CN105814211A - 自木质纤维素材料产生单细胞油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生微生物脂质的方法。尤其是，本发明涉及使用可自木质纤维素材料获得的抑制物抑制发酵肉汤中不需要的微生物的增殖来产生微生物脂质的方法。本发明的方法因此减小系统和培养中混杂微生物建立的风险，由此可获得更高产率的微生物脂质。

Description

自木质纤维素材料产生单细胞油的方法
【技术领域】
本发明涉及产生微生物脂质的方法。尤其是，本发明涉及使用可自木质纤维素材料获得的抑制物抑制发酵肉汤中不需要的微生物的增殖来产生微生物脂质的方法。
【背景技术】
木质纤维素是地球上最丰富的生物聚合体。木质纤维素是木质植物和非-木质植物诸如草的主要结构组分。木质纤维素生物质指称由纤维素，半纤维素和木质素组成的植物生物质。大量的木质纤维素残留物通过林业，木材和果肉和纸工业和农业实践(秸秆,秸杆,蔗渣,谷壳)和许多农业产业产生。城市废弃物也含有可被认为是木质纤维素残留物的部分，诸如纸或纸板废弃物，花园废弃物或来自建筑业的废木料。由于高丰度和低价格木质纤维素残留物是用于产生生物燃料的优选的材料。此外，生物质产生性的专用的木质或草本能源作物得到了作为生物燃料使用的兴趣。
已广泛地研究自木质纤维素材料由微生物发酵产生生物燃料，尤其乙醇。为生物燃料或生物燃料原料的微生物学产生而利用木质纤维素的最大挑战在于木质纤维素材料的复杂性及其对生物降解的抗性。在木质纤维素中，纤维素(20～50％的种植干重)纤维共价嵌入形成对于生物降解非常抗性结构的半纤维素(20～40％)，果胶(2～20％)和木质素(10～20％)的基础基质。而且，半纤维素的糖残基依赖于生物质而含有己糖(例如,葡萄糖,甘露糖和半乳糖)及戊糖(例如,阿拉伯糖和木糖)的变化的混合物。
将高生产性的木质纤维素材料预处理为可被微-生物利用的糖代表最高挑战之一。在将糖聚合物水解为可被期望的微生物利用的糖单体需要的酶的成本中需要显著成本降低。而且，自木质纤维素材料的生物燃料的经济上可行的产生需要此复合材料的全部主要碳水化合物成分有效转变为生物燃料。
一般在与由在实际生物燃料产生过程之外购买的及产生的商业酶的生物燃料产生过程分离的步骤中实施木质纤维素材料的酶促水解。
特定微生物可自有机分子，诸如源于木质纤维素的糖产生脂质。特定微生物，一般酵母，真菌或细菌，可将木质纤维素材料中的C6和C5糖二者有效转变为油。由异养微生物产生的油常常被称为单细胞油或微生物油。使用异养微生物的单细胞油产生过程包括在通气的生物反应器中培育微生物，允许细胞蓄积脂质，收获富含脂质的细胞及自细胞回收油。可将基于微生物的脂质(即单细胞油)用作产生生物燃料诸如生物柴油，可再生的柴油或生物喷气燃料的原材料。
也已在单细胞油的产生中利用木质纤维素水解产物。木质纤维素水解已一般通过在供给到生物过程之前将木质纤维素材料预处理为单体糖而进行。
专利公开US2009217569描述了自各种木质纤维素和其他材料水解产物，诸如秸秆，木料，果肉和纸工业残留物，再循环的纤维，城市废弃物，藻生物质产生单细胞油。生产生物燃料包括用水，酸或碱处理源材料，及使滤出液或沉淀物与脂质-产生微生物接触。专利公开US2009064567描述了自用于由Stramenopiles产生生物柴油及喷气生物燃料的纤维素材料水解产物的单细胞油产生。US20090011480描述由异养地生长的藻和真菌，自解聚合的木质纤维素材料，诸如秸秆，木料，纸浆废液，柳枝稷的单细胞油产生。CN101148630描述从由蒸汽爆炸获得的，由细菌或真菌获得的小麦，玉米或秸秆半纤维素水解产物产生单细胞油。
而且，现有技术已描述自木质纤维素中的多聚糖，诸如木聚糖(由Fall等人(1984))或纤维素(由Lin等人(2010))直接产生脂质。
WO2010042842描述了由能降解木质纤维素中的多聚糖的微生物和至少一种藻物种的混合培养，自木质纤维素水解产物产生单细胞油。培养物在连续耗氧和厌氧培养中生长，其中脂肪酸从糖及自厌氧发酵产物产生。
WO2010006228描述了生物燃料自木质纤维素的连续产生。在第1阶段，用能自木质纤维素水解产物中的多聚糖产生醇的生物厌氧发酵，在第2阶段，耗费的培养基，可能含有至少一种发酵产物，用藻处理，以便蓄积单-细胞油。
由于在木质纤维素水解产物中的糖上，非-脂质产生微生物与油产生性微生物(产油性微生物)竞争，发酵肉汤中混杂性非-脂质产生微生物的存在可影响油产率和产率，由此使该过程欠可行。
因此，有对于在单细胞油产生过程中以产油性微生物的增殖优于非-产油性微生物的增殖的方式控制微-生物的培养的方法的需求。
【发明概述】
单细胞油产生一般通过在耗氧条件下，在适合的底物诸如由木质纤维素分级分离获得的木质纤维素糖，诸如半纤维素糖的存在下培育脂质产生微生物(产油性微生物)来实施。通常的耗氧发酵罐一般具有相比厌氧发酵罐更低得多的体积和容量，及在运行上更昂贵。由此，依赖于在耗氧条件下培养的单细胞油产生对于有效培养的需求更高。培养被不产生脂质或仅以低量产生脂质的微生物混杂可显著地降低单细胞油的产率(yield)和产率(productivity)。因此应避免培养期间混杂微生物的存在。
本发明因此旨在提供耗竭或减少培养中混杂性非-脂质产生微生物的量，由此使有利于产油性微生物的增殖的单细胞油产生方法。
木质纤维素分级分离一般产生含有高浓度的抑制物化合物，一般酚化合物的半纤维素级分。在单-细胞-油的生产中，一般需要高度浓缩的糖溶液(糖浆)。由此，半纤维素水解产物需要被浓缩。当液体通过蒸发浓缩时，水解产物中的非-挥发性抑制物被浓缩。
降解产物在木质纤维素分级分离的过程中产生。一些这些降解产物发挥微生物抑制物的作用(诸如酚化合物,有机酸,糠醛和羟甲基糠醛)。发明人发现，由根据产油性微生物对所述抑制物的耐受性调节这些微生物抑制物的浓度，可抑制混杂性非-脂质产生微生物的增殖。
因此，本发明的第1方面涉及产生脂质的方法，包含以下步骤
(i)提供包含木质纤维素水解产物的培养基，
(ii)通过用第1微生物接种(i)的培养基来提供发酵肉汤，其中所述第1微生物是产油性微生物，
(iii)温育接种所述第1微生物的所述培养基而使脂质蓄积，
其中所述发酵肉汤包含至少一种微生物生长抑制物，且其中所述第1微生物耐受所述微生物生长抑制物，其中所述温育在耗氧条件下进行。
