CN112626126A - 能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：步骤1：扩增鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后与pFastBac 1载体连接，连接产物转入DH5α感受态中，筛选阳性克隆获得重组质粒pFastBac 1‑VP2，将测序正确的pFastBac 1‑VP2转入DH10 Bac感受态中获得重组质粒Bacmid‑IBDV‑VP2；步骤2：将Bacmid‑IBDV‑VP2转入SF9细胞，收获重组杆状病毒。本发明采用鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)作为VP2基因的来源病毒株，其能表现出更好的免疫效果。同时，本发明还提供一种病毒样颗粒极其制备方法，其优势在于：适于规模化生产、效价高、产物无需浓缩、纯化等工艺，节约成本，流程简单且安全。

Description

能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗 粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

传统动物疫苗以全病毒灭活疫苗和弱毒疫苗为主，其生产必须依赖动物细胞、鸡胚、活体动物等基质，在产量上存在较大局限性，需要较高的成本，且培育过程易引入外源病毒，导致疫苗污染。此外，天然弱毒疫苗存在毒力返强风险，生物安全问题时刻存在。随着分子生物学的发展，高新技术疫苗已成为研究的前沿领域，以分子生物学技术的基本方法研究开发兽用新型疫苗是21世纪的主导方向。重组亚单位疫苗是用基因工程DNA重组技术将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达基因产物——蛋白质或多肽制成的疫苗，与传统疫苗相比较具有安全性高、纯度高，稳定性好以及产量高等优点，该类疫苗是目前使用最广泛的新型疫苗。以大肠杆菌生产亚单位疫苗较为常见，但依旧存在不足之处：由于其革兰氏阴性菌的特性，内毒素问题长期存在；表达的蛋白缺乏糖基化、磷酸化修饰，大大降低生物学活性，以上问题均对疫苗质量产生影响，生产上需找到新的替代菌种。

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease Virus,IBDV)感染引起的鸡急性、高度接触性传染病，是我国规定要严格防控的II类动物疫病。IBDV主要侵害雏鸡体液免疫器官法氏囊，损伤淋巴细胞，从而导致鸡的免疫机能障碍，进而增加对其他病原的易感件，甚至造成对其他疫苗的免疫应答能力下降。感染IBDV后，雏鸡群在短时间内大量死亡或鸡群产肉、产蛋等生产性能大幅度下降，带来直接经济损失。由于IBDV超强毒株的出现及环境因素、免疫程序等诸多因素的影响，鸡IBD在我国发病情况呈现新趋势：流行面积日益扩大、发病鸡群日龄变宽、伴随严重继发感染和并发症等。

除了严格的环境卫生制度外，疫苗的使用仍然是目前鸡IBD的主要防控手段，生产中应用最广泛的IBDV疫苗种类是灭活疫苗和弱毒疫苗。接种鸡胚后收获尿囊液是上述两类疫苗的传统生产方式，现也有使用鸡胚成纤维细胞(CEF)生产弱毒疫苗，但无论是使用鸡胚或是CEF,都存在SPF鸡胚消耗大、单位材料生产力低、生产周期长、总体生产成本高等天然问题。传统生产工艺的缺陷对IBDV疫苗的应用产生了一定的限制，不符合现阶段养禽业疫病防控、健康发展的需求，因此，迫切需要一种低成本、大规模、高效的IBDV疫苗生产方式适应行业的生产。

杆状病毒/昆虫细胞表达系统是近年来应用最多的表达系统。目前常被使用的Bac-to-Bac表达系统。转座后的重组杆状病毒载体质粒可在大肠杆菌和昆虫细胞内复制。该表达系统具有PPH和PP10两个超强的转录启动子，转录后期可高效表达外源蛋白，最高可达到细胞总蛋白表达量的50％。此表达系统最常用的细胞系主要为草地贪夜蛾卵巢(SF9、SF21细胞)和粉纹夜蛾卵巢(High Five细胞)。两种细胞均可用无血清培养基培养，避免支原体污染。

亚单位疫苗的应用已经成为畜牧行业的趋势，建立亚单位疫苗生产体系势在必行，杆状病毒/昆虫细胞表达系统具有突出的优势。本发明核心在于通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统来表达禽法氏囊病病毒样颗粒，为大批量蛋白疫苗的生产提供可靠理论基础和技术支撑。

