CN112655837A - 一种预防禽流感的动物饲料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饲料领域，具体涉及一种预防禽流感的动物饲料，按照重量份数计算，包括下列份数的原料：玉米粉60份，黄豆粉20份，维生素5份，预防禽流感藻类干粉15份。所述预防禽流感藻类干粉是能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞，经过光生物反应器大量培养生产的藻粉。本发明的动物饲料具有制作方法简单、成本低且能预防动物感染禽流感病毒的特性。
Description
技术领域
本发明属于预防治疗禽流感的饲料领域，涉及一种预防禽流感的动物饲料。
背景技术
禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒感染引起的一种禽类传染病，同时也可以传染给人类。世界动物卫生组织将该病列为A类动物疫病，中国将其列为一类传染病。根据世界卫生组织发表的资料显示，目前全球没有报道禽流感疫情的仅剩下非洲和大洋洲等少数大陆。由于致病禽流感病毒的多型性和多传染途径，并且患者大多是身强力壮的年轻人，因此它像悬在人类头上的一把剑，禽流感随时都会夺走那些没有准备的生命。然而只要我们人类能保护得当并积极致力于开发能有效预防禽流感的藻类饲料，我们完全有能力应对任何突发的禽流感爆发危机。从控制禽流感病源入手，开发具有禽流感免疫原性的新型禽用饲料具有至关重要的意义。禽流感病毒的传播和对人的侵染是可以预防和有效防治的。当前国内外有一些关于成功生产禽流感疫苗的报道和申请的国际国内专利，但是真正市场化的能够有效预防禽流感的饲料没有商品化的成品。综上所述，制作一种能有效预防禽流感的动物饲料具有非常高价值，并可以根据市场需求和不同时间段可能爆发的禽流感病毒紧急开发大批量藻类饲料，对维护社会稳定和社会健康具有促进作用，同时可以带来显著的经济效益。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种预防禽流感的动物饲料。在家禽的不同生长阶段能够有效的预防禽流感对家禽的侵害，而且能够提高家禽免疫能力，降低患病几率。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种能够预防禽流感的动物饲料，包括下列质量份的组份：玉米粉50-60份，黄豆粉10-20份，维生素5-10份，预防禽流感藻类干粉5-15份。
进一步的，所述预防禽流感藻类干粉由能够表达禽流感病毒抗原的藻类，在培养到平台期后，开始采收，并喷雾干燥获得。
进一步的，所述喷雾干燥的具体操作为：通过离心6000rpm/min收集，高温瞬时干燥进风温度180℃，出风温度80℃，即可获得能预防禽流感藻类干粉。
进一步的，所述维生素，使用复合维生素，其比例按重量份为：维生素D:维生素C:维生素E＝2：1：1。
进一步的，包括下列质量份的组份：玉米粉60份，黄豆粉20份，维生素5份，预防禽流感藻类干粉15份。
进一步的，所述的禽流感藻类干粉为通过分子生物学手段将禽流感病毒抗原表位基因转导入藻类细胞中，通过光生物反应器，一级、二级扩培培养能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
进一步的，获得所述的禽流感藻类干粉的具体操作步骤如下：一、载体构建：禽流感抗原基因采用分子生物手段与pUC57 vector连接；其步骤如下：首先将pUC57 vector分别用NheⅠ、PmacⅠ；PstⅠ、XhoⅠ；NcoⅠ、PstⅠ分别在37℃的温度下消化2h,其次同样用上述酶消化禽流感抗原基因；最后采用T4连接酶在26℃条件下过夜连接，采用热激法把过夜连接液转导入感受态细胞Top10中；热激过后将细胞涂抹于含有相应抗生素的LB平板上，筛选出单克隆；得到含禽流感抗原基因的pUC57质粒；二、采用“珠磨法”进行遗传转化:(1)将莱茵衣藻CC849藻类细胞接种于新鲜TAP培养基中，在连续光照的条件下培养至对数期，5000rmp室温离心6min，弃上清，收集藻细胞；(2)用新鲜无菌的TAP培养液重悬沉淀，调整藻细胞浓度至2×108个细胞/mL；吸取300μl悬浮液到1.5mL的EP管中；(3)加入1μg目的DNA到EP管中，让玻璃珠、藻株和外源DNA混合快速振荡25s；(4)将混合液转移到50mL以灭菌的培养管中，加入10mL无菌新鲜TAP培养液，在100rpm/min摇床弱光下22℃培养20h，使细胞恢复；(5)3000rpm室温离心5min，去上清收集藻液，用0.8mL TAP轻轻重悬，加入3.5mL，40℃，0.5％TAP培养基，均匀涂布在含10μg/ml的Zeomycin抗生素的TAP平板上；静至平板30min后倒置平板在22℃光照培养箱中培养3-4周，待平板生长出约1mm大小的绿色单克隆藻团即为能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