本发明的第2方面涉及发酵肉汤，其包含木质纤维素水解产物，至少一种微生物生长抑制物和产油性微生物，其中所述产油性微生物耐受所述微生物生长抑制物。
第3方面涉及本发明的发酵肉汤在产生脂质的方法中的用途。
第4方面涉及包含至少一种微生物生长抑制物的组合物在产生脂质的方法中的用途，其中所述脂质在产油性微生物中产生及蓄积，且其中所述产油性微生物耐受所述至少一种微生物生长抑制物。
【附图说明】
图1显示在小麦秸秆纤维素和半纤维素水解产物上用米曲霉(Aspergillusoryzae)的补给分批发酵的性能(微生物生物质中的细胞干重(CDW)(g/l)，脂肪酸(FA)浓度(g/l)，脂肪游离的细胞干重(CDW)(g/l)和脂肪酸(FA)含量(％))。
图2显示来自小麦秸秆的自动水解的固体残留物的产率。
图3显示自小麦秸秆的自动水解获得的液体级分中总可溶性糖(g/l,左y-轴)和潜在微生物抑制物物质；糠醛，羟甲基糠醛(HMF)和可溶性酚类(g/l,右y-轴)的浓度，以10％一致性(g秸秆固体干物质/g总和)。
【发明详述】
在描述本发明的实施方式时，为了清楚起见，会救助于特定术语。但是，本发明不旨在限于如此选择的特定术语，且需知，各特定术语包括以类似方式操作而实现类似目的的全部技术相当体。
本发明面对利用(木质)纤维素材料作为原材料来产生单细胞油。可将产生的单细胞油用作产生生物燃料，诸如生物柴油，可再生的柴油或喷气燃料的原材料。
【微生物生长抑制物】
在本发明的情景中，术语"微生物抑制物"或"抑制性化合物"指称可抑制微生物的生长的源于木质纤维素材料的化合物，即木质纤维素降解产物。该化合物一般在木质纤维素分级分离中产生，其中产生木质纤维素糖。该化合物包括，但不限于酚化合物(诸如4-羟基苯甲酸,p-香豆酸酸,香兰酸,香兰素,苯酚,愈创木酚,氢醌,儿茶酚,阿魏酸,丁香醛,丁香酸)，糠醛，羟甲基糠醛(HMF)，有机酸诸如(乙酸,甲酸和乙酰丙酸)和提取物(己酸,辛酸,棕榈酸和壬酸)。这些化合物的生长抑制性效应可依赖于微生物及培养条件。当在混合物中发生抑制性化合物时，它们可具有累积效应，即以相比在无其他抑制性化合物的存在下更低浓度抑制微生物生长。
在本发明的情景中，来自木质纤维素生物质的碳水化合物不落入微生物抑制物的定义之内。
优化的发酵抑制物水平"术语指称允许由产油性微生物生长和脂质产生，但抑制混杂性非-产油性微生物的生长的抑制性化合物的浓度。
【芳族化合物，酚化合物】
在本文中芳族烃指称具有由碳原子之间共价连接形成的环结构，在环结构中含有交替缀合的双和单键的化合物。芳族烃也可指称具有由碳原子和非-碳原子之间共价连接形成的环结构，在环结构中含有交替缀合的双和单键的化合物。
在本文中，术语"酚化合物"指称包含至少一个含有至少一个与芳族烃基直接键合的羟基(-OH)的芳族烃基的化合物。在本申请中，酚化合物浓度已根据Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)，用比色分析测量。该化合物包括，但不限于酚化合物，诸如p-香豆酸酰醇，松柏基醇，芥子基醇，4-羟基苯乙酮，香草乙酮，乙酰丁香酮，4-羟基苯甲醛，香兰素，丁香醛，4-羟基苯甲酸，香兰酸，丁香酸，p-香豆酸酸，阿魏酸，芥子酸，苯酚，愈创木酚，丁香醇，氢醌，儿茶酚，2-甲基苯酚，3-甲基苯酚，4-甲基苯酚，2,6-二甲酚，2,4-二甲酚，4-乙基苯酚，3,4-二羟基苯甲醛，4-甲基愈创木酚，4-乙烯基苯酚，4-乙基-2-甲基苯酚，4-烯丙基苯酚，3-甲氧基儿茶酚，2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚，香兰基醇，高香兰素，高香兰酸，1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)乙醇，1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙二烯，香兰酸甲基酯，4-乙基-2,6-二甲氧基苯酚，4-甲基儿茶酚，4-乙基愈创木酚，4-丙基苯酚，4-乙烯基愈创木酚，4-羟基苄基醇，3-羟基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮，3,5-二羟基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮，4-丙烯基苯酚，2,6-二甲氧基-4-丙基苯酚，二氢松柏基醇，高丁香醛，3,5-二甲氧基-4-羟基苄基醇，2,6-二甲氧基-4-丙烯基苯酚，1-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)乙醇，松柏基醛，丁香基丙酮，丁香酸甲基酯，丙酸丁香酮，丁香基乙烯基酮，二氢芥子基醇，芥子醛，2,6-二甲氧基苯酚，1-(4-羟苯基)乙醇，丁香酚，5-乙基焦没食子酚，4-丙基愈创木酚，1,4-二羟基-3-茴香醚，异丁香酚，4-羟基苯甲酸甲基酯，愈创木基丙酮，2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚，丙酸香兰酮，愈创木基乙烯基酮，4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚及包括全部它们的可能的异构体，寡聚体和/或多聚木质素，单宁，多酚，酚化合物的混合物，包含非-酚化合物和酚化合物的共价连接的化合物。
术语"酚化合物的浓度"是指如用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)测量的水溶液中化合物的浓度(一般表达为g/l)。
【木质纤维素材料】
术语"木质纤维素生物质"或"木质纤维素材料"意指包括但不限于木质植物或非-木质，草本植物或含有纤维素和/或半纤维素的其他材料：材料可为农业残留物(诸如小麦秸秆,秸秆,谷壳,壳,玉米秸杆,甘蔗蔗渣,甘蔗顶部和叶)，专用的能源作物(诸如柳枝稷,芒属(Miscannthus)，芦竹(Arundodonax)，草芦,柳,凤眼莲,能源蔗,能量高粱,)，木材或残留物(包括锯木厂和果肉和/或造纸厂残留物或级分,诸如半纤维素,耗费的亚硫酸液,废弃物纤维和/或主要污泥)，藓或泥炭，或市造纸废浆。术语木质纤维素材料也包含低木质素材料，材料诸如巨藻生物质。此外，该材料也包含来自工业实践的半纤维素或纤维素级分。术语木质纤维素材料包括任何种纤维素级分。原材料或特定级分，诸如来自不同来源，种植物种或工业过程的原材料的半纤维素和/或纤维素，可混合在一起，及用作根据本公开培育微生物生物质的原材料。一般，木质纤维素中的木质素含量高于5％。木质纤维素生物质也可含有淀粉，例如在全体植物的情况中。
