CN112654353A - 用于治疗眼部疾病的方法和药物成分 - Google Patents

Abstract

当前公开的主题涉及用于治疗CaMKK2介导的眼部疾病的组分和方法，在一主题中，该疾病包括但不限于1）眼表炎症疾病（OSID），包括但不限于眼移植物抗宿主疾病、眼瘢痕性天疱疮、春季角膜结膜炎、过敏性眼病、睑板腺功能障碍、房水缺乏症（常见的干眼病）、角膜瘢痕、结膜瘢痕和纤维化；2）葡萄膜炎和其他眼部炎症疾病，包括但不限于角膜炎、巩膜炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、中间葡萄膜炎、睫状体炎、后葡萄膜炎、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎或非传染性，感染性或特发性病因的胰腺炎；及3）“眼后”视网膜疾病，包括与干性年龄相关的黄斑变性、与新生血管性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜血管疾病（例如视网膜静脉阻塞，视网膜动脉阻塞）以及视网膜变性和营养不良。特别地，所公开的化合物显示出相对于STO‑609的改善，STO‑609是特征明确的CaMKK2的特异性抑制剂。

Description

用于治疗眼部疾病的方法和药物成分

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月20日提交的美国临时申请62/719,938（卡曾思（Cousins）等人210-97-PROV）的权益，其全部内容通过引用合并于此。

关于联邦资助研究或发展的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号EY029185-01的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

当前公开的主题涉及用于治疗由钙/钙调蛋白依赖性激酶激酶2（CaMKK2）活化而介导的眼部疾病的组分和方法，所述钙/钙调蛋白依赖性激酶激酶2是调节多种细胞类型（特别是免疫细胞）中细胞效应子功能的中间激酶。当前公开主题的主要焦点涉及眼睛、眼附件和外部组织（眼睑，眼眶）的炎症疾病。这些疾病包括前段（或“眼前”）炎症疾病以及后段（或“眼后”）疾病，其中免疫细胞中CaMKK2的活化引发、介导或调节疾病活性；并且其中对目标免疫细胞中CaMKK2的抑制可能代表了潜在的治疗或疾病缓解策略。这些疾病包括已显示出CaMKK2或可能发挥作用的三类主要疾病：1）眼表炎症疾病（OSID），包括但不限于眼部移植物抗宿主病、眼部瘢痕性天疱疮、春季角膜结膜炎、过敏性眼病、睑板腺功能障碍、房水缺乏症（普通干眼病）、角膜瘢痕、结膜瘢痕和纤维化；2）葡萄膜炎和其他眼部炎症疾病，包括但不限于角膜炎、巩膜炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、中间葡萄膜炎、睫状体炎、后葡萄膜炎、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎或非传染性，感染性或特发性病因的胰腺炎；及3）“眼后”视网膜疾病，包括但不限于与干性年龄相关的黄斑变性、与新生血管性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜血管疾病（例如视网膜静脉阻塞，视网膜动脉阻塞）以及视网膜变性和营养不良。

背景技术

介绍

本文提供的“背景”描述是为了总体上呈现本公开内容的目的。在此背景技术部分中所描述的范围内，目前命名的发明人的工作以及在申请时可能没有其他资格视为现有技术的该描述方面，均未明确或暗含为反对本公开的现有技术。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）是一种在许多细胞类型中普遍表达的细胞内中间激酶。但是，CaMKK2的活性尤其在某些“活化的”细胞中增加，包括免疫系统的细胞，尤其是活化的T淋巴细胞和渗透性巨噬细胞（1-5）。CaMKK2似乎是“活化”细胞的效应子功能的放大器，而不是稳态的维持者。因此，在实验研究中，对CaMKK2无效的小鼠没有表现出主要的表型，包括没有免疫缺陷的证据。CaMKK2是最重要的钙反应性激酶之一，其活性受细胞质钙和钙调蛋白水平的调节。一旦活化，CaMKK2就会磷酸化几种底物。除了自动磷酸化和活化其他CaMKK2分子外，CaMKK2还直接磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I（CaMKI）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（CaMKIV）和腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）（图1和图2）。这些底物的磷酸化放大了多个下游信号传导级联，调节了多种细胞效应子功能。

T细胞中的CaMKK2活性：通过其底物CaMKI、CamKIV和AMPK的磷酸化，CaMKK2调节T细胞中的许多特异性效应子功能（图1）。在活化的T淋巴细胞中，钙是主要的继发性信使系统，与通过T细胞受体活化或通过共刺激信号和/或IL-2（6）扩增引起的钙调蛋白和CaMKK2活化无关。在活化的T细胞中，AMPK的下游活化调节细胞的生物能、增殖和产生细胞因子（1，5）。CaMKI调节T细胞迁移和粘附（7）。CaMKIV在T细胞细胞因子效应子响应中很重要。CaMKK2还可增强PTK2B（蛋白酪氨酸激酶β）的活化，该活化介导p38MAPK途径，对于产生许多效应细胞因子（3）至关重要。因此，毫不奇怪，敲除CaMKK2可以减少许多炎症疾病中的T细胞介导的炎症，例如实验性移植物抗宿主病（GVHD）（2，8-11）。

巨噬细胞中的CaMKK2活性：通过其底物CaMKI、CamKIV和AMPK的磷酸化，CaMKK2也是巨噬细胞功能的主要调节剂（图2）。例如，AMPK的活化开启了整个基因转录的宿主，这对于非经典巨噬细胞的修复功能很重要，而CaMKK2的特异性抑制可通过阻止AMPK活化来抑制单核细胞向非经典巨噬细胞的转化（12）。如同在T细胞中一样，CaMKK2还放大了PTK2B（蛋白酪氨酸激酶β）的活化，它介导p38MAPK途径，这对于产生许多巨噬细胞衍生的效应细胞因子也至关重要（3）。因此，CaMKK2抑制作用减少了与组织损伤和破坏有关的促炎症细胞因子的产生。在先前暴露于活化刺激（例如LPS）（脂多糖）（4）的巨噬细胞中观察到CaMKK2活性增加。敲除CaMKK2会削弱巨噬细胞粘附和延长膜过程的能力，从而导致巨噬细胞积聚减少，并响应这种活化刺激（4）而减少细胞因子释放。

作为眼部疾病治疗目标的理论依据：OSID和葡萄膜疾病是公认的具有严重眼病和视力丧失的疾病，并且还已知炎症细胞（尤其是巨噬细胞）会导致后段疾病（13-17）的严重性和视觉发病率。所有这些情况都可以包括免疫细胞（尤其是T细胞和巨噬细胞）是疾病的主要介质（即，这些细胞渗入眼组织并触发局部损伤，以作为主要疾病过程）和免疫细胞是继发性病理介导的两种疾病，以响应于原发性眼部疾病过程。在T细胞和巨噬细胞中，CaMKK2都起着放大电路的作用。敲除可减轻炎症，但不引起免疫抑制（4）。因此，当与CaMKK2在T细胞和巨噬细胞功能中确立的作用一起使用时，CaMKK2在眼炎症疾病中代表有吸引力的治疗靶标。重要的是，来自眼炎症疾病的实验小鼠模型的临床前数据表明，针对CaMKK2的靶向抑制可改善疾病严重性，同时减少T细胞和巨噬细胞的渗透（参阅本申请的实施例4和5）。这些和其他眼疾病模型的数据为CaMKK2小分子抑制剂在治疗眼部疾病（尤其是主要由炎症或免疫细胞介导的原发性或继发性眼部疾病）中的发展和潜在功效提供了令人信服的理由和概念证明。

发明内容

当前公开的主题涉及用于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）的新型小分子抑制剂的组分和方法，所述钙激酶/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）是在免疫系统的细胞（包括活化的T细胞和巨噬细胞）内具有增强活性的中间激酶。具有抑制CaMKK2的高特异性和效力的新型小分子已设计出，并且这些分子保留了亲水性和高水溶性。这些CaMKK2（SMIC）小分子抑制剂的生物物理特性使它们可以容易地制成水溶液或悬浮液形式。因此，这些SMIC非常适合通过眼部给药的局部或结膜下途径治疗眼部疾病。

本公开的另一方面提供了本文公开和示出的所有内容。

附图说明

将参考附图阅读先前的发明内容和以下的详细描述，其示出了当前公开主题的一些（但不是全部）实施例。

图1是说明CaMKK2对T细胞效应子响应的调节，以及多种下游途径的CaMKK2扩增如何介导许多促炎效应子机制的示意图。

图2是说明CaMKK2对巨噬细胞效应子响应的调节，以及多种下游途径的CaMKK2扩增如何介导促炎效应和促纤维化效应子机制的示意图。

图3A是说明同种异体造血干细胞移植（HSCT）（即骨髓移植）后眼移植物相对于宿主疾病的病理生物学的示意图。

图3B是苏木精和曙红（H&E）显微照片，其描绘了OGVHD结膜中免疫细胞（T细胞和巨噬细胞）渗透的组织学。

图3C是临床裂隙灯生物显微照片，其图示了严重OGVHD的临床表现。

图4A和图4B是蛋白质印迹（Western blot），其图示了在培养的HEK293细胞中，载体、小分子化合物EYE301-EYE305和工具化合物STO-609通过（A）CaMKK2自磷酸化和（B）AMPK磷酸化对CaMKK2酶活性的抑制。

