CN112641794B - 川续断皂苷乙在制备防治血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了川续断皂苷川续断皂苷乙在制备预防或治疗血管疾病药物中的用途，为川续断皂苷的应用提供了新的范围，同时本发明还提供了一种用于防治血管疾病的治疗药物，本发明人通过研究发现川续断皂苷乙参与细胞的增殖和血管重构过程，具有防治血管损伤后内膜增生作用，故本发明药物尤其适用于防治血管内膜增生类的血管疾病。

Description

川续断皂苷乙在制备防治血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及川续断皂苷乙在制备预防或治疗血管疾病药物中的用途。

背景技术

血管重构是动脉粥样硬化、血管成形术、高血压等多种疾病的共同病理基础。研究显示，血管重构形成是血管内外环境改变，造成的一系列结构和功能异常，包括细胞的增殖、迁移、凋亡以及机制成分的改变等，这一系列动态改变的基础上，血管对其内外环境的刺激产生结构变化，如管壁增厚，管壁管腔比值增大，微小动脉数量减少，随即导致血管功能异常。其中，平滑肌细胞(VSMCs)的增殖与迁移是其中最为主要的病理过程。目前，新生内膜增生与血管重塑是临床上血管再狭窄及管腔治疗失败的主要原因，因此，如何防治血管内膜增生是业内亟待解决的难题。

川续断皂苷乙(dipsacoside B)，来源于续断与山银花，是山银花的主要组成成分之一；川续断皂苷乙为五环三萜齐墩果烷类皂苷，五环三萜皂苷类化合物是一类化学结构新颖、立体结体复杂。具有保肝、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等多种生物活性的化合物。有研究报道了川续断皂苷乙保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。但迄今尚未见其对内膜增生性血管重构治疗作用的有关报道。

川续断皂苷乙对心血管系统的药理作用是本发明人长期以来一直关注的课题，在前期的研究中我们发现：川续断皂苷乙对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖具有抑制作用。然而川续断皂苷乙是否对血管重构具有抑制作用，其作用机制如何，目前未见报道。将其发展为治疗肺动脉高压等疾病的药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种川续断皂苷乙在制药中的新用途，具体涉及川续断皂苷乙在制备预防或治疗血管疾病药物中的用途。

本发明所述的川续断皂苷乙的化学结构式如下所示(分子式：C₅₃H₈₆O₂₂，分子量：1075.44)，

本发明人在研究中采用SD大鼠腹主动脉球囊损伤模型，HE染色法检测川续断皂苷乙对血管内膜增生厚度的影响；结果显示川续断皂苷乙显著降低内膜增生厚度；通过体外建立Ang-II诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的细胞增殖模型，检测川续断皂苷乙对细胞增殖活力的影响，Edu法测定使用该化合物时细胞增殖水平的变化，结果表明，川续断皂苷乙能显著抑制细胞增殖；流式方法测细胞周期显示，川续断皂苷乙可能阻滞VSMCs的G1期向S期合成，进而影响细胞增殖。川续断皂苷乙能抑制细胞增殖下调TOP2a、p-AKT/AKT及PCNA表达；实验证明，所述化合物川续断皂苷乙对血管平滑肌细胞的增殖过程产生抑制，并具有预防及治疗血管内膜增生的作用。

即本发明所述化合物川续断皂苷乙在制备防治血管疾病的药物中的应用。

进一步的，所述血管疾病为血管内膜增生相关的血管疾病。

由上述实验结果可知，通过本发明实施例中的药理实验及体外与体内实验显示，川续断皂苷乙参与细胞的增殖和血管重构过程，具有防治血管损伤后内膜增生作用，可进一步制备防治血管内膜增生的药物。所述药物包括川续断皂苷乙或其药学上可接受的盐或酯。

因此，本发明的另一个目的旨在提供一种由川续断皂苷乙制备而成的用于防治血管内膜增生的药物。

根据本发明的一些实施方式，所述药物还包含药学上可接受的载体或辅料。

进一步地，所述药学上可接受的载体或辅料包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

根据本发明的一些实施方式，所述药物为药学上可接受的制剂。

进一步的，所述药学上可接受的制剂包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂或膏剂。

通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

附图说明

图1为本发明实施例1中各靶标蛋白与川续断皂苷乙分子对接位点图，其中；图1中A为靶标蛋白TOP2a与川续断皂苷乙分子对接图、B为靶标蛋白BCL-xL与川续断皂苷乙分子对接图、C为靶标蛋白PYGM与川续断皂苷乙分子对接图、D为靶标蛋白PTGS1与川续断皂苷乙分子对接图。