【水解】
在本文中，术语"水解"指称通过向非-单体碳水化合物与糖寡聚体和单体或羧酸的糖苷酸连接或酯连接添加水来解聚。
【水解产物】
术语"水解产物"或"水解的物质"在本文指称经历了水解的物质。
【木质纤维素水解产物】
术语"木质纤维素水解产物"在本文指称木质纤维素或木质纤维素材料的水解产物，其包含纤维素和/或半纤维素，寡糖，单-和/或二糖，乙酸，甲酸，其他有机酸，糠醛，羟甲基糠醛，乙酰丙酸，酚化合物，自木质素，纤维素，半纤维素和/或木质纤维素的其他组分形成的其他水解和/或降解产物，来源于蛋白的氮化合物，金属和/或木质纤维素的非-水解的或部分水解的片段。
【水热处理】
在本发明的情景中，术语"水热处理"指称于超过50℃的温度热处理水性木质纤维素悬浮液。水热处理可在加压的反应器中在压力下实施，或在非-加压的反应器中在大气压力下实施。在加压的反应器中的压力可当加热达沸点时由从水获得的蒸汽产生，或由添加的加压的气相产生。水热处理可在催化剂的存在下或在催化剂的缺失下实施。当使木质纤维素生物质的水性悬浮液于超过120℃的温度在压力下经历水热处理时，无需添加的催化剂而在催化剂的缺失下水热处理(也被称为"自动水解"或"AH")而至木质纤维素生物质的水解。
"自动水解的秸秆"在本文指称在自动水解之后获得的固体级分。可使自动水解的秸秆经历洗涤。
【蒸汽爆炸】
在本发明的情景中，术语"蒸汽爆炸"指称这样的处理，其中材料由高压蒸汽(在110℃和250℃之间,一般140～230℃的温度)，在压力下，有或无化学品(诸如酸)添加而加热，和使该物质在该温度保持特定时间，之后释放压力而导致物质的爆炸性减压。在此情景中，将蒸汽爆炸应用于木质纤维素材料，及其一般导致木质纤维素纤维刚性结构的破裂，即纤维素纤维束的去纤维化。
【脱木质化处理】
"脱木质化处理"在本文指称自木质纤维素生物质去除非-碳水化合物物质诸如木质素的处理。脱木质化处理也指称自木质纤维素生物质去除非-碳水化合物和碳水化合物物质的混合物的处理。
【碱性脱木质化剂】
在本发明的情景中，术语"碱性脱木质化剂"指称当添加到水中时，给溶液低于纯水的氢离子活性的氢离子活性，即，高于7.0的pH的化合物或化合物的混合物。碱性脱木质化剂可选自下列化合物，包含但不限于，氢氧化物，诸如LiOH(氢氧化锂)，NaOH(氢氧化钠)，KOH(氢氧化钾)，Ca(OH)2(氢氧化钙)，NH4OH(氢氧化铵)，或可在水中形成氢氧根离子的化合物，诸如液体或气体状态的NH3(氨)，碳酸盐，诸如HCO3-(碳酸氢根离子)，Li2CO3(碳酸锂)，Na2CO3(碳酸钠)，K2CO3(碳酸钾)，硫化物，诸如Na2S(硫化钠)，及对应水合物。
【酶促水解】
在本发明的情景中，术语"酶促水解"指称包含纤维素和/或半纤维素，寡糖的木质纤维素材料的酶处理，其中酶辅助纤维素和/或半纤维素，寡糖水解而获得单-和/或二糖。一般，通过在水或缓冲剂的存在下使木质纤维素材料经历酶的混合物来进行木质纤维素材料的酶促水解处理。酶的混合物一般由下列组成，但不限于1,4-3-葡聚糖酶(内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,或内切纤维素酶和外切纤维素酶)，1,4-3-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)和半纤维素-降解酶(半纤维素酶,木聚糖酶,阿拉伯糖酶等)。
【木质纤维素生物质的级分】
"木质纤维素生物质的级分"在本文指称源于木质纤维素生物质和由此可无木质素的任何级分。
【微生物脂质或脂质】
在本发明的情景中，"微生物脂质"，"脂质"或"细胞内脂质"指称脂肪物质，其分子通常作为一部分含有，脂肪族烃链，其在非极性的有机溶剂中溶解，但是在水中溶解性差。脂质是在活细胞中必要的大分子组。脂质是，例如，脂肪，油，蜡，蜡酯，甾醇，类萜，类异戊二烯，类胡萝卜素，聚羟基脂肪酸酯，核酸，脂肪酸，脂肪醇，脂肪醛，脂肪酸酯，磷脂，糖脂，鞘脂和酰基甘油，诸如三酰基甘油，二酰基甘油或单酰基甘油。
优选的脂质在本发明中是脂肪，油，蜡，酰基甘油和脂肪酸和它们的衍生物，尤其是三酰基甘油和蜡酯。在本发明的情景中，脂质由微生物合成及在微生物中蓄积(细胞内脂质)。
结合本发明，单细胞油被用作脂质和脂肪的同义词。
术语"酰基甘油"指称甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油作为脂肪和脂肪油天然地存在。酰基甘油的例包括三酰基甘油(TAG,甘油三酯)，二酰基甘油(甘油二酯)和单酰基甘油(甘油单酯)。
【糖】
在本发明的情景中，术语"糖"在本文指称寡聚体，二聚和单体碳水化合物。特别是，在本申请中，术语糖指称源于木质纤维素材料的水溶性寡聚体，二聚和单体碳水化合物。术语"多聚糖"是指处于多聚形式及一般在水中不可溶的碳水化合物。
【糖产率】
在本发明的情景中，术语"糖产率"在本文指称自特定材料的寡聚体，二聚和单体碳水化合物的产率。特别是，在本申请中，术语糖产率指称源于木质纤维素材料的水溶性寡聚体，二聚和单体碳水化合物的产率。
【单细胞油产生过程】
"单细胞油产生过程"在本文指称这样的过程，其包括如下步骤：形成或允许脂质合成微生物生长，及允许由此获得的生物质量产生和/或存储(蓄积)脂质，自液相回收细胞，及自细胞提取或回收脂质。在特定情况中，单细胞油也可为细胞外的，诸如在培养期间或之后，在培养基中自细胞排泄或释放。
【耗氧培养】
术语"耗氧培养"或"耗氧发酵"指称这样的培养，其中微生物利用氧作为能量产生用的末端电子受体(即微生物使用耗氧呼吸)。一般，在生物反应器中，通过添加氧或含有氧的气体混合物(一般空气)，即生物反应器通气来实施耗氧培养。当微生物在培养中使用耗氧呼吸时，其可被称为"在耗氧条件下培养"。一般，此在通气的生物反应器中发生。
【无菌操作】
术语"无菌操作"在本文指称这样的操作，其中微生物培养系统(例如发酵罐)已在培养之前灭菌，且其中操作以例如通过使用不源于木质纤维素预处理的抗微生物剂防止培养系统混杂(即非-期望的微生物生长)的方式实施。"非-无菌操作"指称相对于"无菌操作"实施的操作。