基于此，CN201911206321.6公开了一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用，包括病毒的分离鉴定、该病毒的VP2蛋白全基因扩增和克隆；利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建表达该抗原蛋白的重组杆状病毒VP2/GS株，该重组病毒在昆虫细胞HF中高效表达IBDV VP2抗原蛋白；经过提取纯化、BEI灭活后加入佐剂乳化制成疫苗。

该方法采用GS18株作为病毒株，其效果为：2批次疫苗对鸡具有很好的免疫效果，表达的蛋白制成的疫苗免疫原性好，免疫后21天鸡群可获得足够高的有效法氏囊抗体，足以抵抗野毒的攻击；对SPF鸡和白羽肉鸡攻毒结果显示，疫苗免疫后3-4周，免疫组鸡群可以有效的抵抗变异株传染性法氏囊病毒的攻击，剖检可见法氏囊无病变症状。

本发明的主要目的是，提出一种免疫性能更好的病毒、亚单位疫苗的原料。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法以及该病毒，本发明采用鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)作为VP2基因的来源病毒株，其能表现出更好的免疫效果。

同时，本发明还提供一种病毒样颗粒极其制备方法，其优势在于：可利用大型生物反应罐进行全悬浮规模化生产，与标准血清检测效价可达1：16，并且产物无需浓缩、纯化等工艺，节约成本，流程简单，表达的产物只是病毒的结构蛋白，无任何病毒活性，不会对人体及环境产生任何的影响和危害。

本发明的具体方案如下：一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：扩增鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后与pFastBac 1载体连接，连接产物转入DH5α感受态中，筛选阳性克隆获得重组质粒pFastBac 1-VP2，将测序正确的pFastBac 1-VP2转入DH10 Bac感受态中获得重组质粒Bacmid-IBDV-VP2；

步骤2：将Bacmid-IBDV-VP2转入SF9细胞，收获重组杆状病毒。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法中，步骤1中，鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因通过以下方法获取：

鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)使用RNA抽提试剂盒提取RNA，使用反转录酶获得cDNA；

采用引物对cDNA进行PCR扩增得到扩增产物VP2基因，扩增体系为：50μL，其中，10×PCR Buffer 5μL,dNTPlμL，上、下游引物各lμL，cDNA lμL，pfu酶lμL，ddH2O40μL；dNTP中各类碱基的浓度为l0mM；上、下游引物的浓度均为l0mM；

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30个循环；72℃10min；

上下游引物的序列分别为：

VP2—F:CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAA

VP2—R:CCCAAGCTTGAAGCCGAATGCTCCTGCAAT；

使用胶回收试剂盒将VP2基因进行回收。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法中，VP2基因与pFastBac 1载体连接的方法为：

分别将胶回收后的VP2基因和pFastBac 1载体使用BamH I和Hind III双酶切，分别回收、纯化，将酶切后的VP2基因片段和pFastBac 1载体用T4连接酶16℃过夜连接。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法中，步骤2具体为：

取无血清悬浮培养的Sf9细胞，在摇瓶中悬浮转染，转染试剂与质粒Bacmid-IBDV-VP2混匀后，加入Sf9细胞悬液中在摇床中培养，当细胞活率降至60％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒，对P0代杆状病毒进行扩增1-2次使其滴度超过10⁸TCID50。

同时，本发明还公开了一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒，其为如上所述的方法制备得到。

同时，本发明还公开了一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至5×10⁶-6×10⁶cells/ml，利用如上所述的重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，表达蛋白可形成病毒样颗粒。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒中，所述重组杆状病毒的滴度不低于10⁸TCID50。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒中，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养的参数为：

转速：120rpm；pH值：6.10±0.1；压缩空气通气量15ccm；氧气通气量30ccm；溶氧量50％；温度27℃。

在上述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒中，利用重组杆状病毒进行感染的具体方法为：

采用二阶培养法，在反应器中的细胞中接种重组杆状病毒，按MOI为0.1接种SF9细胞，接毒后搅拌速度调整80rpm吸附培养1h，病毒吸附培养后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为27℃，pH设置为6.10±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；每12h取样计数并计算活率，当细胞活率低于20％时离心培养液收集上清即可获得VP2蛋白。

