卡宁，其中，重结晶采用体积比为2:1–1:2.5的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂。

6.一种紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的拆分方法，其特征在于：包括以下步骤：

b1)将紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物溶于样品溶剂中，得到外消旋体样品溶液B；样品溶剂为含2-4个碳原子的脂肪醇；

b2)将所述样品溶液B中的对映异构体利用手性色谱柱进行分离，分别得到R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物和S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的溶液，其中，手性色谱柱填料为直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]，流动相为正己烷-异丙醇体系，洗脱方式为等度洗脱，洗脱流速为0.8–10mL/min，所述流动相中正己烷:异丙醇的体积比为8:1–10:1。

7.根据权利要求6所述的拆分方法，其特征在于：所述步骤b1)中，所述样品溶液B中紫草素外消旋体萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的浓度为0.1–2.5mg/mL。

8.根据权利要求6所述的拆分方法，其特征在于：所述步骤b2)中，对映异构体的分离采用高效液相色谱，检测器波长为200–400nm。

9.根据权利要求8所述的拆分方法，其特征在于：所述填料的粒度为2–10μm。

10.根据权利要求6所述的拆分方法，其特征在于：将通过步骤b2)分离得到的R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物或S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物的溶液进行减压浓缩、重结晶，得到R-(-)-紫草素萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物或S-(+)-阿卡宁萘茜母核羟基甲基化羰基肟衍生物，其中，重结晶采用体积比为2:1–1:2.5的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂。