CN112625932A - 耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法。本发明利用基因工程的方法，构建过量表达YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g三个基因中的一种或两种以上的解脂耶氏酵母工程菌，使其对木质纤维素水解液中的阿魏酸和香草酸的耐受性增加，缓解木质纤维素水解液中阿魏酸和香草酸对解脂耶氏酵母利用木质纤维素水解液生产微生物油脂产生的负面影响。与带有对照质粒的对照菌株yl‑XYL+control相比，本发明的解脂耶氏酵母基因工程菌在含有阿魏酸的培养基和含有香草酸的培养基中的生长情况显著改善。

Description

耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程菌技术领域，涉及一种耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
木质纤维素是地球上最丰富的生物质资源，利用木质纤维素生产生物燃料(如生物柴油)具有重大的经济价值和战略意义。由于其结构的致密性，木质纤维素必须经过预处理后才能水解为可发酵的糖。但在预处理过程中，随着木质纤维素的降解会释放大量的抑制物，主要包括弱酸类、呋喃类化合物和酚类化合物。弱酸类抑制物(如甲酸、乙酸等)进入细胞后会引起细胞内pH变化，酵母等菌株会消耗过量ATP维持细胞内酸碱平衡，影响菌株生长和油脂积累；呋喃类化合物(如糠醛、羟甲基糠醛等)会影响菌株的氧化还原平衡并抑制糖酵解途径中相关酶的活性，同时延长了菌株生长的延滞期；酚类化合物(如丁香酸、阿魏酸等)会影响细胞膜的完整性和渗透性，甚至导致细胞膜的破裂，此外，酚类化合物产生的活性氧(reactive oxygen species，如过氧化氢(H2O2)、超氧化物(O2-)和超羟基(OH-)等)会与蛋白质相互作用并导致其失活，破坏菌株代谢活动。抑制物的产生不可避免，虽然可以通过对预处理后的反应液进行脱毒处理来降低对发酵的抑制作用，但脱毒操作不仅会增加工业生产成本，也可能造成可发酵糖的损失。研究菌株对抑制物的响应机制有助于木质纤维素生物柴油的实际生产应用，也为通过基因工程构建鲁棒性更强的整合菌株提供理论依据。
解脂耶氏酵母是研究最多的非常规酵母之一，已经被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)认定为食品安全性酵母。它广泛分布于富含脂质和蛋白质的环境中，并且具有很强的分解疏水化合物的能力。解脂耶氏酵母作为工程菌株已经有60多年的历史，可以用来生产单细胞蛋白、TAGs、脂肪酸衍生物、有机酸和类胡萝卜素等产品。野生型解脂耶氏酵母可以积累超过自身干重20％的油脂，最近解脂耶氏酵母通过基因工程改造已经可以积累自身细胞干重90％的油脂，因此，解脂耶氏酵母是一种极佳的生物油脂转化细胞底盘。
目前，酵母对木质纤维素水解液中抑制物的耐受研究主要集中在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母耐受抑制物的机制主要分为三类：第一类是细胞对抑制物的直接响应，包括1)多药转运蛋白去除胞内抑制物和2)胞内相关酶催化抑制物降解；第二类是为了消除因接触抑制物而造成的损伤所诱导的间接机制，抑制物会损伤菌株的细胞膜或细胞壁(3)，也会抑制某些蛋白的功能(4)，所以需要细胞增加相关保护代谢物的合成(5)来修复损伤；第三类为其他机制，如6)辅因子再生以协助抑制物的降解，辅因子再生包括通过7)磷酸戊糖途径进行辅助因子再生和8)用于抵消由抑制物引起的活性氧自由基(ROS)积累的辅助因子再生。但是解脂耶氏酵母对抑制物的耐受机制研究较少，阻碍了对酵母细胞抑制物压力响应机制的深入了解和木质纤维素生物柴油的进一步发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法。
本发明所述的耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌，为过量表达YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g中的一种或两种以上的解脂耶氏酵母工程菌。
本发明所述的过量表达基因YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g均来源于解脂耶氏酵母Y.lipolyticaW29基因组，YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g基因序列的GeneID分别为2912710、2906929和2907989。
发明人通过对比分别经过阿魏酸、香草酸适应性驯化得到的驯化菌株与起始菌株的转录差异，意外发现YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g基因在阿魏酸驯化菌株与香草酸驯化菌株均出现过表达，说明上述三个基因均能提高解脂耶氏酵母对阿魏酸与香草酸的耐受性，因此上述三个基因中任意一种或者两种以上在解脂耶氏酵母中的过表达，均能实现提高解脂耶氏酵母对阿魏酸与香草酸的耐受性的目的。