图4C和图4D是柱状图，其示出了蛋白质印迹的密度测定分析，其图示了在培养的HEK293细胞中，通过载体、小分子化合物EYE301-EYE305和工具化合物STO-609对C）CaMKK2自磷酸化和D）AMPK磷酸化的CaMKK2的抑制活性。

图5是示出了在混合淋巴细胞反应中促炎细胞因子的测量的柱状图，其可用于筛选CaMKK2（SMIC）小分子抑制剂在体外的功能抑制能力（即“皿中的GVHD”）。

图6是基于骨髓移植以及将脾脏T细胞从C57B1/6同时过继转移到BALB/c小鼠中的移植物抗宿主疾病的小鼠模型图示。

图7A是在接受“安全的”骨髓移植（即没有同时的T细胞过继转移）之后的小鼠外眼的裂隙灯生物显微照片。

图7B是小鼠的外眼裂隙灯生物显微照片，其描绘了同种异体骨髓移植后同时进行脾脏T细胞的过继转移后的眼移植物抗宿主疾病（OGVHD）。

图8是与“安全”BMT小鼠的最小OGVHD严重性相比，“GVHD”BMT小鼠的OGVHD眼部病理学评分的散点图（同时脾脏T细胞过继转移）。

图9A和图9B示出了在A）对照“安全”BMT和B）GVHD BMT（同时脾脏T细胞过继转移）之后的眼表荧光素染色。

图9C是对照安全BMT小鼠和GVHD BMT小鼠的眼表荧光素染色评分的图。

图10A-图10D是显示T细胞（A和B）和巨噬细胞（C和D）渗透角膜基质、延髓和结膜结膜的组织病理学图像。

图11A是具有OGVHD的对照治疗小鼠的眼睛裂隙灯生物显微镜照片。

图11B是经STO-609处理的小鼠裂隙灯生物显微照片，其在治疗后具有最小的OGVHD迹象。

图11C是在用载体对照或STO-609进行局部眼部治疗后，来自同种异体BMT+脾脏T细胞转移的眼睛病理学评分的散点图。

图12：候选SMIC在体外显示出与STO-609相似的功效。在用1mM离子霉素（CaMKK2的已知活化剂）刺激之前，先用STO-609，候选SMIC或载体对照处理HEK-293细胞，然后用针对CaMKK2和AMPK的磷酸特异性抗体探测细胞裂解液；肌动蛋白（B-actin）用作负载对照；图显示了光密度测定法的定量以及校正的负载变化。

图13：小鼠在BMT后第14天开始对CaMKK2的工具化合物抑制剂、STO-609、领先的SMIC化合物EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001，泼尼松龙进行局部眼内给药，并持续两周。两种领先的SMIC EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001都降低了临床OGVHD发现的严重程度，其疗效与STO-609相似。相比之下，经载体对照治疗的眼睛具有睑缘肿胀和疤痕，以及睫毛和眼周毛发脱落、眼睑结硬皮、化学反应、泪膜异常和角膜病变。在预防OGVHD的迹象方面，STO-609和领先的SMIC优于载体和泼尼松龙（对于STO-609，EY1006.A001.B001，EY1001.A002.B001与载体或泼尼松龙的p<0.05）。轻度疾病（评分0-5分）；中度疾病（评分6-10分）；重度疾病（评分>10分）。

具体实施方式

定义

虽然以下术语被本领域普通技术人员很好地理解，但是以下定义被提出以促进对当前公开主题的解释。

在整个说明书中，提供了一定数量的数值范围。应该理解，这些范围包括其中的所有子范围。因此，范围“从50到80”包括其中所有可能的范围（例如，51-79、52-78、53-77、54-76、55-75、60-70等）。此外，给定范围内的所有值可以是由此所涵盖范围的端点（例如，范围50-80包括带有端点的范围，例如55-80、50-75等）。

如本文中所使用，在本说明书和权利要求书中使用的动词“包括”及其变形以其非限制性意义使用，以表示包括该词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。

在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包括”或“包括”的变体将被理解为暗示包括陈述的要素、整体或步骤，或要素组、整体组或步骤组，但是，不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素组、整体组或步骤组。本公开可以适当地“包括”，“由……组成”或“基本上由……组成”权利要求中描述的步骤、要素和/或试剂。

还应注意，权利要求书可以被草拟以排除任何可选要素。这样，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述结合使用诸如“唯一”，“仅”等排他性术语的先行基础，或使用“负”限制。

以足够的细节引入当前公开的主题，以提供对更广泛的发明主题的一个或多个特定实施例的理解。这些描述阐述并例示了那些实施例的特征，而没有将本发明的主题限制于明确描述的实施例和特征。在不脱离当前公开主题范围的情况下，考虑这些描述将可能引起另外的和类似的实施例和特征。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与当前公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法、设备和材料的任何方法、设备和材料都可以用于实践或测试当前公开的主题，但是现在描述代表性的方法、设备和材料。

根据长期的专利法惯例，当在包括权利要求书的主题说明书中使用时，术语“一个”，“一种”和“所述”指的是“一个或多个”。因此，例如，提及“一个单元”可以包括多个这样的单元，依此类推。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的所有表示组分，条件等的数量的数字在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据当前公开的主题寻求获得的期望特性而变化。

如本文所用，术语“约”在涉及质量、重量、时间、体积、浓度和/或百分比的值或量时，在一些实施例中相对于指定的量，可涵盖±20％的变化；在一些实施例中为±10％；在一些实施例中为±5％；在一些实施例中为±1％；在一些实施例中为±0.5％；在一些实施例中±0.1％，因为这样的变化在公开的包装和方法中是适当的。

当前公开的主题基于发现钙/钙调蛋白激酶激酶2（CaMKK2）作为活化的T细胞和巨噬细胞的靶标。CaMKK2是一种由CAMKK2基因（18）编码的酶，并于2008年首次提出是控制中枢神经系统食欲的关键介质，因为它存在于控制饱腹感的大脑中部（19）。最近，CaMKK2已被证明是巨噬细胞和T细胞中的重要调节激酶（图1和图2），因此对巨噬细胞介导的和T细胞介导的生物学在包括某些癌症，食欲控制和饱腹感在内的各种疾病中具有重要作用，以及体内多个组织部位的各种免疫介导和炎症疾病（1-5、19-21）中具有重要作用。如本文所用，术语“疾病”包括各种疾病、病症、症状、状况和/或适应症。

CaMKK2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，属于Ca⁺²/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族（18）。此外，CaMKK2受细胞质钙调蛋白水平和炎症刺激的调节。在活跃的T细胞中，钙是主要的继发性信使系统，与通过T细胞受体活化或通过共刺激信号和/或IL-2（6）扩增无关。除了自磷酸化和活化其他CaMKK2分子外，CaMKK2还磷酸化钙/钙调蛋白依赖性激酶I和IV（CaMKI和CaMKIV）以及腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK），从而调节众多T细胞功能（1、2、5、6、8、10），如图1所示。特别地，CaMKI调节T细胞迁移和粘附（6），而CaMKIV在T细胞细胞因子效应子响应（2、6、8、10）中很重要。此外，AMPK还调节T细胞的生物能、增殖和产生细胞因子（1、5、6）。这些激酶和下游信号途径的活化促进T细胞活化和随后的炎症。CaMKK2还扩增了蛋白酪氨酸激酶β（PTK2B）（3，4）的活化，它介导了许多促炎症和纤维化效应系统。重要的是，CaMKK2起到放大电路的作用，从而使敲除减少炎症，但不会诱导免疫抑制（3，4）。

CaMKK2还是巨噬细胞功能的主要调节剂，如图2所示。CaMKK2对AMPK的活化开启了整个基因转录的宿主，这对非经典巨噬细胞的修复功能很重要（3、4、12），并且对CaMKK2的特异性抑制可通过防止AMPK活化（12）来抑制单核细胞向非经典巨噬细胞的转化。CaMKK2还增强了PTK2B（蛋白酪氨酸激酶β）的活化，它介导p38MAPK途径，这对于产生许多巨噬细胞衍生的效应细胞因子也至关重要（3，4）。因此，CaMKK2抑制作用减少了与组织损伤和破坏有关的促炎症细胞因子的产生。在先前暴露于活化刺激（3，4）的巨噬细胞中观察到活性增强。此外，敲除CaMKK2会削弱巨噬细胞粘附和扩展膜过程的能力，从而导致巨噬细胞积聚减少，并响应某些毒素（例如LPS）以减少细胞因子释放（4）。

综上，这些发现为抑制CaMKK2作为T细胞和巨噬细胞介导的疾病的治疗策略提供了有力的依据。重要的是，在两种细胞类型都起作用的任何眼部疾病中，CaMKK2的抑制作用可将T细胞和巨噬细胞作为双重靶向。这些疾病包括：1）眼表炎症疾病（OSIDs），包括但不限于眼球移植物抗宿主病、眼瘢痕性天疱疮、春季角膜结膜炎、过敏性眼病、睑板腺功能障碍、房水缺乏症（普通干眼病）、角膜疤痕和结膜疤痕和纤维化；2）葡萄膜炎和其他眼部炎症疾病，包括但不限于角膜炎、巩膜炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、中间葡萄膜炎、睫状体炎、后葡萄膜炎、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎或非传染性，感染性或特发性病因的胰腺炎；及3）“眼后”视网膜疾病，包括但不限于与干性年龄相关的黄斑变性、与新生血管性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜血管疾病（例如视网膜静脉阻塞，视网膜动脉阻塞），以及视网膜变性和营养不良。