【产油性微生物或油产生性微生物】
在本发明中使用的产油性微生物(也称为油产生性生物)选自细菌，蓝细菌，真菌，诸如酵母和丝状真菌，古细菌或微藻。微生物可容易蓄积脂质，或已遗传修饰而蓄积脂质或改善脂质的蓄积。
优选使用能利用C6和C5糖的生物。优选生物是酵母，丝状真菌或细菌。
在本发明的情景中，产油性微生物(产油性微生物)指称当在适合的条件下培育时，能蓄积细胞间脂质，使得脂质占微生物总生物质的至少15％(w/w)的微生物(每细胞干重)。在优选的实施方式中，产油性微生物能蓄积微生物总生物质的至少20％(w/w)(每细胞干重)。
用于本发明的目的的优选的微生物株包括，但不限于，以下所列的物种和属：
根据本发明的一实施方式，第1微生物是能利用源于木质纤维素材料的糖的产油性微生物。优选地，产油性生物能利用木质纤维素水解产物中的C6糖(6碳糖,诸如葡萄糖,甘露糖和半乳糖)和C5糖(诸如木糖和阿拉伯糖)。根据本发明的一实施方式，产油性生物能利用木质纤维素或其级分中的多聚或寡聚体碳水化合物。
优选的(丝状)真菌株来自选自下列的物种：曲霉属(Aspergillus)，诸如米曲霉(Aspergillusoryzae)，被孢霉属(Mortierella)，诸如黄褐色被孢霉(Mortierellaisabellina)，毛壳霉属(Chaetomium)，麦角菌属(Claviceps)，枝芽孢属(Cladosporidium)，小克银汉霉属(Cunninghamella)，裸孢壳属(Emericella)，镰孢属(Fusarium)，球囊霉属(Glomus)，毛霉属(Mucor)，假发酵菌属(Pseudozyma)，腐霉属(Pythium)，根霉属(Rhizopus)，诸如稻根霉(Rhizopusoryzae)，银耳属(Tremella)，接霉属(Zygorhynchus)，腐质霉属(Humicola)，枝孢属(Cladosporium)，畸枝霉属(Malbranchea)，伞形霉属(Umbelopsis)，诸如深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)及黑粉菌属(Ustilago)。最优选的真菌物种来自曲霉属(Aspergillus)和/或被孢霉属(Mortierella)。优选的真菌是能有效产生脂质的那些真菌。
优选的酵母株是属于来自下列属的物种的那些，地霉属(Geotrichum)，德巴利酵母属(Debaryomyces)，管囊酵母属(Pachysolen)，半乳糖霉属(Galactomyces)，汉逊酵母属(Hansenula)，白冬孢酵母属(Leucosporidium)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，Waltomyces，隐球菌属(Cryptococcus)，诸如弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)，红冬孢属(Rhodosporidium)，诸如圆红冬孢(Rhodosporidiumtoruloides)或河红冬孢(Rhodosporidiumfluviale)，红酵母属(Rhodotorula)，诸如胶红酵母(Rhodotorulaglutinis)，耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，假丝酵母属(Candida)诸如弯曲假丝酵母(Candidacurvata)，油脂酵母属(Lipomyces)诸如斯氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)及丝孢酵母属(Trichosporon)诸如皮肤丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)或芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)。最优选的酵母来自油脂酵母属(Lipomyces)，红冬孢属(Rhodosporidium)和隐球菌属(Cryptococcus)。优选的酵母是能有效产生脂质的那些酵母。
优选的细菌是那些属于物种自红球菌属(Rhodococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)和链霉菌属(Streptomyces)。优选的细菌是能有效产生脂质的那些细菌。
最优选的藻是微藻，诸如微藻物种自属包含，咸胞藻属(Brachiomonas)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，小球藻属(Chlorella)，杜氏藻属(Dunaliella)，菱板藻属(Hantzschia)，微球藻属(Nannochloris)，微拟球藻属(Nannochloropsis)，菱形藻属(Nitzschia)，原囊藻属(Prototheca)，栅藻属(Scenedesmus)，裂殖壶菌属(Schizochytrium)，破囊壶菌属(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。优选的微藻是能异养地生长及有效产生脂质的那些微藻。属于裂殖壶菌属(Schizochytrium)，破囊壶菌属(Thraustochytrium)和隐甲藻属(Crypthecodinium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)的生物有时被称为海洋真菌。
根据本发明的另一实施方式，来自木质纤维素生物质的碳水化合物主要处于单体形式，和不能利用寡聚体或多聚碳水化合物的生物用于单细胞油产生。该油产生性生物选自：细菌，蓝细菌，真菌诸如酵母和丝状真菌，古细菌或微藻。微生物可容易蓄积脂质或已遗传修饰而蓄积脂质或改善脂质蓄积。
【含有脂质的单-细胞团】
"含有脂质的单-细胞团"表示具有微生物生物质的干物质的至少优选至少10％，优选至少15％(w/w)或更多脂质含量的单-细胞团和细胞菌丝体。
【脂质回收】
"油回收"或"脂质回收"或"自产油性微生物回收脂质"指称这样的过程，其中由机械，化学，热力学或自动催化性方法或通过这些方法的组合，自微生物细胞回收脂质(细胞内脂质)。或者，"油回收"可指自培养(发酵)肉汤细胞外产生的脂质的回收。