本发明所述的耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法如下：首先构建含YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g基因中的一种或两种以上的基因表达框，将构建的基因表达框以多拷贝质粒的形式导入解脂耶氏酵母或者直接整合到解脂耶氏酵母基因组，实现目的基因的过量表达，从而提高其对木质纤维素水解液中抑制物的耐受。
本发明所述的多拷贝质粒载体不做特别限定，只要能实现目标蛋白的过量表达的附加型载体或整合表达载体均可。在本发明具体实施方式中，采用的多拷贝质粒载体为pMCS-CEN1。
所述的多拷贝质粒载体还可以导入在解脂耶氏酵母中具有较强活性的启动子。在本发明的具体实施方式中，采用的启动子为强启动子pTEFin，为翻译延长因子(Translation elongation factor-1α)启动子TEF。对于本领域技术人员而言，启动子还可换用其他在解脂耶氏酵母中具有较强活性的启动子如G3P(Glycerol-3-phosphatedehydrogenase)、MTP(Bidirectional:metalothioneins 1and 2)、ICL1(Isocitratelyase)、hp4d(Hybrid promoter derived from pXPR2)等。
本发明所述的解脂耶氏酵母为本领域常规使用的解脂耶氏酵母菌株，例如解脂耶氏酵母菌Y.lipolyticaXYL+，解脂耶氏酵母菌po1f、解脂耶氏酵母菌po1d和解脂耶氏酵母菌W29等。在本发明的具体实施方式中，采用的解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母菌Y.lipolyticaXYL+。
本发明在耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌构建中，为将目标基因在解脂耶氏酵母中过量表达，将含目的基因YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g中的一种或两种以上的表达框通过SgsI和MssI酶切位点与过量表达载体pMCS-CEN1连接，过量表达载体以SUC基因作为筛选标记。
本发明利用基因工程的方法，构建过量表达YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g三个基因中的一种或两种以上的解脂耶氏酵母工程菌，使其对木质纤维素水解液中的阿魏酸和香草酸的耐受性增加，缓解木质纤维素水解液中阿魏酸和香草酸对解脂耶氏酵母利用木质纤维素水解液生产微生物油脂产生的负面影响。与带有对照质粒的对照菌株yl-XYL+control相比，本发明的解脂耶氏酵母基因工程菌在含有阿魏酸的培养基和含有香草酸的培养基中的生长情况显著改善。
附表与附图说明
表1为构建过量表达质粒载体所需的引物。
图1为重组菌株yl-XYL+E25201g与对照菌株yl-XYL+control在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况图。
图2为重组菌株yl-XYL+B18854g与对照菌株yl-XYL+control在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况图。
图3为重组菌株yl-XYL+F16731g与对照菌株yl-XYL+control在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的生物材料和培养基等试验材料，如无特殊说明，均由商业途径购买或者常规方法(《分子克隆实验指南》(J.Sambrook,et al.第二版，1996))制备获得，其中，试验菌株解脂耶氏酵母Y.lipolyticaXYL+，载体pMCS-CEN1，E.coli TOP10为本实验室保存，也可由商业途径购买。
下述实施例中用到的培养基配方如下：
LB选择培养基：Amp 100mg/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，固体培养基需额外添加20g/L的琼脂粉。
YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L。
YNBS选择培养基：YNB 5.4g/L，NH4Cl1.7g/L，蔗糖20g/L，固体培养基需额外添加20g/L的琼脂粉。
SC-S发酵培养基：SC Dropout Medium 7.9g/L，蔗糖20g/L。
所有培养基均需经过121℃，20min灭菌处理。
表1构建过量表达质粒载体所需的引物
Figure BDA0002898333350000041
实施例1：pMCS-CEN1-E25201g过表达菌株的构建
根据目的基因YALI0_E25201g(GeneID：2912710)的基因序列设计引物，引物见表1。以Y.lipolyticaXYL+基因组为模板扩增目的基因YALI0_E25201g。使用的PCR体系为EasyTaq DNA Polymerase，PCR程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1-4min(时间由基因长度决定)，72℃10min。PCR产物经胶回收纯化后，用SgsI和MssI酶切后与经过同样处理的pMCS-CEN1载体进行连接。连接产物转化进E.coli TOP10感受态细胞，在LB选择培养基上过夜培养，挑取单菌落，小量提取质粒酶切验证并进行DNA测序，得到pMCS-CEN1-E25201g。