在这些疾病中，由于该疾病的临床和病理学发现，眼移植物抗宿主病（OGVHD）代表了一种模型性眼部炎症疾病（图3），用于迹象新型CaMKK2小分子抑制剂（SMIC）的治疗潜力。可以在定义明确的患者人群中迹象（即那些接受骨髓移植的患者）（13、15、22）；已知T细胞和巨噬细胞均在OGVHD（14，23）中；可以通过眼用药（23）治疗该疾病。OGVHD发生在接受异基因造血干细胞移植（HSCT）（即骨髓移植）（13，15）的患者中的60％以上。在OGVHD中，供体T细胞在眼组织内遇到受体移植抗原，导致T细胞活化和细胞因子产生（图3A）（14、23）。这触发了供体巨噬细胞，额外的“自身免疫”T细胞的募集和渗透，以及嗜中性粒细胞和B细胞（14、23）（图3B）的继发性贡献。这些渗透的炎症细胞充当组织损伤的“效应器”。在临床上，OGVHD表现为水性泪液缺乏、睑板腺功能障碍、角膜病变，在严重的情况下表现为结膜瘢痕、眼睑边缘瘢痕和角膜溃疡（图3C）（13、24、25）。由于OGVHD与更常见的OSID（即常见的干眼症，睑板腺功能障碍等）以及其他眼部炎症疾病（即各种形式的葡萄膜炎）（26-29）具有相同的临床和病理学重叠，因此OGVHD的实验性临床前模型代表非常理想系统，以研究靶向和抑制CaMKK2的药物治疗潜力。

小分子STO-609是CaMKK2（30）的良好表征和特异性抑制剂。尽管STO-609的生物物理特性限制了其作为治疗剂的潜力，但STO-609与CaMKK2的分子相互作用为可抑制CaMKK2活性的特定特征提供了重要见解。平面的刚性STO-609分子适合激酶结构域中的狭窄口袋，与ATP竞争并阻止其结合。STO-609和CaMKK2之间的结合口袋相互作用本质上主要是疏水性的（即，尤其是在CaMMK2肽相互作用残基Ile171、Vall79、Alal92、Val249、Phe267、Gly273、Pro274和Leu319处）。除了疏水相互作用外，两个关键的氢键的键合有助于在活性位点内容纳STO-609的结合，（i）STO-609酰胺氧与Val270之间的键合；（ii）结合的STO-609的羧酸与Asp330之间的键合。此外，水的活性位点分子在STO-609的羧酸和Glu236之间形成氢键桥。这些分子键合共同使得CaMKK2具有STO-609抑制能力。STO-609在HeLa细胞中对于CaMKK2<30nM和IC50<40nM具有K_i，在巨噬细胞和T细胞（31）中的IC50约为100nM。此外，与CaMKI、CaMKII、CaMKIV、MLCK、PKC、PKA、p42、MAPK、VEGFR1和PDGFR（30）相比，STO-609对CaMKK1的活性低6倍，对CaMKK2的选择性>80倍。

然而，尽管有如此突出的活性，STO-609仍受到一些限制，使其只能用作工具化合物。例如，如下所述，普遍用于合成约100mg或更大规模的STO-609的当前合成路径产生一对异构溴化物，其占混合物的多达40-50％。

不想要的异构体

此外，STO-609的溶解度较差（即，在超声处理下DMSO中STO-609的最大浓度为10mM），因此与该化合物进行体内和体外工作会导致沉淀。STO-609还具有不良的口服生物有效性，这限制了其作为治疗剂的开发，并限制了其作为实验室研究的工具化合物的用途。此外，各种脱靶效应已受质疑，包括芳烃受体的活化（32）。有了STO-609的生化结构知识，发明人就能够设计出用于STO-609的局部眼部（即眼周和局部）应用的制剂。另外，通过了解CaMKK2结合口袋中的STO-609取向，发明人能够确定STO-609的哪些区域最适合于结构改变以及将基团添加至可以增强水溶性的分子框架。

本公开的主题还包含式（I）和（II）化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药和/或衍生物。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指通常公认用于动物，例如但不限于人，并且在生物学上或在受试者中不是不想要的。

式（I）的化合物的苯并咪唑脲支架保持类似于STO-609的平坦刚性的芳族结构，如下所示。

因此，所公开的一系列抑制剂仍然可获取CaMKK2的浅而窄的结合口袋。此外，使用AutoDock^®（可从加利福尼亚州拉霍亚的斯克里普斯研究所（Scripps ResearchInstitute, La Jolla, California）获得）与式（I）化合物进行CaMKK2活性位点对接模拟，其已经证实可分别与脲氧和羧酸酯基团保持与Val270、Asp330和Glu236的稳定氢键键合。在结构上，向式（I）的苯并咪唑脲支架化合物过渡的主要改进是芳环的损失。结果，clogD降低了一个数量级（clogD（STO-609）_7.4=-0.75，clogD（I）_7.4=-1.75），从而增强了基本支架的溶解性。然而，对核心结构的修改将允许相当多样的功能性，以产生具有高水溶性的新型类似化合物用于局部给药。虽然与Phe267和Vall79键合，抑制剂的活性位点稳定化作用可能会失去，但可以通过尿素NH氢键结合至骨架残基E269的C=O来实现对损失的补偿。

另外，与STO-609的合成不同，式（I）和（II）的组分（以及本文公开的所有当前和提出的苯并咪唑脲系列化合物）产生单一化合物。结果，不发生非结合异构体的产生，即使对于大规模合成，也提高了预期合成产物的效率和保真度。

当前公开的主题进一步包括式（I）和（II）的可合成获得的结构类似物，例如（但不限于）式（V）到式（III）的亚系列化合物以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中R包含烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，是指可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的直链（即非支链）或支链或其组合，且可以包括具有指定碳原子数（即，C1-C10表示一到十个碳）的二价和多价基团（例如，亚烷基）。饱和烃基的实例包括但不限于：例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、（环己基）甲基、正戊基、正己基、正庚基，正辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基（即烯基）的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-异戊烯基、2-（丁二烯基）、2,4-戊二烯基、3-（1,4-戊二烯基）、乙炔基、1，3-丙炔基、3-丁炔基以及更高的同系物和异构体。烷基可以是被取代或不被取代；例如具有一种或多种卤素，例如三氟甲基。

除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合是指由至少一个碳原子和至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链或其组合。“杂原子”包括氧（O）、氮（N）、硫（S）、磷（P）、硒（Se）和硅（Si），其中N和S可以任选地被氧化，并且任选地，N可以被季铵化。杂原子可以放置在任何化学上可接受的位置，包括内部位置、烷基连接至分子其余部分的位置（近端）或远端（例如，对于杂亚烷基）。示例包括但不限于：-C(O)R'，-C(O)NR'，-NR'R“，-OR'，-SR'和/或-SO₂R'和-CH。多达两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃。

除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。杂环烷基的实例包括但不限于哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。环烷基或杂环烷基可以是被取代的或未被取代的。

术语“芳基”本身或与另一个术语结合使用，除非另有说明，是指多不饱和芳族烃基，其可以是单环或多环（优选1-3个环），它们是融合在一起或共价连接。稠合环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠合环是芳基环。

除非另有说明，术语“杂芳基”本身或与另一术语组合是指包含一个至四个杂原子（如上定义）的芳基（如上定义）。因此，术语“杂芳基”包括稠合的环杂芳基基团，其是稠合在一起的多个环（例如5和/或6-元环），其中至少一个稠合环是杂芳族环。杂芳基可通过碳或杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡嗪基、恶唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异恶唑基、异喹啉基、5-异喹啉基和喹啉基。芳基或杂芳基基团可以被例如卤素取代或未被取代。芳基或杂芳基可以是单取代、二取代或三取代的。

此外，当前公开的主题包括苯并咪唑环（硫）脲亚系列化合物，例如（但不限于）式（VI）和（VII）的化合物，以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中X为氧（O）或硫（S），n为1或2。

当前公开的主题还包括苯并咪唑硫代（脲）酯前药亚系列化合物。如本文所用，术语“酯”是指通过含氧酸（含氧的有机酸）与羟基化合物（如醇）反应衍生的任何化合物。酯通常衍生自有机酸，其中至少一个羟基（-OH）被-O-烷基（烷氧基）取代。最通常地，酯是通过使羧酸与醇缩合而形成的。如本文所用，术语“前药”是指不表现出显着药理活性的化合物，除非其转化为具有药理活性的母体化合物。通常，药学上有用的前药是在给予个体后在体内转化为相应药理活性母体化合物的化合物。但是，在存在外源提供的转化活性，例如（但不限于）转化酶的情况下，合适的前药也可以在体外转化为具有药理活性的母体药物。

例如，合适的苯并咪唑硫代（脲）酯前药化合物可包括式（VIII）的化合物，以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X为O或S，R为酯前药。