【残留的细胞团】
在本发明的情景中，"残留的细胞团"指称含有为细胞内脂质的回收处理的微生物的固体，半固体或流体物质级分。
【生物燃料】
在本发明的情景中，"生物燃料"指称主要源于生物质或生物废弃物，及不同于化石燃料(源于史前植物和动物的有机保留物)的固体，液体或气体燃料。
根据EUdirective2003/30/EU，"生物柴油"指称自待用作生物燃料的柴油质量的植物油或动物油产生的甲基-酯。更广泛地，生物柴油指称来自柴油质量的植物油或动物油的长链烷基酯，诸如甲基，乙基或丙基-酯。生物柴油也可从微生物脂质产生，其中微生物脂质可来源于细菌，真菌(酵母或丝状真菌)，藻或其他微生物。
【可再生的柴油】
"可再生的柴油"指称由动物，植物或微生物来源的脂质，或它们的混合物的氢处理产生的燃料，其中微生物脂质可来源于细菌，真菌(酵母或丝状真菌)，藻或另一微生物。可再生的柴油也可通过气化和Fischer-Tropsch合成产生自源于生物质的蜡。任选地，除了氢处理之外，可实施异构化或其他处理步骤。可再生的柴油工艺也可用于产生喷气燃料和/或汽油。可再生的柴油的产生已描述于专利公开EP1396531，EP1398364，EP1741767和EP1741768。
生物柴油或可再生的柴油可与化石燃料混合。可将适合的添加剂，诸如防腐剂和抗氧化剂加入燃料产品。
【润滑剂】
"润滑剂"指称当作为表面包被物应用于运动部分时减少摩擦的物质，诸如脂膏，脂质或油。润滑剂的2个其他主要功能是去热及溶解杂质。润滑剂的应用包括，但不限于在内燃机中作为机油，在燃料中的添加剂，在油-驱动的装置诸如泵和液压设备中，或在不同类型的轴承中使用。一般润滑剂含有75～100％基础油，和其余是添加剂。适合的添加剂是例如去污剂，存储稳定剂，抗氧化剂，腐蚀抑制物，去霾剂，破乳剂，消泡剂，共溶剂和润滑性添加剂(见例如US7,691,792)。用于润滑剂的基础油可来源于矿物油，植物油，动物油或自细菌，真菌(酵母或丝状真菌)，藻或其他微生物。基础油也可来源于通过气化和Fischer-Tropsch合成源于生物质的蜡。粘度指标用于表征基础油。一般优选高粘度指标。
可将根据本发明中描述的方法产生的脂质用作产生生物柴油，可再生的柴油，喷气燃料或汽油的原料。生物柴油由脂肪酸甲基酯组成，及一般通过转酯产生。在转酯中，将酰基甘油转化为长链脂肪酸烷基(甲基,乙基或丙基)酯。可再生的柴油指称由脂质的氢处理(氢脱氧,氢化或氢处理)产生的燃料。在氢处理中，将酰基甘油转化为对应烷烃(石蜡)。烷烃(石蜡)可还通过异构化或由其他替代性的过程修饰。可再生的柴油过程也可用于产生喷气燃料和/或汽油。此外，可实施脂质的裂化而产生生物燃料。而且，可在特定应用中将脂质直接用作生物燃料。
也可将用所述方法产生的脂质用作润滑剂的基础油(润滑油)或用作产生用于润滑剂的基础油的原材料。
【干物质】
"DM"或"干重"在本文指称干物质，及是当经历自物质基本上去除水的处理(即物质完全干燥)时的物质的质量量度。
【一致性】
"一致性"在本文指称固体干重与悬浮液总重量的比。
【产生微生物脂质的方法】
在本发明的第1方面，提供产生脂质的方法，其包括以下步骤
(i)提供包含木质纤维素水解产物的培养基，
(ii)通过用第1微生物接种(i)的培养基来提供发酵肉汤，其中所述第1微生物是产油性微生物，
(iii)温育接种所述第1微生物的所述培养基而使脂质蓄积，
其中所述发酵肉汤包含至少一种微生物生长抑制物，且其中所述第1微生物耐受所述微生物生长抑制物，其中所述温育在耗氧条件下进行。
本发明的方法也指称单细胞油产生过程。本发明的方法可为本文所述的生物燃料产生过程的部分，其中油或至少部分油由本文所述的方法以微生物油形式提供。
根据优选的本发明的实施方式，培养基包含源于纤维素和/或半纤维素的木质纤维素糖。根据本发明，将木质纤维素生物质的半纤维素和/或纤维素级分在相同的过程中用作微生物油产生(单细胞油)的原材料(生物反应器系统)。该过程优选使用能利用C6(例如葡萄糖,甘露糖,半乳糖)和C5(例如木糖,阿拉伯糖)糖的产油性微生物。
根据本发明的另一实施方式，培养基包含源于木质纤维素的半纤维素糖。根据本发明的仍另一实施方式，当供给到单细胞油产生过程中时，半纤维素糖至少部分是寡聚体形式。
根据本发明的一个优选的实施方式，首先自木质纤维素材料分离半纤维素级分。分离可用任何方法实施，优选由水热处理，自动水解和/或蒸汽爆炸，有或无酸添加而产生含有半纤维素糖的液体级分和含有纤维素和木质素的固体级分。液体级分一般含有抑制微生物的生长的化合物，在木质纤维素分级分离过程中产生的化合物。这些化合物是木质纤维素的降解产物，诸如木质素和糖，及包含酚化合物，呋喃化合物(糠醛和其衍生物)及有机酸(主要是乙酸,甲酸)。含有纤维素和木质素的固体级分也含有抑制性化合物，依赖于洗涤程度。根据本发明，培养基包含来自分级分离步骤的液体流，构成半纤维素糖可无糖寡聚体的酶促水解而补给到培养中，或替代性地，含有糖寡聚体的半纤维素流可补给到酶促水解而在用于微生物培养之前产生糖单体。根据发明，将固体纤维素-木质素级分补给到酶处理而将纤维素和残留的半纤维素(在分级分离步骤中不溶解)溶解为糖单体而用于微生物油产生。
脂质一般在产油性微生物(被称为第1微生物)之内作为细胞内脂质蓄积，但是微生物脂质也可被分泌或至少部分分泌到发酵肉汤中，从其可回收所述微生物脂质。由此，在一实施方式中，所述方法还包括自所述第1微生物(产油性微生物)回收蓄积的脂质的步骤。在另一实施方式中，自发酵肉汤回收脂质。脂质回收可如在本文讨论，以各种方式实施。
温育(培养)步骤(iii)可作为任何适合的耗氧培养实施，包括分批，补给分批或连续培养。
当培养基，发酵罐(生物反应器)或与发酵罐连接的系统未经灭菌时，可建立混杂微生物的培养。由此，当该混杂微生物不是产油性微生物时，它们可就可利用的底物，与产油性微生物竞争，和由此减少生产中的脂质产率。
这些混杂微生物(被称为第2微生物)不需要，及应在系统中避免或抑制。通过导入产油性微生物耐受的微生物抑制物，在系统中避免或抑制混杂微生物(第2微生物)的建立，其中后者是敏感或至少欠耐受所述微生物抑制物。
当木质纤维素水解产物未经灭菌时，其会一般含有一种或更多非-产油性微生物物种，其因此培养中不需要，和落入第2微生物的定义之内。由此，在一实施方式中，所述第2微生物是非-产油性微生物。