采用电转化法将pMCS-CEN1-E25201g质粒分别导入至Y.lipolytica XYL+感受态细胞(pMCS-CEN1也导入Y.lipolytica XYL+感受态细胞作为对照菌株)，于YNBS固体筛选培养基上进行筛选。30℃培养2-3天，挑取转化子，将转化子转入YNBS液体培养基，如果正常生长说明转化子为阳性转化子。分别得到名为yl-XYL+E25201g和yl-XYL+control的重组菌株。
取yl-XYL+E25201g和yl-XYL+control各100ul，接种至50ml YNBS液体培养基中，30℃培养24h后得到种子液，将种子液按初始OD600为0.5接种至分别含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中，30℃、250rpm培养，定时取样测菌体吸光度OD600。yl-XYL+E25201g重组菌株在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况明显优于对照菌株yl-XYL+control。
由图1(a)可以看出，在含有0.5g/L阿魏酸的条件下，重组菌株yl-XYL+E25201g在72h时菌液浓度OD600达到最大8.4，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，72h时菌液浓度OD600仅为3.1。由图1(b)可以看出，在含有1g/L香草酸的条件下，重组菌株yl-XYL+E25201g在120h时菌液浓度OD600达到最大7.7，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，120h时菌液浓度OD600仅为1.9。
实施例2：pMCS-CEN1-B18854g过量表达菌株的构建
根据目的基因YALI0_B18854g(GeneID：2906929)的基因序列设计引物，引物见表1。以Y.lipolytica XYL+基因组为模板分别扩增目的基因YALI0_B18854g。使用的PCR体系为EasyTaq DNA Polymerase，PCR程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1-4min(时间由基因长度决定)，72℃10min。PCR产物经胶回收纯化后，用SgsI和MssI酶切后与经过同样处理的pMCS-CEN1载体进行连接。连接产物转化进E.coli TOP10感受态细胞，在LB选择培养基上过夜培养，挑取单菌落，小量提取质粒酶切验证并进行DNA测序，得到pMCS-CEN1-B18854g。
采用电转化法将pMCS-CEN1-B18854g质粒导入至Y.lipolyticaXYL+感受态细胞(pMCS-CEN1也导入Y.lipolyticaXYL+感受态细胞作为对照菌株)，于YNBS固体筛选培养基上进行筛选。30℃培养2-3天，挑取转化子，将转化子转入YNBS液体培养基，如果正常生长说明转化子为阳性转化子。分别得到名为yl-XYL+B18854g和yl-XYL+control的重组菌株。
取yl-XYL+B18854g和yl-XYL+control各100ul，接种至50ml YNBS液体培养基中，30℃培养24h后得到种子液，将种子液按初始OD600为0.5接种至分别含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中，30℃、250rpm培养，定时取样测菌体吸光度OD600。yl-XYL+B18854g重组菌株在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况明显优于对照菌株yl-XYL+control。
由图2(a)可以看出，在含有0.5g/L阿魏酸的条件下，重组菌株yl-XYL+B18854g在48h时菌液浓度OD600达到最大4.0，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，48h时菌液浓度OD600仅为2.0。由图2(b)可以看出，在含有1g/L香草酸的条件下，重组菌株yl-XYL+B18854g在120h时菌液浓度OD600达到5.1，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，120h时菌液浓度OD600仅为1.9。
实施例3：pMCS-CEN1-F16731g过量表达菌株的构建
根据目的基因YALI0_F16731g(GeneID：2907989)的基因序列设计引物，引物见表1。以Y.lipolytica XYL+基因组为模板分别扩增目的基因YALI0_F16731g。使用的PCR体系为EasyTaq DNA Polymerase，PCR程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1-4min(时间由基因长度决定)，72℃10min。PCR产物经胶回收纯化后，用SgsI和MssI酶切后与经过同样处理的pMCS-CEN1载体进行连接。连接产物转化进E.coli TOP10感受态细胞，在LB选择培养基上过夜培养，挑取单菌落，小量提取质粒酶切验证并进行DNA测序，得到pMCS-CEN1-F16731g。