当前公开的主题进一步包括苯并咪唑硫代（脲）羧酰胺亚系列化合物。如本文所用，术语“羧酰胺”是指包含以式A所示的构型键合的碳，氮和氧原子的部分。具体地，碳原子与羧酰胺部分键合的自由基中的碳原子键合。此外，氮原子与羰基碳键合，并且还与另外两个原子键合，其中至少一个选自氢原子或与羧酰胺部分键合的另一个基团的碳原子。

例如，合适的苯并咪唑硫（脲）羧酰胺化合物可包括（但不限于）式（IX）至（XI）的化合物，以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中X是O或S；R为烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。R₁和R₂在不同的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基上相同。

在一些实施例中，当前公开的主题包括苯并咪唑脂族和脂环族亚系列化合物。如本文所用，术语“脂的”是指特征在于直链或支链结构或闭环结构的有机化合物，所述直链或支链结构或闭环结构包括饱和碳键和任选地一个或多个非共轭不饱和键，例如碳-碳双键。如本文所用，术语“脂环族”是指包括闭环结构的有机化合物，该闭环结构包含饱和碳键和任选地一个或多个未共轭的碳-碳双键。

例如，合适的苯并咪唑脂族和脂环族亚系列化合物可以包括式（XII）至（XV）的化合物，以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中n为1、2或3；R为烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；R₁和R₂在不同的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基上相同。

（XII） （XIII） （XIV） （XV）

在一些实施例中，当前公开的主题包括芳基和杂芳基苯并咪唑脲化合物，例如式（XVI）的化合物，以及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物。

在一些实施例中，当前公开的主题包括苯并咪唑（硫代）脲亚系列化合物，其包括sp³杂化的碳原子。sp³杂化的碳原子是指与四个取代基形成四个键的碳原子，所述四个取代基以四边形的方式位于该碳原子周围。包括sp³杂化碳原子的合适苯并咪唑（硫）脲亚系列化合物包括但不限于式（XVII）的化合物，以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中X是O或S。

当前公开的主题还包括式（I）和（II）的可合成获得的结构类似物，例如（但不限于）式（XVIII）和（XIX）的亚系列化合物以及药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，其中R₁包含H或COOCH₃，R₂为CH₂CN，CH₂COOC₂H₅或CH₂COPh。

（XVIII） （XIX）

在一些实施例中，该化合物具有以下结构：

使用以下方案合成以上化合物和表1的化合物1-9：

在其他实施例中，该化合物具有以下结构：

具有中性增溶基团的化合物可以按照以下方案合成：

或者，化合物也可以具有在以下生理条件下可电离并带电的基团，其结构如下：

制备具有将被电离基团的化合物的合成方案可以如下制备：

在一些实施例中，当前公开的主题提供了一种药物组分，其包含，由或基本上由本文所述的化合物和药学上可接受的载体组成。合适的载体可以包括（但不限于）水、水溶液、聚合物（例如羟丙基甲基纤维素）、凡士林、矿物油、蓖麻油、羧甲基纤维素、有机液体脂质、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、透明质酸、甘油、聚乙二醇、聚山梨酯80、聚维酮和/或葡聚糖。基于组分的总重量，存在于载体中所公开组分的量可以约0.5-20重量％，例如约0.5-10％、0.5-9％、0.5-8％、0.5-7％、0.5-6％、0.5-5％、0.5-4％、0.5-3％、0.5-2％或0.5-1％。

任选地，公开的组分可以包含一种或多种缓冲剂、张度剂、防腐剂和/或螯合剂。合适的缓冲剂包括（但不限于）乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和/或磷酸盐缓冲剂。可用于将所公开的组分调节至所需等渗范围的合适的张度剂可包括但不限于甘油、甘露醇、山梨糖醇、氯化钠和/或其他电解质。可以用来防止细菌污染的合适的防腐剂包括但不限于聚六亚甲基双胍（PHMB）、苯扎氯铵（BAK）、稳定的氧氯配合物（Purite^®）、乙酸苯汞、氯丁醇、山梨酸、洗必太、苄醇、对羟基苯甲酸酯和/或硫柳汞。可以用于增强防腐效果的合适的螯合剂包括但不限于依地酸盐，例如依地酸盐二钠、依地酸盐钙二钠、依地酸盐三钠和/或依地酸盐二钾。

本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同的原子取代，其通常或主要存在于自然界中。可以掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，例如分别是²H（氘）、³H（氚）、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁹I和¹³¹I。本发明化合物的某些同位素变体，例如其中掺入一种或多种放射性同位素如³H或¹⁴C的那些同位素变体，可用于药物和/或底物组织分布研究。由于其易于制备和可检测性，特别优选碳-14，即¹⁴C的同位素。用正电子发射同位素（例如 ¹⁴C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N等取代）在正电子发射拓扑（PET）研究中可能有用。

此外，由于更高的代谢稳定性（例如增加的体内半衰期或减少的剂量要求），用同位素（如氘取代）可以提供某些治疗优势，因此在某些情况下可能是优选的。本发明化合物的同位素变体通常可以通过本领域技术人员已知的常规方法，例如通过说明性方法或通过以下实施例中所述的制备方法，使用合适试剂的适当同位素变体来制备。在另一个实施例中，同位素标记的化合物包含氘（2H）、氚（3H）或14C同位素。本发明同位素标记的化合物可以通过本领域普通技术人员众所周知的一般方法制备。

这样的同位素标记的化合物可以通过进行本文公开的实施例和方案中公开的方法来方便地制备，方法是用容易获得的同位素标记的试剂代替非标记的试剂。在某些情况下，化合物可以用同位素标记的试剂进行处理，以使正常原子与其同位素交换，例如，氘的氢可以通过氘酸（例如D₂SO₄/D₂O）的作用进行交换。或者，也可使用诸如通过还原（例如使用LiAlD₄或NaBD₃），催化氢化或使用适当的氘代试剂（例如氘代、D₂和D₂O）进行酸性或碱性同位素交换的方法将氘掺入化合物中。除上述内容外，PCT公开号WO2014/169280、WO2015/058067；美国专利8354557号、8,704,001和美国专利申请公开号2010/0331540；2014/0081019；2014/0341994；2015/0299166中的方法通过引用并入本文。

在一些实施例中，公开组分的pH可以为约4至8，例如约4.5-7.5、4.5-6.5或4.5-5.5。

在一些实施例中，当前公开的主题涉及调节细胞中CaMKK2活性的方法。该方法包括，由或基本上由向细胞施用有效量的本文提供的化合物，从而调节CaMKK2活性。如本文所用，术语“施用”是指化合物或组分的剂量，例如所公开化合物的单剂量或多剂量，用于施用的方法包括多种递送途径，特别是局部递送至眼睛。多种疾病适应症的递送途径包括但不限于结膜下递送、Tenon下递送、前房内递送、玻璃体内递送、脉络膜上递送、泪点递送、球后递送、静脉内递送、皮下递送、肌内递送、口服递送、吸入递送和鞘内递送。

本文提供的药物组分可以局部施用于皮肤、孔或粘膜。本文所用的局部给药包括（皮内）结膜、角膜内、眼内、眼部和透皮给药。

本文提供的药物组分可以配制成适合于局部或全身作用的局部给药的任何剂型，包括乳剂、溶液剂、混悬剂、乳膏剂、凝胶剂、水凝胶、软膏剂、撒粉剂、敷料、酏剂、洗剂、悬浮液、酊、糊剂、泡沫、薄膜、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂。本文提供的药物组分的局部制剂还可以包含脂质体、胶束、微球、纳米系统及其混合物。

适用于本文提供的局部制剂的药学上可接受的载体和赋形剂包括但不限于水性载体、与水混溶的载体、非水性载体、抗微生物剂或针对微生物生长的防腐剂、稳定剂、溶解度增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、润湿剂或乳化剂、络合剂、螯合剂或螯合剂、渗透增强剂、防冻剂、冻干保护剂、增稠剂和惰性气体。本文提供的药物组分可以软膏剂、乳膏剂和凝胶剂形式提供。合适的软膏载体包括油质或烃载体，包括猪油、苯甲酸酯化猪油、橄榄油、棉籽油和其他油、白凡士林；乳油或吸收性载剂，例如亲水凡士林、硫酸羟基硬脂精和无水羊毛脂；亲水性软膏等除水载体；水溶性软膏载体，包括不同分子量的聚乙二醇；乳剂载体，油包水（W/O）乳剂或水包油（O/W）乳剂，包括鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸（请参阅《雷明顿：科学与药学实践》（Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy），同上）。这些载体是润肤剂，但通常需要添加抗氧化剂和防腐剂。

合适的乳膏基质可以是水包油或油包水。乳膏载体可以是水洗的，并且包含油相、乳化剂和水相。油相也被称为“内部”相，其通常由凡士林和脂肪醇（例如鲸蜡醇或硬脂醇）组成。尽管不是必须的，但是水相通常在体积上超过油相，并且通常包含湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂可以是非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。

凝胶是半固体的悬浮型体系。单相凝胶包含基本上均匀地分布在整个液体载体中的有机大分子。合适的胶凝剂包括交联的丙烯酸聚合物，例如卡波姆、羧基聚亚烷基、CARBOPOL^®；亲水聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基纤维素；树胶，例如黄芪胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶，可以添加分散剂，例如醇或甘油，或者可以通过研磨，机械混合和/或搅拌来分散胶凝剂。