图2为本发明实施例2中川续断皂苷乙对VSMCs增殖活力的影响情况图

图3为本发明实施例2中川续断皂苷乙对Ang-II诱导的VSMCs增殖的影响，图3中A为影响图像，B为图像的分析结果。

图4为本发明实施例3中川续断皂苷乙对TOP2a、p-AKT/AKT、PCNA蛋白的表达的图像及分析结果图。

图5为本发明实施例4中各组大鼠血管内膜HE染色代表图

图6本发明实施例4川续断皂苷乙对新生内膜的影响

图7为本发明实施例4川续断皂苷乙对α-SMA、OPN蛋白的表达

图8为本发明实施例5川续断皂苷乙对VSMCs细胞周期的影响

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

实施例1网络药理学预测川续断皂苷乙作用于DNA拓扑异构酶2a(TOP2a)

本发明实施例所用川续断皂苷乙购置于南京春秋生物有限公司，纯度>98％。pubchem数据库下载川续断皂苷乙的结构式，在ChemMapper数据库上以相似评分>0.8，BindingDB生物活性库的条件预测川续断皂苷乙的靶标，对预测的靶标进行下载。应用IGEMDOCK分子对接软件对川续断皂苷乙与靶标对接，首先选择活性对接位点，输入化合物进行对接，分析评分确定后续研究对象。数据库预测结果见表1及图1。

表1 ChemMapper数据库对川续断皂苷乙靶标预测结果

结果显示：iGEMDOCK对接中TOP2a、BCL-xL、PYGM和PTGS1的各值量值分别为-84.7kJ·mol-1、-70.9kJ·mol-1、-63.6kJ·mol-1、-79.5kJ·mol-1。能量值越低表示对接越稳定，其中川续断皂苷乙与TOP2a对接能量值最低，效果最好，故选取TopⅡα作为后续研究靶点。

实施例2川续断皂苷乙抑制Ang-II诱导的VSMCs细胞增殖水平实验

采用MTT法检测细胞活性，取对数生长期VSMCs，以8000cells/孔的密度种板。同时周边孔加入等体积PBS，避免边缘化效应。24h后，用培养基溶解川续断皂苷乙，梯度如：1、3、10、30、100、300、1000μM，每个空100μL,孵育2小时，后弃去，加再加入血管紧张素II(Angiotensin II,Ang-II)(1μM)诱导增殖模型，共同孵育24h，弃去，每孔加MTT液100μL，继续孵育4h。随后吸出培养液，加入150μL DMSO，摇床上避光震摇10min，在酶标仪上570nm波长处检测OD值。结果见图2。

结果显示：与对照组比较，川续断皂苷乙在1到1000μM浓度范围内对VSMCs活力影响不具有显著性(P>0.05)，即在该浓度范围，川续断皂苷乙对VSMCs没有细胞毒性(图2A)。川续断皂苷乙对Ang-II诱导的VSMCs增殖的影响，与对照组比较，模型组可以促进VSMCs细胞的增殖(P<0.05)。与模型组比较，3到1000μM的川续断皂苷乙对VSMCs的增殖活力具有明显抑制作用(图2B)。

采用EdU法检测细胞增殖。取对数生长期细胞，以每孔1×104细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。按分组处理细胞24小时：control组(高糖培养基)、model组(Ang-II，1μM)、阳性对照组姜黄素(Curcumin,5μM)+Ang-II、川续断皂苷乙(3、10、30μM)+Ang-II。加入100μL/孔的50μM EdU标记细胞4小时。去除培养液，100μL/孔的4％多聚甲醛细胞固定15分钟。去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。去除洗涤液，每孔加100μL通透液0.3％Triton X-100孵育10-15分钟。去除通透液，每孔用100μL洗涤液洗1-2次，每次3-5分钟。每孔加入100μLClick反应液，轻轻摇晃培养板。室温避光孵育30分钟。吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。吸除洗涤液后，每孔加Hoechst 33342溶液100μL，室温避光孵育10分钟。吸除Hoechst 33342溶液。用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。即进行荧光检测，倒置荧光显微镜(Olympus)获取图像并分析结果见图3。

实验结果表明，与对照组比较，模型组可以促进VSMCs细胞的增殖(P<0.01)。与模型组比较，3、10、30μM的川续断皂苷乙对VSMCs的增殖具有明显抑制作用川续断皂苷乙抑制Ang-II诱导的VSMCs细胞增殖活性。