采用电转化法将pMCS-CEN1-F16731g三个质粒分别导入至Y.lipolytica XYL+感受态细胞(pMCS-CEN1也导入Y.lipolytica XYL+感受态细胞作为对照菌株)，于YNBS固体筛选培养基上进行筛选。30℃培养2-3天，挑取转化子，将转化子转入YNBS液体培养基，如果正常生长说明转化子为阳性转化子。分别得到名为yl-XYL+F16731g和yl-XYL+control的重组菌株。
取yl-XYL+F16731g和yl-XYL+control各100ul，接种至50ml YNBS液体培养基中，30℃培养24h后得到种子液，将种子液按初始OD600为0.5接种至分别含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中，30℃、250rpm培养，定时取样测菌体吸光度OD600。yl-XYL+F16731g重组菌株在含有0.5g/L阿魏酸和1g/L香草酸的SC-S培养基中的生长情况明显优于对照菌株yl-XYL+control。
由图3(a)可以看出，在含有0.5g/L阿魏酸的条件下，重组菌株yl-XYL+F16731g在72h时菌液浓度OD600达到最大6.8，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，72h时菌液浓度OD600仅为3.1。由图3(b)可以看出，在含有1g/L香草酸的条件下，重组菌株yl-XYL+F16731g在120h时菌液浓度OD600达到最大5.8，而对照菌株yl-XYL+control的生长被严重抑制，120h时菌液浓度OD600仅为1.9。
综上所述，分别过量表达YALI0_E25201g(GeneID：2912710)、YALI0_B18854g(GeneID：2906929)和YALI0_F16731g(GeneID：2907989)均可以显著提高解脂耶氏酵母Y.lipolyticaXYL+对木质纤维素水解液中抑制物(阿魏酸和香草酸)的耐受。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtataagaat cattcaaagg cgcgccatgt cttcttcaat actaacacag actgg 55
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 48
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaattacat gaggctagcg tttaaaccta aaaatgcaaa ggcagctg 48

Claims (8)

1.耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌，其特征在于，为过量表达YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g中的一种或两种以上的解脂耶氏酵母工程菌。
2.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：首先构建含YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g基因中的一种或两种以上的基因表达框，将构建的基因表达框以多拷贝质粒的形式导入解脂耶氏酵母或者直接整合到解脂耶氏酵母基因组。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，多拷贝质粒载体为附加型载体或整合表达载体。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，多拷贝质粒载体为pMCS-CEN1。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，多拷贝质粒载体含有在解脂耶氏酵母中具有较强活性的启动子。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的启动子为强启动子pTEFin、pG3Pin、pMTPin、pICL1in或php4din。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母菌Y.lipolyticaXYL+、解脂耶氏酵母菌po1f、解脂耶氏酵母菌po1d或解脂耶氏酵母菌W29。
8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将构建的基因表达框以多拷贝质粒的形式导入解脂耶氏酵母的具体方法为：将含目的基因YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g中的一种或两种以上的表达框通过SgsI和MssI酶切位点与过量表达载体pMCS-CEN1连接，过量表达载体以SUC基因作为筛选标记。
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CN105814211A (zh) * 2013-12-11 2016-07-27 耐思特公司 自木质纤维素材料产生单细胞油的方法
CN111154664A (zh) * 2020-02-07 2020-05-15 河北民族师范学院 一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株及其应用

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