在一些实施例中，当前公开的主题涉及抑制靶细胞中CaMKK2活性的方法。该方法包括，由或基本上由向细胞施用有效量的本文所述的化合物，从而抑制CaMKK2活性。

在一些实施例中，当前公开的主题涉及用于治疗受试者的眼部适应症的方法。该方法包括，由或基本上由向受试者施用有效量的本文所述的化合物，从而治疗眼适应症。典型的眼部疾病包括但不限于眼前段或眼前部疾病（即角膜和/或结膜疾病，例如房水性泪液缺乏、睑板腺功能障碍或OGVHD）。疾病还可包括葡萄膜炎和其他眼部炎症疾病（即非感染性，传染性或特发性病因的虹膜炎、虹膜睫状体炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎或胰腺炎）。疾病还可包括后段或眼后疾病（即视网膜和/或脉络膜疾病，例如与年龄有关的黄斑变性（AMD），糖尿病性视网膜病或视网膜变性/营养不良）。在一些实施例中，眼适应症包括一种或多种以T细胞和/或巨噬细胞介导的炎症为特征的眼疾病。在一些实施例中，该疾病的特征在于CaMKK2活性增加。

在一些实施例中，组分的“有效量”（或“治疗有效量”）包括足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。

如本文所用，术语“受试者”包括动物，例如哺乳动物。合适的受试者可以包括（但不限于）灵长类动物、牛、绵羊、山羊、狗、猫、马、兔子、大鼠、小鼠等。在一些实施例中，受试者是人。

如本文所用，术语“治疗的”或“治疗”是指阻止或改善疾病、疾病或疾病或疾病的至少一种临床症状；降低罹患疾病、疾病或疾病或疾病的至少一种临床症状的风险；减少疾病、疾病或疾病或疾病的至少一种临床症状的发展；和/或降低罹患某种疾病、疾病或疾病或疾病至少一种临床疾病的症状。“治疗的”或“治疗”还可以指在物理上（例如，稳定可辨认症状），在生理上（例如，稳定物理参数）或在两者上抑制这疾病，或抑制至少一种物理上参数，该参数可能无法识别的。此外，“治疗的”或“治疗”可指延迟可能暴露于或易患疾病或疾病的受试者的疾病或疾病或其至少症状的发作，即使该受试者尚未经历或显示疾病或疾病的症状。

在一些实施例中，当前公开的主题涉及治疗受试者中癌症的方法。该方法包括，由或基本上由对受试者施用有效量的本文所述的化合物以治疗癌症。在一些实施例中，该癌症的特征在于癌细胞内或与之相关或与之相关的渗透或辅助细胞（即血管细胞，免疫细胞等）内CaMKK2活性增加。

在一些实施例中，当前公开的主题涉及治疗饱食控制疾病的对象的方法。该方法包括，由或基本上由对受试者施用有效量的本文所述的化合物，从而治疗饱食控制疾病。

本公开的另一方面提供了本文公开和示出的所有内容。

以下示例进一步说明了本公开内容，并且无意于限制范围。特别地，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施例，因为这样当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于限制本发明，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。

示例

已经包括以下实施例以向本领域的普通技术人员提供指导以实践本公开主题的代表性实施例。鉴于本公开和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅是示例性的，并且在不背离当前公开的主题的范围的情况下，可以采用各种变化、修改及变型。

示例1

新型小分子抑制剂化合物的开发

STO-609/CaMKK2的晶体结构的计算模型用于基于计算化学来开发CaMMK2（SMIC）的小分子抑制剂。特别是，获得了STO-609/CaMKK2的晶体结构，修改工具化合物的部分，该工具化合物并未预计会干扰受体结合，但应具有改善的溶解度（计算的LogP〜3），而对细胞渗透没有不利影响（总极性表面积<140被认为是有利的）。通过MonomerChem（RTP，北卡罗来纳州）合成了五（5）种初始化合物，并用于生成本文的数据。

下表1说明了最初合成的5种化合物，每种化合物代表一个新的亚类。

表1

化合物1-10

示例2

针对CaMKK2的生化活性

化合物EY301-EY305的初步筛选是在HEK293细胞外进行的（均在10μM下测试）。简而言之，将HEK293细胞在RPMI-40完全培养基和1％胎牛血清（FBS）中培养至亚汇合，在37℃下于5％CO₂中孵育。然后在开始实验之前将培养的细胞切换至无血清培养基过夜。然后将细胞用5种SMIC（EY301、EY302、EY303、EY304和EY305，均以10μM的浓度）中的一种，STO-609（10μM）或载体对照在37°C下进行预处理，并在5％CO₂中孵育2小时。然后用钙离子载体离子霉素（0.5mg/mL）刺激细胞15分钟，然后洗涤，收获细胞并裂解，以使用标准方法回收总蛋白。在标准蛋白质凝胶电泳之后，然后针对每种条件针对磷酸-CaMKK2（图4A）或磷酸-AMPK（图4B）进行蛋白质印迹。研究一式三份进行。密度测定法分析表明，CaMKK2自动磷酸化（图4C）对EY301、EY303、EY304和EY305具有抑制作用（与STO-609相比，EY301和EY304显得更有效）和磷-AMPK对EY303、EY304和EY305具有部分抑制作用（图4D），它们都可以与STO-609相提并论。

预示示例3

化合物1-5的功能筛选

单向混合淋巴细胞反应（MLR）（图5）将用于筛选EY301-EY305的功能抑制能力。将C57BL/6小鼠的脾脏细胞用作响应细胞，并将BALB/c小鼠的脾脏细胞（用Co60、3000 rads照射）用作刺激细胞。然后将两种类型的细胞以相同的体积和浓度混合，并在37°C，低血清条件下于5％CO₂中孵育24小时。方法是1）载体对照；2-6）五个SMIC（EY301-EY305）之一，或7）STO-609（每个SMIC或STO-609的浓度分别为10μM、3μM、1μM、0.3μM和0.1μM）。每个浓度/条件将重复三次。然后将上清液回收并浓缩，以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行分析，以分析几种主要的T细胞和巨噬细胞衍生的细胞因子和效应分子，这些分子被认为可以通过渗透免疫细胞来介导破坏性损伤（例如TNF-α、IL-2、TGF-β和IFN-γ）。然后，通过计算每种化合物对每种目标细胞因子的IC50来确定EY301-EY305的功能抑制活性。然后，将按每种目标细胞因子的IC50浓度对化合物进行排序，以评估每种SMIC对免疫细胞效应子功能的相对功效和潜力。

示例4

QGVHD的小鼠模型

眼移植物抗宿主病（OGVHD）是一种模型性眼炎症疾病，是已知其中T细胞和巨噬细胞起着关键致病作用的疾病，因为A）与其他疾病共享重叠的病理和临床特征，较常见的眼部炎症疾病（如房水性泪液缺乏、睑板腺功能障碍、葡萄膜疾病等）；B）高风险人群的定义很明确，因为它发生在因血液系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病和其他疾病而接受同种异体骨髓移植的个体中。因此，OGVHD的实验模型代表了有吸引力的系统，可在其中研究靶向和抑制CaMKK2对眼部疾病的治疗潜力。基于骨髓移植（“BMT”）的小鼠模型，其中补充了脾脏T细胞（从C57BL/6到BALB/c小鼠），代表了主要的组织相容性失配，概述了眼移植物抗宿主疾病（OGVHD）（图6）的关键病理特征。简而言之，将C57BL/6和BALB/c株的2-3月龄的小鼠用于该模型。处死C57BL/6小鼠，然后在恢复的胫骨和股骨的干通道中冲洗RPMI-1640培养基。然后将骨髓匀浆并过滤，并从供体小鼠中回收不含红细胞的未纯化骨髓（BM）细胞。另外，无菌收获供体脾脏，切成小块，用刮铲捣碎，过滤并分离成分离的脾脏衍生T细胞的单细胞悬液。受体BALB/c小鼠以950cGy辐照剂量（使用铯137来源）进行全身致死性辐照，然后通过尾静脉注射将供体C57BL/6BM细胞和脾脏源性T细胞移植到经辐照的受体小鼠上。

在不存在脾脏源性T细胞的同时过继转移的情况下，临床GVHD不发展（图7A）（称为“安全BMT”）。当将供体脾脏源性T细胞添加到骨髓移植物（GVHD BMT）中时，临床GVHD确实会发展，并且GVHD的相对严重性会随着移植的脾脏源性T细胞剂量的增加而增加。在该模型（图7B）中均观察到了严重的人OGVHD的经典发现，包括流泪、眼睑结、眼睑边缘浮肿、化学反应和角膜病变。OGVHD迹象在BMT+T细胞过继转移后14天内开始出现，其严重程度随时间而发展（图8，与安全BMT相比，GVHD BMT严重程度评分为-90天）。观察到角膜病变是严重的，如通过眼表的强烈荧光素染色所证实的（图9B），与没有角膜染色的对照安全BMT相比（图9A）（通过临床分级系统定量的荧光素染色，参见（33）。使用经过验证的临床分级系统（34）对这些参数进行定量评分，结果显示在实验性OGVHD的BMT+T细胞接受者组中，平均临床评分为24±2（图9C），与之相比，对照安全BMT接受者组中平均评分为4±2，没有OGVHD的迹象（图9C）。