在本发明的一实施方式中，在生产系统，例如发酵罐中导入或建立了第2(非-产油性微生物)，由此会使发酵肉汤发生混杂。由此，在本发明的一实施方式中，发酵肉汤还包含第2微生物，其不耐受所述至少一种微生物生长抑制物。替代性地，在培养制备期间例如随木质纤维素水解产物导入第2微生物。因此，在进一步实施方式中，第2微生物存在于步骤(i)中提供的培养基中，或混杂在步骤(ii)或(iii)的发酵肉汤中或存在于生物反应器中。
本发明因此旨在避免这些混杂微生物(被称为第2微生物)在系统中建立。此通过导入产油性微生物(第1微生物)耐受或至少更耐受和混杂微生物(第2微生物)不耐受或至少相比第1微生物欠耐受的至少一种微生物生长抑制物实现。
从以上描述可明白，如果第1微生物"耐受"微生物生长抑制物，这表示所述第1微生物(油产生性微生物")，能甚至在所述微生物生长抑制物的存在下增殖和/或产生油。此外，需知，在例如第2(混杂)微生物的情景中，"不耐受"表示所述第2微生物的生长会被抑制，诸如在包含足够的浓度的所述微生物生长抑制物的培养基中被阻止增殖。
本领域技术人员从实施例中描述的方法和数据部分也明白如何测试任何油产生性微生物在微生物生长抑制物的存在下，以合理的水平增殖和/或产生油的能力。本领域技术人员还会明白，基于实施例中给出的方法和数据，如何测试任何第2(潜在地混杂)微生物如何不耐受所述微生物生长抑制物，及由此在培养基中需要所述微生物生长抑制物的哪个确切的浓度，以抑制所述第2微生物的增殖(生长)。因此，测试在培养基以本申请中定义的或由实验诸如实施例部分描述的那些定义的量包含微生物生长抑制物的条件下，第1(油产生性微生物)压过混杂性第2微生物生长的能力的知识和方法是可利用的。
耐受因此表示耐受微生物能在微生物生长抑制物的存在下压过不耐受微生物生长。
耐受性范围由此是特定微生物抑制物的浓度范围，在该浓度范围内，特定第1微生物能以不差别多于当微生物生长抑制物不存在于培养基中时增殖或产生的水平的50％的水平增殖及产生油。
从实施例中给出的方法和数据可见，通过使用这些方法可容易确定耐受性范围。同样，第2微生物的"耐受性范围之外"简单表示，使用描述于实施例的方法，本领域技术人员可确定微生物生长抑制物的浓度是否在特定第2微生物的耐受性范围之外。在耐受性范围之外表示，相比无所述微生物生长抑制物的相同的培养基，该浓度的微生物生长抑制物抑制所述第2微生物的生长或增殖至少20％，诸如至少30％，或40％或至少50％。
在生长或产生期间可需要监测反应器中微生物生长抑制物的浓度和随后调整所述微生物生长抑制物的浓度，因为一些微生物会造成例如培养基中酚化合物的浓度的增加或减小。因此，"调整浓度"表示，浓度会因此调整而仍在期望的范围之内，其对于第1微生物在容许的范围之内，及对于第2微生物在容许的范围之外。
本发明人发现，存在于木质纤维素水解产物中的化合物(诸如酚化合物)可在本发明的方法中发挥微生物抑制物的功能。由此，在本发明的一实施方式中，所述至少一种微生物生长抑制物存在于步骤(i)中提供的培养基中，诸如在培养基的木质纤维素水解产物中。微生物生长抑制物化合物也可在培养期间随着木质纤维素水解产物添加，诸如以补给分批培养方式。
根据本发明，产油性微生物(第1微生物)耐受或至少部分耐受在培养期间存在的微生物抑制物。第2微生物，另一方面不耐受微生物抑制物或相比第1微生物至少欠耐受微生物抑制物，其允许调整微生物抑制物的浓度，使得产油性微生物的条件有利于第2微生物的条件。
在本发明的一实施方式中，所述至少一种微生物生长抑制物以在所述第1微生物的耐受性范围之内及在所述第2微生物的耐受性范围之外的浓度存在于所述发酵肉汤中。在进一步实施方式中，方法还包括在发酵肉汤中添加所述至少一种微生物生长抑制物或调整发酵肉汤中所述至少一种微生物生长抑制物的浓度的步骤。
本发明的方法致使在制造发酵肉汤之前无需灭菌培养基而通过向其接种产油性微生物而有效进行微生物油产生。由此，在本发明的一实施方式中，方法未在无菌条件下实施。在进一步实施方式中，包含步骤(i)中提供的木质纤维素水解产物的培养基未经灭菌。换言之，在本发明的一实施方式中，方法作为非-无菌过程(非-无菌操作)实施。
生物反应器和培养基的灭菌也相比不包括灭菌的生物反应器系统需要更多能量和更昂贵的反应器设计。由此，避免灭菌可通过允许欠昂贵的操作及降低投资成本而改善培养的成本效益。
本发明人发现，尤其是酚化合物，诸如在木质纤维素材料的分级分离过程之后存在于木质纤维素水解产物中的酚化合物是在本发明的方法中作为微生物抑制物特定有用的。使用此类抑制物的优势是其随木质纤维素水解产物导入，和可将浓度调至落入产油性微生物(第1微生物)的耐受性窗之内及在第2微生物(非-产油性微生物)的耐受性窗之外，在后者部分耐受微生物抑制物的情况中。
本发明的方法优选使用高度耐受基于木质纤维素的抑制物的产油性微生物，其提供调整发酵肉汤中微生物抑制物水平的更大窗。
抑制物包括但不限于酚化合物有机酸，糠醛和羟甲基糠醛，其存在于半纤维素和/或纤维素级分中。浓度可调整至达到抑制混杂性微生物(非-产油性微生物)的生长，而不影响或至少不显著地影响产油性微生物的生长的水平。由此，由于方法可优选使用存在于木质纤维素水解产物中的微生物抑制物，然后水解产物未经历自水解产物去除微生物抑制物的步骤。由此，在本发明的一实施方式中，在包含步骤(i)中提供的木质纤维素水解产物的培养基中，未经历解毒过程而去除所述至少一种生长抑制物。
在本发明的一实施方式中，至少一种微生物生长抑制物是酚化合物组，诸如存在于木质纤维素水解产物中的总酚化合物组(作为每体积总酚测量,例如g/l)。在进一步实施方式中，所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平是至少1g/l。浓度可通过调整培养基的浓度而达到发酵肉汤中期望的浓度达到。酚化合物用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)分析，其指示液体中酚化合物的总量。
在进一步实施方式中，所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～7g/l或以上范围内(生长培养基)。根据本发明的一实施方式，发酵肉汤中酚化合物的浓度在7和10g/l之间，根据另一实施方式，浓度在10和20g/l之间，及根据仍另一实施方式，酚化合物的浓度在20和50g/l之间。在仍进一步实施方式中，所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～5g/l范围内，优选在1g/l～3g/l范围内。