最后，本发明还公开了一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒，采用如上任一所述方法制备得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)作为VP2基因的来源病毒株，其能表现出更好的免疫效果。

(2)本发明采用杆状病毒/昆虫细胞表达系统，可利用大型生物反应罐进行全悬浮规模化生产。

(2)本发明中表达生产的抗原蛋白效价高。与标准血清检测效价可达1：16，并且产物无需浓缩、纯化等工艺，节约成本，流程简单。

(4)本发明中VP2蛋白安全性好，采用无血清培养技术，降低疫苗中来自异种动物的过敏原。

(5)本发明中，疫苗生产采用的杆状病毒-昆虫表达系统是一个非常安全的系统，表达的产物只是病毒的结构蛋白，无任何病毒活性，不会对人体及环境产生任何的影响和危害。

附图说明

图1为实施例1的重组质粒pFastBac 1-VP2双酶切验证结果，M为DL5000 DNAmarker，1为双酶切的pFastBac 1-VP2，2为双酶切的pFastBac 1，3为VP2基因；

图2为琼脂扩散实验结果；

图3为SDS-PAGE实验结果；

图4为Western blotting实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。

实施例一：重组杆状病毒的制备

1、目的基因的筛选与克隆

将鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)(由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应)病毒使用RNA抽提试剂盒提取RNA，使用反转录酶获得cDNA。

通过GenBank查找鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)碱基序列，用Oligo设计GT株VP2基因片段引物。引物序列如下：

VP2—F:CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAA(BamH I)

VP2—R:CCCAAGCTTGAAGCCGAATGCTCCTGCAAT(Hind III)

下划线为酶切位点。

使用pfu酶对所合成序列进行PCR扩增，体系为50μL:10×PCR Buffer 5μL,dNTP(各l0mM)lμL，上、下游引物(l0mM)各lμL，合成DNA lμL，pfu酶lμL，ddH₂O 40μL。PCR反应参数：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30个循环；72℃10min体系为50μL:10×PCRBuffer 5μL,dNTP(各l0mM)lμL，上、下游引物(l0mM)各lμL，合成DNA lμL，pfu酶lμL，ddH₂O40μL。PCR反应参数：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30个循环；72℃10min。

如图2，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在1400bp左右位置有一条单一明亮的条带。使用胶回收试剂盒将其进行回收和测序，比对结果发现与预期完全一致。

2、VP2重组蛋白的构建与表达

如图1，分别将胶回收后的片段和pFastBac 1载体使用BamH I和Hind III双酶切，分别回收、纯化，将酶切后的VP2基因片段和pFastBac 1载体用T4连接酶16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，将感受态细胞涂布于LB(含氨苄青霉素抗性)琼脂板上，在培养箱27℃过夜培养。挑取单菌落摇菌，提质粒进行双酶切验证，将验证成功的质粒测序。测序正确的重组质粒命名为pFastBac 1-VP2。将pFastBac 1-VP2转化到DH10 Bac感受态中，通过蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆，获得的质粒命名为Bacmid-IBDV-VP2。

取无血清悬浮培养的Sf9细胞，细胞密度为2.5×10⁶cells/ml,在125ml摇瓶中悬浮转染，培养体积30ml，转染试剂与质粒Bacmid-IBDV-VP2混匀后，加入Sf9细胞悬液中27℃,100rpm摇床中培养。转染后每24h取样检测细胞活率，当细胞活率降至60％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒。此时P0代重组杆状病毒滴度较低，需对其进行扩增1-2次使其滴度超过10⁸TCID50。

实施例二：禽法氏囊病毒VP2蛋白的表达

用Sf9无血清悬浮培养基将sf9细胞培养至5×10⁶cells/ml,用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×10⁶cells/ml,按0.1％的培养体积接种杆状病毒，每12h取样计数并计算活率，当细胞活率低于20％时离心培养液收集上清即可获得VP2蛋白。如图3，进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白分子量大小，在37KDa处可见特异性条带，而对照组无此条带；如图4，通过Western Blot验证蛋白表达，一抗为抗法氏囊阳性血清(购自中国兽医药品监察所)，二抗为羊抗鸡IgG(购自Merck)，在37KDa处出现特异条带；进行琼脂扩散实验检测抗原效价，效价最高达到1：16。