OGVHD的这些临床发现与T细胞（图10A）和巨噬细胞（图10B）渗透受影响的小鼠角膜基质以及延髓和睑结膜中的重要组织病理学证据相关。总体而言，这些数据表明该模型概括了人类OGVHD的基本临床和病理特征，因此是测试用于治疗OGVHD的新型药物（尤其是新型SMIC药物）的理想实验模型。

示例5

CaMKK2抑制剂的局部给药

使用示例4中所述的OGVHD模型来测试工具化合物CaMKK2抑制剂STO-609（1.5mg/mL）的局部眼部给药是否可以预防或改善实验性OGVHD的严重性。在BMT+T细胞转移后，允许受体BALB/c小鼠恢复14天，然后开始实验程序。从BMT+T细胞转移后第14天开始，每天向STO-609或载体给药，持续2周，并在整个治疗期间进行定期检查。在治疗期结束时，对眼睛进行OGVHD的迹象分级（以掩盖的方式），并根据改良的临床分级系统进行评分（33、34）。然后处死小鼠并恢复眼睛以进行眼附件组织（眼睑，结膜）和前段（结膜、巩膜、角膜）的组织学分析，并进行OGVHD的病理学评估（即免疫细胞渗透、结膜瘢痕形成、杯状细胞丢失、睑板腺疤痕和泪腺破裂/渗透/疤痕）。

与具有睑缘肿胀和瘢痕并伴有眼周皮毛脱落、眼睑结硬皮、轻度化学作用，泪膜减少和角膜病变（图11A）的载体处理小鼠相比，STO-609处理的小鼠具有较少的OGVHD迹象（图11B）。与经载体处理的小鼠（中值17）相比，经STO-609处理的小鼠（中值5）的OGVHD的严重性明显降低（图11C）。重要的是，未观察到明显的药物毒性。工具化合物抑制剂STO-609的结果支持CaMKK2作为治疗OGVHD的可行靶标，并建立了SMIC治疗潜力的概念验证，为有前景的SMIC体内测试提供了合理的基础。

预示示例6

鉴定在体外抑制T细胞和/或巨噬细胞活性的SMIC

我们将从20个NCE SMIC的库中识别至少一个（1）SMIC，该库在体外抑制T细胞和/或巨噬细胞的活性并在OGVHD小鼠模型中有效。这将使最初排除在体外高浓度下不具有抑制活性的化合物成为可能。使用巨噬细胞和T细胞系，将使用蛋白质印迹密度分析，CaMKK2底物CaMKIV和AMPK的磷酸化以及CaMKK2的自磷酸化来评估候选分子抑制CaMKK2活性的能力。简而言之，在存在载体、STO-609、候选SMIC或载体对照的情况下，在用0.5pg/mL离子霉素和10ng/mL PMA处理15分钟之前，将细胞在降低血清的条件下培养。然后将回收细胞并裂解总蛋白，并对pCaMKK2、pAMPK、pCaMKIV进行蛋白质印迹分析，将光密度分析标准化为肌动蛋白，与STO-609和媒介相比，SMIC具有抑制能力。

我们将利用混合淋巴细胞反应（MLR）（即“皿中的GVHD”）通过抑制T细胞和巨噬细胞效应子功能的能力（即IC50）对SMIC进行排序。将在MLR分析中筛选最有前途的SMIC（即具有生化抑制活性的SMIC）以评估功能抑制，特别是通过使用三个重复测定的MLR上清液的ELISA测定，减少炎症细胞因子IL-2、TNF-α、IL-6、TGF-β和IFN-γ的产生。使用MLR数据，将按每种细胞因子的IC50对SMIC进行排序。简而言之，将针对每种条件：STO-609和候选SMIC（均以以下浓度：10μM、3μM、1μM、0.3μM和0.1μM）一式三份将辐照的BALB/c脾脏细胞，以及载体对照，添加到C57BL/6脾脏细胞中。然后，针对每种细胞因子计算药物IC50，对炎症细胞因子IL-2、TNF-α、IL-6、TGF-β和IFN-γ进行ELISA。还将针对药物浓度进行活力和凋亡的测定，以确定体外潜在的剂量限制毒性。

将使用可通过Eurofins/DiscoverX（加利福尼亚州弗里蒙特）获得的有偿服务技术，进行激酶组扫描以评估候选SMIC对>450种常见激酶的脱靶活性。前5个SMIC将根据脱靶活性最少进行排名。这种集体筛选策略（蛋白质印迹分析、MLR反应、激酶组扫描）的目标是提名至少五个（5）_SMIC（按效能和缺乏脱靶活性的排名），以进行体内筛选和测试。

预示示例7

SMIC的体内耐受性

我们将对未操纵的2至3个月大的野生型BALB/c小鼠局部给药的前（5）名SMIC进行nonGLP毒理学研究，通过临床评估和组织病理学评估局部毒性。简而言之，将对每种候选SMIC使用水溶液中15mM的储备液浓度，与载体对照相比，初步剂量范围研究将以3倍稀释度（3剂，每个给药组n=3，5种候选化合物）进行，每天局部两次，共14天。局部毒性将通过两个指标进行评估：（1）临床发现（结膜出血、化学病、眼部雾霾、AC中的炎症细胞）和（2）组织学（角膜、结膜、巩膜、晶状体、视网膜、脉络膜）。经过临床生物显微镜眼部检查后，将处死小鼠并恢复眼睛以进行组织学检查。将以遮罩方式检查眼部组织的标准H&E切片，以发现炎症或表明毒性的组织形态变化的证据。进行全身毒性的表面评估，评估发育失败和死亡率。任何大于“痕量异常”的发现都将取消该化合物浓度的资格。这些体内耐受性研究的目标是通过局部应用确定至少两（2）个没有眼部毒性的SMIC。

预示示例8

OGVHD中的概念验证

我们将在OGVHD小鼠模型中进行临床前概念验证研究，以证明局部应用前两（2）名SMIC候选人的临床疗效。

最终，目标是证明局部应用SMIC可以降低OGVHD的严重性，以建立概念证明，选定的SMIC不仅可以作为OGVHD的疗法，而且可以作为与OGVHD具有重叠疾病机制的其他较常见的眼部炎症疾病。初步数据表明STO-609实现了这一目标，这些研究将肯定并扩展到选定的候选SMIC。在此OGVHD模型中将筛选出示例7中确定的两个最有希望的候选SMIC。简而言之，将C57BL/6和BALB/c株的2至3个月大的小鼠用于该模型。处死C57BL / 6小鼠，然后在恢复的胫骨和股骨的干通道中冲洗RPMI-1640培养基。然后将回收的骨髓匀浆并过滤，并从供体小鼠中回收不含红细胞的未纯化的骨髓（BM）细胞。另外，无菌收获供体脾脏，切成小块，用刮铲捣碎，过滤成含有T细胞的分离脾脏细胞的单细胞悬液。受体BALB/c小鼠接受铯137来源的950cGy剂量的全身致死性辐射，然后通过尾静脉注射将供体C57BL/6BM细胞和脾脏源性T细胞移植到受辐照的受体小鼠上。然后在开始进一步的实验程序之前，让受体的BALB/c小鼠恢复约14天。届时，将开始每天两次使用所选药物进行双边局部治疗，并在整个四周的治疗期内进行定期检查。治疗两周和四周后将进行临床评分。OGVHD的临床发现包括眼睑边缘水肿、眼睑结硬皮、泪膜破裂、结膜化学疗法和角膜病变。这些发现将使用从先前发表的研究改编的定量评分系统进行分级（33、34）。治疗期（BMT后六周）后，处死小鼠并恢复眼睛，以进行眼附件组织（眼睑，结膜）和前段（结膜、巩膜、角膜）的组织学分析，并进行OGVHD的病理学评估（即免疫细胞渗透、结膜瘢痕形成、杯状细胞丢失、睑板腺瘢痕形成和泪腺破坏/渗透/瘢痕形成）。

治疗组如下：

a）对照组：不同时将T细胞（n=5）移植到BALB/c受体（h=10）的BL/6供体BM，不发展OGVHD的对照组，未给药。

b）实验组1：BL/6供体BM和T细胞（n＝8）被移植至BALB/c受体（n＝15），载体对照。

c）实验组2：BL/6供体BM和T细胞（n＝8）被移植到BALB/c受体（n＝15），STO-609。

d）实验组3：BL/6供体的BM和T细胞（n＝8）被移植到BALB/c受体（n＝15），SMIC 1号。

e）实验组4：BL/6供体的BM和T细胞（n＝8）被移植到BALB/c受体（n＝15），SMIC 2号。

为了分析数据和观察到的发现，由于临床评分反映了分类等级，因此将使用非参数统计数据（例如Mann-Whitney试验）来比较各治疗组的中位评分。参数统计将用于在病理学评估中比较连续变量（例如定量免疫细胞渗透）。