木质纤维素水解产物(半纤维素和纤维素级分)中和/或发酵肉汤中的微生物抑制物的含量可以各种方式调整而达到在发酵肉汤中期望的水平。
液体半纤维素流中的抑制物浓度可通过改变在用于(至少部分)半纤维素液化的木质纤维素分级分离过程步骤，诸如在水热处理，自动水解和/或蒸汽爆炸(有或无酸添加)中的条件(诸如温度,延迟(滞留时间)，pH,干物质含量)，例如严重性因素来调整。通过改变木质纤维素分级分离中的条件，可调整抑制性化合物而导致含有半纤维素的液体流中的特定抑制性化合物水平。
或者，半纤维素糖流中的微生物抑制物的浓度通过由任何知道的方法纯化半纤维素流来调整，所述方法包括但不限于吸附，吸收，过滤，剥离，浸灰，蒸发，提取或酶处理。
一般而言，相比来自含有纤维素和木质素的固体级分的酶促水解的糖流(富含C6的流)，源于木质纤维素分级分离步骤的主要含有半纤维素糖的糖流(富含C5的流)导致半纤维素液化(至少部分)含有更高量的抑制性化合物，诸如酚化合物，有机酸(诸如乙酸和甲酸)，糠醛和/或羟甲基糠醛。
培养中使用的糖流的微生物抑制物浓度可通过混合半纤维素糖流(富含C5的流)和纤维素糖流(富含C6的流)来调整。半纤维素和纤维素糖流的混合可以任何比例进行而达到允许油产生性生物生长，但阻止或显著地抑制混杂生物(不能有效油产生)的生长的培养中适当的抑制物浓度。
可实施源于木质纤维素预处理的液体的处理，其也导致增加的抑制物浓度或特定抑制物浓度的增加和可有利的其他抑制物的去除。例如，来自含有半纤维素碳水化合物的预处理的液体蒸发可导致增加的非-挥发性抑制物(诸如酚化合物)浓度及降低的挥发性抑制物诸如糠醛，乙酸和甲酸浓度。由此，挥发性化合物诸如糠醛部分，可在碳水化合物浓缩期间去除。
一般而言，在单细胞油生产中，使用浓缩的糖。在来自木质纤维素分级分离和酶促水解的糖流的浓缩中，一般使用蒸发。蒸发导致糖浓缩物中非-挥发性化合物，例如酚化合物的浓缩。优选地，将耐受高浓度的酚化合物的生物用于单细胞油产生。
根据本发明的一个优选的实施方式，将来自含有半纤维素和纤维素的木质纤维素分级分离的糖流在补给到单细胞油产生过程之前浓缩，但不实施其他纯化步骤。由此，通过调整木质纤维素分级分离中的条件，通过木质纤维素糖流的蒸发及通过混合发酵肉汤中的半纤维素糖富-流(C5-糖浆)和纤维素糖富流(C6-糖浆)来达到允许产油性微生物生长，但抑制混杂的非-产油性微生物生长的最佳抑制物量。
酶处理具有长滞留时间(一般1～3天)，由此其倾向于微生物混杂，导致在微生物油产生(耗氧发酵)中的糖损失和问题。根据本发明的一个优选的实施方式，仅洗涤来自导致至少部分半纤维素液化的分级分离步骤的纤维素+木质素级分到允许酶处理，但抑制酶促水解中混杂微生物的生长，由此降低糖损失的程度。
来自含有纤维素的木质纤维素分级分离的固体级分中抑制性化合物的量可由在酶促水解之前洗涤固体纤维素级分的程度，或通过改变产生固体纤维素和木质素级分的木质纤维素分级分离过程中的处理条件(诸如温度,延迟(滞留时间)，pH)来调整。
【由本发明的方法使用的木质纤维素水解产物】
由本发明的方法使用的木质纤维素水解产物是木质纤维素或木质纤维素材料的水解产物。木质纤维素水解产物可由木质纤维素或木质纤维素材料的一个或更多处理获得，包括水解(水热处理和/或自动水解)，蒸汽爆炸(有或无酸添加)，一个或更多脱木质化步骤，例如使用碱性脱木质化剂的脱木质化。
由本发明的方法使用的木质纤维素水解产物可为半纤维素被至少部分溶解的任何木质纤维素分级分离方法的产物。
在一实施方式中，木质纤维素水解产物通过用自动水解处理木质纤维素作为第1步骤获得。自动水解一般以5～40％干物质含量，于140和240℃之间的温度实施1～120min，无酸性化合物添加，导致包括半纤维素碳水化合物的木质纤维素材料中5～40％的干物质含量的溶解。一般而言，热水提取自木质纤维素材料溶解30～100％，更优选>50％，更优选>70％，更优选>80％，甚至更优选>90％的半纤维素碳水化合物。溶解的半纤维素碳水化合物至少部分是寡聚体形式。更一般地，以10～30％干物质含量，于160～220℃，依赖于木质纤维素原材料实施自动水解。在自动水解之后，将固体和液相由任何方法，诸如过滤，例如加压过滤，或由螺旋压缩机分离。可洗涤固体级分而自固相移出溶解的半纤维素。
根据本发明的另一实施方式，木质纤维素水解产物是一般在110和250℃之间的温度，更一般在140和230℃之间的温度用蒸汽或蒸汽爆炸(有或无酸性化合物添加)处理木质纤维素的产物。处理导致半纤维素碳水化合物的溶解。任选地，洗涤来自蒸汽爆炸的固体材料而回收溶解的半纤维素碳水化合物。
根据本发明的仍另一实施方式，木质纤维素水解产物是用铵处理木质纤维素而溶解含有寡聚体的半纤维素碳水化合物的产物。根据本发明的一实施方式，随60℃和220℃之间的温度使用铵纤维膨胀(AFEX)或氨再循环渗滤。
在木质纤维素材料的处理期间，碳水化合物之外的其他有机化合物，诸如酚化合物(诸如4-羟基苯甲酸,p-香豆酸酸,香兰酸,香兰素,苯酚,愈创木酚,氢醌,儿茶酚,阿魏酸,丁香醛,丁香酸)，糠醛，羟甲基糠醛(HMF)，乙酸，甲酸和乙酰丙酸一般在处理中形成及释放，及随着半纤维素碳水化合物溶解进液相。此外，提取物诸如己酸，辛酸，棕榈酸和壬酸可被释放。
酚化合物，糠醛，羟甲基糠醛，乙酸和甲酸一般对微生物生长是抑制性的。导致生长抑制的化合物浓度依赖于微生物。一些油产生性微生物，优选真菌，更优选丝状真菌高度耐受木质纤维素预处理(即水解,分级分离)中形成的抑制性化合物，诸如酚化合物，糠醛，HMF，乙酸和甲酸。
如在本文提及，在木质纤维素材料的分级分离而获得木质纤维素水解产物期间产生的微生物抑制物在本发明的方法中作为微生物抑制物特别有用。
高度耐受这些抑制性化合物的产油性生物的利用是有利的，由于其可减小单细胞油产生中用于去除抑制物，及此外减小或阻止耗氧发酵过程中混杂微生物的生长的单元操作的需求和复杂性。
【第1微生物】
在方法的一步骤中，将包含木质纤维素水解产物的培养基用第1微生物接种，其是脂质产生微生物(产油性微生物)。在本发明的一实施方式中，第1微生物(产油性微生物)选自：丝状真菌、酵母、细菌和藻或细菌。优选使用能利用C6和C5糖的生物。