进一步的，所述藻类为莱茵衣藻。
进一步的，为能够使上述基因在莱茵衣藻中的表达产物方便纯化，特在其N末端加入了His tag亲和标记，采用亲和层析的方法对表达产物进行纯化。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明一种预防禽流感的动物饲料，采用光生物反应器对能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞进行扩培，通过离心6000rpm/min收集，高温瞬时干燥进风温度180℃，出风温度80℃，即可获得能预防禽流感藻类干粉。所述预防禽流感藻类干粉是能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞，经过光生物反应器大量培养生产的藻粉。本发明的动物饲料具有制作方法简单、成本低且能预防动物感染禽流感病毒的特性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
一种能预防禽流感的动物饲料，包括下述质量组份计算：玉米粉50-60份，黄豆粉10-20份，维生素5-10份，预防禽流感藻类干粉5-15份。
进一步的，所述维生素为维生素D、维生素C、维生素E的混合，其比例按重量组份计具体为：维生素D:维生素C:维生素E＝2：1：1；
进一步的，所述的禽流感藻类干粉为通过分子生物学手段将禽流感病毒抗原表位基因转导入藻类细胞中，通过光生物反应器，一级(增加了构建方法)、二级扩培大量培养能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
进一步的，所述具体操作步骤如下：一、载体构建：禽流感抗原基因采用分子生物手段与pUC57 vector(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接。其步骤如下：首先将pUC57vector分别用NheⅠ、PmacⅠ；PstⅠ、XhoⅠ；NcoⅠ、PstⅠ分别在37℃的温度下消化2h,其次同样用上述酶消化禽流感抗原基因；最后采用T4连接酶(购自Fermentas)在26℃条件下过夜连接，采用热激法把过夜连接液转导入感受态细胞Top10中。热激过后将细胞涂抹于含有相应抗生素的LB平板上，筛选出单克隆。得到含禽流感抗原基因的pUC57质粒。为能够使上述基因在莱茵衣藻中的表达产物方便纯化，特在其N末端加入了His tag亲和标记，可以采用亲和层析的方法对表达产物进行纯化。二、采用“珠磨法”进行遗传转化:(1)将莱茵衣藻CC849藻类细胞接种于新鲜TAP培养基中，在连续光照的条件下培养至对数期(细胞数为1-2×106个细胞/mL)，5000rmp室温离心6min，弃上清，收集藻细胞；(2)用新鲜无菌的TAP培养液重悬沉淀，调整藻细胞浓度至2×108个细胞/mL。吸取300μl悬浮液到1.5mL的EP管中(含灭菌的0.3mm玻璃珠)；(3)加入1μg目的DNA到EP管中，让玻璃珠、藻株和外源DNA混合快速振荡25s；(4)将混合液转移到50mL以灭菌的培养管中，加入10mL无菌新鲜TAP培养液，在100rpm/min摇床弱光下22℃培养20h，使细胞恢复；(5)3000rpm室温离心5min，去上清收集藻液，用0.8mL TAP轻轻重悬，加入3.5mL，40℃，0.5％TAP培养基，均匀涂布在TAP平板上(含10μg/ml的Zeomycin抗生素)。静至平板30min后倒置平板在22℃光照培养箱中培养3-4周，待平板生长出约1mm大小的绿色单克隆藻团即为能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
本发明采用光生物反应器对能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞进行扩培，通过离心6000rpm/min收集，高温瞬时干燥进风温度180℃，出风温度80℃，即可获得能预防禽流感藻类干粉。