这些研究的目标是确定至少一个候选SMIC，其OGVHD得分降低50％，这已针对STO-609进行了证明和证实。

示例9

鉴定在体外抑制细胞CaMKK2活性的SMIC

表1中引用了初始的合成SMIC集。在这组中，选择六个候选SMIC（EY1003.A001.B001、EY1005.A001.B001、EY1006.A001.B001、EY1007.A001.B001、EY1008.A001.B001、EY1001.A002.B001）用于HEK293细胞中基于细胞的生化筛选测定。HEK-293细胞用以下之一处理：STO-609、EY1003.A001.B001、EY1005.A001.B001、EY 1006.A001. B001、EY1007.A001.B001、EY1008.A001.B001（所有均为30 mM），或在用l mM离子霉素（一种已知的CaMKK2活化剂）刺激之前，使用载体对照。然后用针对CaMKK2和AMPK的磷酸特异性抗体通过蛋白质印迹分析探测细胞裂解物，以分别评估候选SMIC对CaMKK2自磷酸化活性和底物磷酸化活性的影响（图12）。包含B-肌动蛋白作为负载对照。图显示了相对光密度法的定量，迹象被标准化为B-肌动蛋白，以校正样品中蛋白质负载的变化。基于此分析，候选SMIC EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001在体外显示出对CaMKK2抑制活性相似的效力。

示例10

SMIC的体内耐受性

在2-3个月大的野生型BALB/c小鼠中评估了局部给药的候选SMICEY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001的NonGLP毒理学研究，通过临床评估和组织病理学评估了局部毒性。两种化合物每天两次以1.5mg/mL的剂量局部给药，持续14天。通过临床生物显微镜眼睛检查或死后组织学评估，未观察到药物的局部毒性迹象。另外，这两种化合物均未与任何明显的全身毒性相关（即，没有发育失败和死亡的证据）。

示例11

QGVHD中的概念验证

在OGVHD小鼠模型中进行了临床前概念验证研究，以评估局部给药实施例6和7中鉴定的两种最有前景的候选SMIC的临床功效，即EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001。先前的实验表明，CaMKK2 STO-609的工具化合物抑制剂可实现此目标，并且本研究的目的是评估候选NCE SMIC是否达到可比的疗效。简而言之，在消融受体骨髓后，通过从2至3个月大的C57BL/6J供体小鼠中分离骨髓和脾T细胞，并将分离的骨髓和T细胞移植至2至3个月大的BALB/c小鼠。然后在开始进一步的实验程序之前，让接受者BALB/c小鼠恢复约14天。然后使用以下任何一种（实验组，n=5）对小鼠进行每日局部治疗：STO-609醋酸（1.5mg/mL）、SMIC铅化合物EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001（均在1.5mg/mL）和1％泼尼松龙醋酸盐，从BMT后第14天开始，持续两周。

OGVHD的临床发现包括眼睑边缘水肿、眼睑结硬皮、泪膜破裂、结膜化学疗法和角膜病变。通过使用从先前发表的研究改编的定量评分系统，这些发现在治疗1周和2周后进行了临床分级（33，34）。领先的SMIC EY1006.A001.B001和EY1001.A002.B001都降低了临床OGVHD发现的严重程度，其功效与STO-609相似（图13）。相比之下，用载体对照治疗的眼睛具有睑缘肿胀和瘢痕形成睫毛和眼周毛发脱落、眼睑结硬皮、化学反应、泪膜异常和角膜病变。在预防OGVHD的迹象方面，STO-609和领先的SMIC优于载体和泼尼松龙（STO-609，EY1006.A001.B001，EY1001.A002.B001与载体或泼尼松龙相比，p<0.05）。对于该评分系统和实验，轻度疾病的评分为0-5，中度疾病的评分为6-10，重度疾病的评分为>10。

该实验的发现建立了概念证明，即具有理想理化特性的局部给药SMIC可作为OGVHD的治疗剂，以及潜在的更常见的眼部炎症疾病（即炎性干眼症）共享OGVHD的疾病机制。

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化合物6-9的合成路线

化合物6-9：通用程序步骤1

将相应的醛和苯二胺（1mmol）在EtOH（4mL）中的等摩尔溶液加热回流直到所有起始原料都转化为亚胺中间体（约1.5小时）。加入DDQ（395mg，1.1mmol）后，将反应混合物加热回流直到亚胺中间体完全转化为苯并咪唑产物（通常30-60分钟）。然后将反应混合物冷却至室温，用饱和NaHCO₃水溶液稀释，并将产物用乙酸乙酯萃取两次。结合的有机萃取物用无水MgSO₄干燥，过滤，并在减压下浓缩。粗产物通过硅胶快速柱色谱纯化，得到相应的纯苯并咪唑。

通用程序步骤2。

在150mL甲醇中的被硝基取代的苯并咪唑中间体（2g，7mmol）：乙酸乙酯中的溶液在室温下在活性炭催化剂上（600mg，5wt％Pd）。反应（TLC）完成后，将催化剂通过硅藻土垫滤出，并将滤液减压浓缩，得到所需产物，为黄色固体。

化合物6-9，通用程序步骤3

向起始原料苯胺（7.5mmol）在THF（100mL）中的溶液中加入三光气（7.5mmol）。将混合物超声处理10分钟，并将得到的悬浮液在55-60°C加热1h。浓缩至干，向残余物中加入冰水和饱和碳酸氢钠，过滤形成的固体，将固体用水洗涤并干燥，用于下一步反应。

化合物6-9，通用程序步骤4

在5mLTHF中的悬浮液中超声处理原料脲（1.36mmol）、三苯膦（6mmol）和醇（150mL，过量）5分钟，并加入偶氮二羧酸二异丙酯（DIAD）1.4mL（7mmol）。将混合物超声处理30分钟。将混合物在室温搅拌过夜。将混合物浓缩至干，并将残余物用乙醚稀释。过滤沉淀的固体，并用无水乙醚（4×50mL）洗涤固体。将固体干燥并通过快速色谱法纯化（己烷-EtOAc，0-50％）以提供所需化合物。

化合物10的合成路线

步骤1：用于化合物6-9如步骤1所示。

步骤2：通用程序：

在5mL乙醇溶液中，向硝基化合物（1mmol）添加Zn粉（5mmol）和饱和NH₄Cl溶液2mL。将混合物超声处理2小时。将混合物用乙酸乙酯（3×30mL）萃取。有机层用水洗涤，干燥（Na₂SO₄）并浓缩，得到棕色固体。粗固体通过柱色谱法纯化（己烷-EtOAc，0-100％）以提供期望的产物。

参考文献

下列参考文献的全文并入本文。

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本披露的一般性陈述

以下编号的陈述提供了本公开的一般描述，并且无意于限制所附权利要求。

陈述1：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中R₁选自氧（O）或硫（S）；以及

其中R₂选自氢（H）、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述2：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中R选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述3：一种包含式（I）或式（II）的化合物：

式（I） 式（II）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X为氧（O）或硫（S），n为1或2。

陈述4：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S），并且R是酯或酯前药，其包括但不限于烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述5：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S）；

其中R₁选自氢（H）、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

其中R₂选自氢（H）、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述6：一种包含式（I）、式（II）、式（III）或式（IV）的化合物：

式（I） 式（II）

式（III） 式（IV）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中R、R₁和R₂选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；其中n为1、2或3。

陈述7：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

其中A表示碳环或杂环芳族环中的原子或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物。

陈述8：一种包含式（I）的化合物：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，其中X为氧（O）或硫（S）。

陈述9：一种包含式（I）或式（II）的组分：

式（I）

式（II）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，

其中R₁是氢（H）或COOCH₃，并且其中R₂是CH₂CN、CH₂COOC₂H₅或CH₂COPh。

陈述10：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）的组分：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中R₁选自氧（O）或硫（S）；其中R₂选自氢（H）、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述11：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）的组分：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中R选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述12：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I），式（II）或两者的组分：

式（I）

式（II）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X为氧（O）或硫（S），n为1或2。

陈述13：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式（I）的组分：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X为氧（O）或硫（S），R为酯或酯前药，包括但不限于环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述14：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）的组分：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X是氧（O）或硫（S）；其中R₁选自氢（H）、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。其中R₂选自氢（H）、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

陈述15：一种调节受试者中的CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）、式（II）、式（III）、式（IV）或其组合的组分：

式（I）

式（II）

式（III）

式（IV）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中R，R₁和R₂选自环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。并且其中n是1、2或3。

陈述16：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）的组分：

式（I），

其中A表示碳环或杂环芳族环中的原子或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物。

陈述17：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I）的组分：

式（I）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，其中X为氧（O）或硫（S）。

18，一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的式（I），式（II）或两者的组分：

式（I）

式（II）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或其衍生物，

其中R₁是氢（H）或COOCH₃，并且其中R₂是CH₂CN，CH₂COOC₂H₅或CH₂COPh。

陈述19：一种治疗任何眼部疾病的方法，包括但不限于：1）眼表面炎症疾病（OSID），包括但不限于眼部移植物抗宿主病、眼部瘢痕性天疱疮、春季角膜结膜炎、过敏性眼病、睑板腺功能障碍、房水缺乏症（常见的干眼病）、角膜瘢痕、结膜瘢痕和纤维化；2）葡萄膜炎和其他眼部炎症疾病，包括但不限于角膜炎、巩膜炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、中间葡萄膜炎、睫状体炎、后葡萄膜炎、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎或非传染性，感染性或特发性病因的胰腺炎；3）“眼后”视网膜疾病，包括与干性年龄相关的黄斑变性，与新生血管性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜血管疾病（如视网膜静脉阻塞，视网膜动脉阻塞）以及视网膜变性和营养不良。在受试者中，该方法包括向受试者施用有效量的陈述1-9中任一项的化合物，以便治疗眼部疾病。