实施例三：VP2蛋白在生物反应器中的表达

1.细胞的传代及培养：

三角摇瓶中传代及培养：将SF9细胞按0.6×10⁶cells/mL-0.8×10⁶cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于27℃，培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为100rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至5.0×10⁶cells/mL-6×10⁶cells/mL，活率在95％以上时，用于反应器的接种。

2.反应器中的培养

将SF9细胞按0.6×10⁶cells/mL-0.8×10⁶cells/mL的细胞密度接种至生物反应器(Sartorius B Plus)中，培养参数为：

每天取样计数，并计算活率，当细胞长至5.0×10⁶cells/mL-6×10⁶cells/mL，活率在95％以上时，用于病毒的接种。

3.病毒的接种：采用二阶培养法，在反应器中的1000mL细胞中接种重组杆状病毒，按MOI为0.1接种SF9细胞，接毒后搅拌速度调整80rpm吸附培养1h，病毒吸附培养后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为27℃，pH设置为6.10±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变。

4.VP2蛋白的收获：每12h取样计数并计算活率，当细胞活率低于20％时离心培养液收集上清即可获得大量VP2蛋白。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> VP2—F(人工序列)

<400> 1

cgcggatcca tgacaaacct gcaagatcaa 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> VP2—R(人工序列)

<400> 2

cccaagcttg aagccgaatg ctcctgcaat 30

Claims (10)

1.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后与pFastBac 1载体连接，连接产物转入DH5α感受态中，筛选阳性克隆获得重组质粒pFastBac 1-VP2，将测序正确的pFastBac 1-VP2转入DH10 Bac感受态中获得重组质粒Bacmid-IBDV-VP2；

步骤2：将Bacmid-IBDV-VP2转入SF9细胞，收获重组杆状病毒。

2.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤1中，鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因通过以下方法获取：

鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)使用RNA抽提试剂盒提取RNA，使用反转录酶获得cDNA；

采用引物对cDNA进行PCR扩增得到扩增产物VP2基因，扩增体系为：50μL，其中，10×PCRBuffer 5μL,dNTPlμL，上、下游引物各lμL，cDNAlμL，pfu酶lμL，ddH2O40μL；dNTP中各类碱基的浓度为l0mM；上、下游引物的浓度均为l0mM；

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30个循环；72℃10min；

上下游引物的序列分别为：

VP2—F:CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAA

VP2—R:CCCAAGCTTGAAGCCGAATGCTCCTGCAAT；

使用胶回收试剂盒将VP2基因进行回收。

3.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，VP2基因与pFastBac 1载体连接的方法为：

分别将胶回收后的VP2基因和pFastBac 1载体使用BamH I和Hind I I I双酶切，分别回收、纯化，将酶切后的VP2基因片段和pFastBac 1载体用T4连接酶16℃过夜连接。

4.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：

取无血清悬浮培养的Sf9细胞，在摇瓶中悬浮转染，转染试剂与质粒Bacmid-IBDV-VP2混匀后，加入Sf9细胞悬液中在摇床中培养，当细胞活率降至60％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒，对P0代杆状病毒进行扩增1-2次使其滴度超过10⁸TCID50。

5.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒，其特征在于，采用如权利要求1-4任一所述的方法制备得到。

6.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至5×10⁶-6×10⁶cells/ml，利用权利要求1-4任一所述的重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，表达蛋白可形成病毒样颗粒。

7.根据权利要求6所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒，其特征在于，所述重组杆状病毒的滴度不低于10⁸TCID50。

8.根据权利要求6所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养的参数为：

转速：120rpm；pH值：6.10±0.1；压缩空气通气量15ccm；氧气通气量30ccm；溶氧量50％；温度27℃。

9.根据权利要求6所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，利用重组杆状病毒进行感染的具体方法为：

采用二阶培养法，在反应器中的细胞中接种重组杆状病毒，按MOI为0.1接种SF9细胞，接毒后搅拌速度调整80rpm吸附培养1h，病毒吸附培养后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为27℃，pH设置为6.10±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；每12h取样计数并计算活率，当细胞活率低于20％时离心培养液收集上清即可获得VP2蛋白。

10.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒，其特征在于，采用如权利要求6-9任一所述方法制备得到。

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