实施例3川续断皂苷乙抑制Ang-II诱导的VSMCs细胞增殖相关蛋白的表达

将细胞以5x105/ml接种于培养皿中，待细胞融合度达到80％后，按以下相应分组处理24小时。具体分组情况如下：control组(高糖培养基)、模型为Ang-II(1μmol/L)处理组、阳性对照为姜黄素(Curcumin,Cur)处理组(Cur,5μmol/L)+Ang-II、川续断皂苷乙处理组川续断皂苷乙(3、10、30μmol/L)+Ang-II。裂解收集细胞蛋白，使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配置浓度10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶；上样孔加样20ul。电泳100V，时间为100分钟，将胶于PVDF膜置于湿转转膜，电流300mA，时间2小时。PVDF置入含5％脱脂奶粉的TBS-T中，常温45分钟；TBS-T洗涤5分钟×3次，孵育一抗膜和一抗的稀释比例为1:2000，在4℃孵育12小时；利用TBS-T洗涤10分钟×3次；二抗Goat-anti-rabbit IgG(H+L)(比例为1：5000)中室温孵育1小时；用TBS-T洗涤10分钟×3次；显影液均匀滴加在PVDF膜上，曝光30秒、显影定影；置于Alpha Imager2200灰度扫描软件进行密度分析。图像及分析结果见图4。

与对照组比较，模型组可以促进VSMCs细胞的增殖(P<0.01)。与模型组比较，3、10、30μM的川续断皂苷乙对VSMCs的增殖具有明显抑制作用。

实验结果表明：川续断皂苷乙下调VSMCs中TOP2a、p-AKT/AKT、PCNA的表达。

实施例4川续断皂苷乙降低血管内膜增生厚度，抑制血管组织中细胞增殖型相关蛋白的表达实验

SD大鼠称重后，10％的水合氯醛3ml/kg通过腹腔注射麻醉,固定于简易手术台上，依次备皮、消毒、铺巾术口周围；沿颈部正中偏左0.2cm纵行切开皮肤3cm，分离颈阔肌、左侧胸锁乳突肌，沿气管左侧对左颈总动脉进行寻找；分离出左侧颈总动脉长2.5cm左右，靠近左颈外、颈内动脉分叉处用1#丝线结扎，用血管夹阻断近端颈总动脉血流；用5ml注射器针头于近结扎处穿刺颈总动脉，退出注射器针头，用眼科剪纵行剪开左侧颈总动脉0.3cm，将2.0mm×10mm球囊导管(带0.014mm导丝)经破口顺行插至腹主动脉末端，以8kPa的压力充盈球囊，并维持压力，将球囊缓慢拉至切口处(约15秒)，抽至负压，再次送入球囊，重复上述操作，共计3次；完全退出球囊后，止血夹夹闭并用丝线结扎颈总动脉近心段，术口利用庆大霉素溶液进行冲洗，间断缝合皮下组织与皮肤，术后青霉素10万U/天肌肉注射，连用3天，预防感染。取颈总动脉上自结扎位点以下长度约O.5cm的血管组织，假手术组取相同位置和长度的血管；川续断皂苷灌胃14天，取主动脉，4％多聚甲醛固定，包埋做石蜡切片。HE染色观察内膜增生厚度。动物实验切片HE染色图见图5，分析结果见图6及图7。

实验结果显示：与sham组比较，injury组内膜与血管明显增厚(P<0.01),与injury组比较，川续断皂苷乙组可以抑制新生内膜的形成(P<0.01)。故川续断皂苷乙抑制血管内膜增生厚度，促进α-SMA表达，抑制OPN表达。

实施例5流式方法测川续断皂苷乙对VSMCs细胞周期的影响

VSMCs以1x l05密度接种于六孔板中，待细胞融合度达到80％后，含0.3％FBS的培养基同步化处理24h。接着药物分组处理24h：control组(高糖培养基)、model组(Ang-II，1μM)、川续断皂苷乙(3、10、30μM)+Ang-II。将无水乙醇-20℃预冷，然后用预冷的PBS配成75％乙醇固定液，分装于2mlEP管，置冰上备用。将细胞中的培养基倒掉，用预冷的PBS洗三遍。用0.25％的胰酶消化细胞。在六孔板中加入含10％FBS的培养基，吹打细胞，收集细胞悬液。900rpm/min,离心5min,弃上清，加入2ml预冷的PBS重悬细胞，再次900rpm/min,离心5min，弃上清。用离心管残留的PBS吹打细胞成悬液，然后加入到预冷的75％乙醇固定液中，吹打均匀。用封口膜将EP管封口，置于4℃冰箱固定24小时。送出做PI染色检测。结果见图8及表2。

表2川续断皂苷乙对VSMCs细胞周期影响的比较

与control组比较：*P<0.05，与model组比较：#P<0.05

与对照组比较，模型组VSMCs中G1期细胞明显降低，S期细胞明显升高(P<0.05)。与模型组比较，不同浓度组(3、10、30μM)川续断皂苷乙G1期细胞明显升高(P<0.05)，S期细胞明显降低(P<0.05)，由上述结果可知，川续断皂苷乙可能阻滞VSMCs的G1期向S期合成，进而影响细胞增殖。

Claims (5)

1.川续断皂苷乙在制备防治血管内膜增生的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物还包含药学上可接受的载体或辅料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药学上可接受的载体或辅料包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为药学上可接受的制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药学上可接受的制剂包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂或膏剂。

Images