陈述20：一种治疗受试者的额眼或远端眼部适应症的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的陈述1-9中任一项所述的化合物，以治疗该适应症。

陈述21：一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述1-9中任一项的化合物，从而治疗癌症。

陈述22：一种治疗受试者的食欲疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述1-9中任一项的化合物，从而治疗食欲疾病。

陈述23：一种在受试者中治疗全身性炎症或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等的方法，该方法包括向受试者施加有效量的陈述1-9中任一项的化合物，从而治疗全身性炎症疾病。

陈述24：一种具有式（XX）的化合物：

（XX）

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X是氧（O）或硫（S）；其中Y是NR₄或CR₅R₆；其中R₁为-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇、-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中R₄是氢（H）、C1-C10烷基、-CH₂CN、-CH₂C(O)NH_2、-CH₂COOH、-CH₂SO₂CH₃、-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂OH、-CH₂噻吩基、-CH₂呋喃基、-CH₂CH₂杂环、-CH₂CH₂环烷基、-CH₂CH₂杂环烷基，-CH₂CHOCH₂OH或-(CH₂)_nZ(CH₂)_mCH₃，其中n是1-5的整数，m是0-5的整数，Z是氧（O）或硫（S）；

其中每个R₅和R₆独立地是氢（H）、C1-C5烷基，或R₅和R₆一起可以是3至7元环烷基环；其中R₇为C1-C5烷基。

陈述25：根据陈述24所述的化合物，其中X是氧。

陈述26：根据陈述24或25中任一项所述的化合物，其中Y为NH、NCH₃、NCH₂CH₃、NCH(CH₃)₂、

、或-CH₂CH₂CH₂SCH₃

陈述27：根据陈述24-26中任一项所述的化合物，其中R₁是COOH。

陈述28：根据陈述24-27中任一项所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

陈述29：根据陈述24-28中任一项所述的化合物，其中R₂和R₃为-OCH₃。

陈述30：一种具有式（XXI）的化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，其中X是氧（O）或硫（S）；其中R₁是-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇；-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中每个R₅和R₆独立地是氢（H）、C1-C5烷基，或R₅和R₆一起可以是3至7元环烷基环；其中R₇是C1-C5烷基；并且其中w是1或2。

陈述31：根据陈述30所述的化合物，其中X是氧。

陈述32：根据陈述30-31中任一项所述的化合物，其中R₁是COOH。

陈述33：根据陈述30-32中任一项所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

陈述34：根据陈述30-33中任一项所述的化合物，其中R₂和R₃为-OCH₃。

陈述35：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述24-29中任一项所述的化合物。

陈述36：一种在受试者中调节CaMKK2的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述30-34中任一项所述的化合物。

陈述37：一种治疗受试者的额眼或远端眼部适应症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的陈述24-29中任一项所述的化合物。

陈述38：一种治疗受试者的额眼或远端眼部适应症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的陈述30-34中任一项所述的化合物。

陈述39：一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述24-29中任一项所述的化合物。

陈述40：一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述30-34中任一项所述的化合物。

陈述41：一种治疗受试者食欲疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述24-29中任一项所述的化合物。

陈述42：一种治疗受试者食欲疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的陈述30-34中任一项所述的化合物。

陈述43：一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，该方法包括施用有效量的陈述24-29中任一项所述的化合物。

陈述44：一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，该方法包括施用有效量的陈述30-34中任一项所述的化合物。

应该理解，以上描述仅是说明性实施例和示例的代表。为了读者的方便，以上描述集中于所有可能实施例有限数量的代表性示例，这些示例教导了本公开的原理。该描述没有试图详尽地列举所描述的所有可能的变化或甚至这些变化的组合。对于本公开的特定部分可能没有提出替代实施例，或者对于一部分可能没有其他未描述的替代实施例，这不被视为对那些替代实施例的免责声明。普通技术人员将理解那些未描述的实施例中的许多涉及技术和材料上的差异，而不是本公开原理的应用上的差异。因此，本公开内容并非旨在限制小于所附权利要求书和等效方案中所阐述的范围。

通过引用合并

出于所有目的，通过引用将本文引用的所有参考文献、文章、公开文本、专利、专利公开文本和专利申请的全部内容通过引用并入本文。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、公开文本、专利、专利公开文本和专利申请均未提及，也不应被视为不应被视为对它们构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。应当理解，尽管已经结合本公开的详细说明书描述了本公开，但是前述说明书旨在示出而不是限制范围。其他方面、优点和变型在下面提出的权利要求的范围内。本说明书中引用的所有公开文本，专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的公开文本或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种化合物，具有式（XX）：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S）；

其中Y是NR₄或CR₅R₆；

其中R₁是-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇；-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；

独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中R₄是氢（H）、C1-C10烷基、-CH₂CN、-CH₂C(O)NH₂、-CH₂COOH、-CH₂SO₂CH₃、-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂OH、-CH₂噻吩基、-CH₂呋喃基、-CH₂CH₂杂环、-CH₂CH₂环烷基、-CH₂CH₂杂环烷基、-CH₂CHOCH₂OH或-(CH₂)_nZ(CH₂)_mCH3其中，n是1至5的整数，m是0至5的整数，Z是氧（O）或硫（S）；

独立地，其中每个R₅和R₆是氢（H），C1-C5烷基或R₅和R₆可以一起是3至7元环烷基环；以及

其中R₇是C1-C5烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中Y是NR₄。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中Y是NH、NCH₃、NCH₂CH₃、NCH₂CH₂F、NCH(CH₃)₂、-CH₂CH₂OCH₃、-CH₂CH₂CH₂SCH₃、或

。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中R₁是COOH。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中R₂和R₃是-OCH₃。

7.一种化合物，具有式（XXI）：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S）；

其中R₁是-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇；-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；

独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中每个R₅和R₆独立地是氢（H），C1-C5烷基，或R₅和R₆可以一起是3至7元环烷基环；

其中R₆为C1-C5烷基；并且其中w是1或2。

8.根据权利要求7所述的化合物，其中X是氧。

9.根据权利要求7所述的化合物，其中R₁是COOH。

10.根据权利要求7所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

11.根据权利要求7所述的化合物，其中R₂和R₃是-OCH₃。

12.一种在受试者中调节CaMKK2的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

13.一种在受试者中调节CaMKK2的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

14.一种治疗受试者的额眼或远端眼适应症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

15.一种治疗受试者的额眼或远端眼适应症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

16.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

17.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

18.一种治疗受试者食欲疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

19.一种治疗受试者食欲疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

20.一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

21.一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

Claims (21)

1.一种化合物，具有式（XX）：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或其衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S）；

其中Y是NR₄或CR₅R₆；

其中R₁是-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇；-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；

独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中R₄是氢（H）、C1-C10烷基、-CH₂CN、-CH₂C(O)NH₂、-CH₂COOH、-CH₂SO₂CH₃、-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂OH、-CH₂噻吩基、-CH₂呋喃基、-CH₂CH₂杂环、-CH₂CH₂环烷基、-CH₂CH₂杂环烷基、-CH₂CHOCH₂OH或-(CH₂)_nZ(CH₂)_mCH3其中，n是1至5的整数，m是0至5的整数，Z是氧（O）或硫（S）；

独立地，其中每个R₅和R₆是氢（H），C1-C5烷基或R₅和R₆可以一起是3至7元环烷基环；以及

其中R₇是C1-C5烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中X是氧。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中Y是NH、NCH₃、NCH₂CH₃、NCH₂CH₂F、NCH(CH₃)₂、-CH₂CH₂OCH₃、-CH₂CH₂CH₂SCH₃、或

。

4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R₁是COOH。

5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物，其中R₂和R₃是-OCH₃。

7.一种化合物，具有式（XXI）：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或衍生物，

其中X是氧（O）或硫（S）；

其中Y是NR₄或CR₅R₆；

其中R₁是-CH₂COOH、-COOH、-CH₂COOCR₇、-COOR₇；-CH₂CONH₂、-CONH₂、-CH₂CONR₅R₆或-CONR₅R₆；

独立地，其中每个R₂和R₃是氢（H）、C1-C10烷基、-OR₇、-OCH₂CH₂OR₇、-OCH₂CH₂NR₅R₆、-OCH₂CH₂COOR₇或-OCH₂CH₂PO₃H；

其中每个R₅和R₆独立地是氢（H），C1-C5烷基，或R₅和R₆可以一起是3至7元环烷基环；

其中R₆为C1-C5烷基；并且其中w是1或2。

8.根据权利要求7所述的化合物，其中X是氧。

9.根据权利要求7或8所述的化合物，其中R₁是COOH。

10.根据权利要求7-9任一项所述的化合物，其中R₂或R₃是-OCH₃。

11.根据权利要求7-10任一项所述的化合物，其中R₂和R₃是-OCH₃。

12.一种在受试者中调节CaMKK2的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

13.一种在受试者中调节CaMKK2的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

14.一种治疗受试者的额眼或远端眼适应症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

15.一种治疗受试者的额眼或远端眼适应症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

16.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

17.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

18.一种治疗受试者食欲疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

19.一种治疗受试者食欲疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

20.一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物。

21.一种治疗受试者全身性炎症或自身免疫性疾病的方法，例如移植物抗宿主病、结节病、系统性红斑狼疮等，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7-11中任一项所述的化合物。

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