实施例1：一种能预防禽流感的藻类动物饲料，包括下述质量组份：一种能预防禽流感的动物饲料，包括下述质量组份计算：玉米粉60份，黄豆粉20份，维生素5份，预防禽流感藻类干粉15份。所述的维生素分别为维生素分别为维生素D、维生素C、维生素E，其比例按重量组份数计算，分别是维生素D:维生素C:维生素E＝2：1：1；所述预防禽流感藻类干粉的制备方法为：1、采用分子生物学手段将具有禽流感抗原表位基因转导入藻类细胞中(步骤：(1)将藻类细胞接种于新鲜TAP培养基中，在连续光照的条件下培养至对数期(细胞数为1-2×106个细胞/mL)，5000rmp室温离心6min，弃上清，收集藻细胞；(2)用新鲜无菌的TAP培养液重悬沉淀，调整藻细胞浓度至2×108个细胞/mL。吸取300μl悬浮液到1.5mL的EP管中(含灭菌的0.3mm玻璃珠)；(3)加入1μg目的DNA到EP管中，让玻璃珠、藻株和外源DNA混合快速振荡25s；(4)将混合液转移到50mL以灭菌的培养管中，加入10mL无菌新鲜TAP培养液，在100rpm/min摇床弱光下22℃培养20h，使细胞恢复；(5)3000rpm室温离心5min，去上清收集藻液，用0.8mL TAP轻轻重悬，加入3.5mL，40℃，0.5％TAP培养基，均匀涂布在TAP平板上(含10μg/ml的Zeomycin抗生素)。静至平板30min后倒置平板在22℃光照培养箱中培养3-4周，待平板生长出约1mm大小的绿色单克隆藻团即为能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。2、采用光生物反应器对能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞进行一级、二级扩培，最终保证藻类生长浓度为106/mL，通过离心机，转速为6000rpm/min收集藻细胞。3、通过高温瞬时干燥机，保证进风温度在180℃左右，出风温度80℃左右，收集得到能预防禽流感藻类干粉，包装、储存。
制备所述的预防禽流感的藻类饲料方法，包括下述步骤：将藻类饲料按比例混合后，转移至磨粉机，进行粉粹；过40目筛，放入饲料颗粒机中制粒，粒径为1-5mm，即得到所述的预防禽流感的藻类饲料。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种预防禽流感的动物饲料，其特征在于，包括下列质量份的组份：玉米粉50-60份，黄豆粉10-20份，维生素5-10份，预防禽流感藻类干粉5-15份。
2.根据权利要求1所述动物饲料，其特征在于，所述预防禽流感藻类干粉由能够表达禽流感病毒抗原的藻类，在培养到平台期后，开始采收，并喷雾干燥获得。
3.根据权利要求2所述动物饲料，其特征在于，所述喷雾干燥的具体操作为：通过离心6000rpm/min收集，高温瞬时干燥进风温度180℃，出风温度80℃，即可获得能预防禽流感藻类干粉。
4.根据权利要求1所述动物饲料，其特征在于，所述维生素，使用复合维生素，其比例按重量份为：维生素D:维生素C:维生素E＝2：1：1。
5.根据权利要求2所述动物饲料，其特征在于，包括下列质量份的组份：玉米粉60份，黄豆粉20份，维生素5份，预防禽流感藻类干粉15份。
6.根据权利要求2所述动物饲料，其特征在于，所述的禽流感藻类干粉为通过分子生物学手段将禽流感病毒抗原表位基因转导入藻类细胞中，通过光生物反应器，一级、二级扩培培养能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
7.根据权利要求6所述动物饲料，其特征在于，获得所述的禽流感藻类干粉的具体操作步骤如下：一、载体构建：禽流感抗原基因采用分子生物手段与pUC57 vector连接；其步骤如下：首先将pUC57vector分别用NheⅠ、PmacⅠ；PstⅠ、XhoⅠ；NcoⅠ、PstⅠ分别在37℃的温度下消化2h,其次同样用上述酶消化禽流感抗原基因；最后采用T4连接酶在26℃条件下过夜连接，采用热激法把过夜连接液转导入感受态细胞Top10中；热激过后将细胞涂抹于含有相应抗生素的LB平板上，筛选出单克隆；得到含禽流感抗原基因的pUC57质粒；二、采用“珠磨法”进行遗传转化:(1)将莱茵衣藻CC849藻类细胞接种于新鲜TAP培养基中，在连续光照的条件下培养至对数期，5000rmp室温离心6min，弃上清，收集藻细胞；(2)用新鲜无菌的TAP培养液重悬沉淀，调整藻细胞浓度至2×108个细胞/mL；吸取300μl悬浮液到1.5mL的EP管中；(3)加入1μg目的DNA到EP管中，让玻璃珠、藻株和外源DNA混合快速振荡25s；(4)将混合液转移到50mL以灭菌的培养管中，加入10mL无菌新鲜TAP培养液，在100rpm/min摇床弱光下22℃培养20h，使细胞恢复；(5)3000rpm室温离心5min，去上清收集藻液，用0.8mL TAP轻轻重悬，加入3.5mL，40℃，0.5％TAP培养基，均匀涂布在含10μg/ml的Zeomycin抗生素的TAP平板上；静至平板30min后倒置平板在22℃光照培养箱中培养3-4周，待平板生长出约1mm大小的绿色单克隆藻团即为能够表达禽流感病毒抗原的藻类细胞。
8.根据权利要求6所述动物饲料，其特征在于，所述藻类为莱茵衣藻。
9.根据权利要求8所述动物饲料，其特征在于，为能够使上述基因在莱茵衣藻中的表达产物方便纯化，特在其N末端加入了His tag亲和标记，采用亲和层析的方法对表达产物进行纯化。
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