产油性微生物可天然产生脂质，或可由遗传修饰获得产油性微生物，其增加细胞内脂质产生和微生物容量而蓄积细胞内脂质。
在本发明的情景中，第1微生物(产油性微生物)指称当在适合的条件下培育时，能蓄积细胞间脂质，使得脂质占微生物的总生物质(每细胞干重)的至少15％(w/w)的微生物。由此，在本发明的一实施方式中，所述第1微生物(产油性微生物)能产生及蓄积多于15％其重量的脂质(每细胞干重)。在优选的实施方式中，第1微生物(产油性微生物)能蓄积微生物总生物质的至少20％(w/w)(每细胞干重)。
由此，关于它们蓄积细胞间脂质的能力不落入以上定义之内的微生物被认为是非-产油性微生物，由此在温育期间不需要。在本发明的情景中，第2微生物指称非-产油性微生物，即当在适合的条件下培育时，第2微生物的蓄积细胞间脂质的能力低于总生物质的15％(w/w)(每细胞干重)。
在本发明的一实施方式中，第1微生物(产油性微生物)选自：被孢霉属(Mortierella)、曲霉属(Aspergillus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢属(Rhodosporidium)和隐球菌属(Cryptococcus)。发明人发现，这些属的物种特别耐受存在于木质纤维素水解产物中的微生物抑制物，诸如本文讨论的酚化合物。
非-产油性微生物(第2微生物)包括非-产油性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillusspp.)物种和假单胞菌属(Pseudomonasspp.)物种，由此在本发明的一实施方式中，第2微生物选自：芽孢杆菌属(Bacillusspp.)物种，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，假单胞菌属(Pseudomonasspp.)物种，诸如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescen)。发明人发现，这些非-产油性微生物不耐受存在于木质纤维素水解产物中的微生物抑制物，尤其是木质纤维素水解产物的酚化合物。
根据本发明的另一实施方式，非-产油性第2微生物选自非-产油性酵母，非-产油性丝状真菌，或非-产油性微藻。
由此，当第2微生物(非-产油性微生物)不耐受木质纤维素水解产物中酚化合物形式的微生物抑制物时，则产油性微生物(第1微生物)优选选自产油性微生物，其特别耐受存在于木质纤维素水解产物中的酚化合物。
由此，在本发明的一实施方式中，第1微生物(产油性微生物)选自：被孢霉属(Mortierella)、曲霉属(Aspergillus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢属(Rhodosporidium)和隐球菌属(Cryptococcus)，和至少一种微生物生长抑制物是酚化合物组，诸如存在于木质纤维素水解产物中的总酚化合物组(作为总酚浓度/发酵肉汤体积测量,例如作为g/l)，及所述发酵肉汤中所述酚化合物的优选水平是至少1g/l，诸如1g/l～7g/l或以上范围之内(生长培养基)。在仍进一步实施方式中，所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～5g/l范围内，优选在1g/l～3g/l范围内。根据本发明的一实施方式，发酵肉汤中酚化合物的浓度在7和10g/l之间，根据另一实施方式，浓度在10和20g/l之间，及根据仍另一实施方式，酚化合物的浓度在20和50g/l之间。
【发酵肉汤和其使用】
本发明的第2方面涉及发酵肉汤，其包含木质纤维素水解产物，至少一种微生物生长抑制物和产油性微生物，其中所述产油性微生物耐受所述微生物生长抑制物。
所述至少一种微生物生长抑制物优选作为通过木质纤维素材料的分级分离预处理而获得木质纤维素水解产物产生的化合物存在于木质纤维素水解产物中。
由此，可将木质纤维素水解产物(半纤维素和纤维素级分)中和/或发酵肉汤中微生物抑制物的含量调至达到在发酵肉汤中期望的水平。优选至少一种微生物抑制物是木质纤维素水解产物中的酚化合物，和产油性微生物是耐受存在于木质纤维素水解产物中的酚化合物的产油性微生物。
另一方面涉及本发明的发酵肉汤在产生微生物脂质的方法中的用途。
仍另一方面涉及包含至少一种微生物生长抑制物的组合物在产生脂质的方法中的用途，其中所述脂质在产油性微生物中产生及蓄积，且其中所述产油性微生物耐受所述至少一种微生物生长抑制物。在优选的实施方式中，组合物木质纤维素水解产物，和至少一种微生物抑制物是所述产油性微生物耐受的存在于木质纤维素水解产物中的酚化合物。
在本发明的一优选的实施方式中，微生物油产生在木质纤维素水解产物上的培养在非-无菌条件下实施。根据另一优选的本发明的实施方式，含有木质纤维素水解产物的培养肉汤(也被称为发酵肉汤)被热处理，但不经灭菌，诸如巴氏消毒及在单细胞油产生过程中使用。根据本发明的另一优选的实施方式，含有木质纤维素水解产物的肉汤的热处理是用来浓缩木质纤维素水解产物中的糖的蒸发步骤。热处理(例如巴氏消毒和/或蒸发)与源于木质纤维素的抑制性化合物的组合允许单细胞油生产中的非-无菌培养。
当描述本发明的实施方式时，全部可能的实施方式的组合和置换未明确地描述。然而，需知，特定量度在相互不同从属权利要求中叙述，或在不同实施方式中描述不表示这些量度的组合不可有利地利用。本发明包括描述的实施方式的全部可能的组合和置换。
在每个实例中，术语"包含(comprising)"，"包含(comprise)"和"包含(comprises)"在本文旨在由申请人任选地分别取代为术语"由···组成(consistingof)"，"由···组成(consistof)"或"由···组成(consistsof)"。
【项】
以下以非限制性项的方式描述本发明。
项1.产生脂质的方法，包括以下步骤：
(i)提供包含木质纤维素水解产物的培养基，
(ii)通过用第1微生物接种(i)的培养基来提供发酵肉汤，其中所述第1微生物是产油性微生物，
(iii)温育接种所述第1微生物的所述培养基而使脂质蓄积，
其中所述发酵肉汤包含至少一种微生物生长抑制物，且其中所述第1微生物耐受所述微生物生长抑制物，其中所述温育在耗氧条件下进行。
项2.项1的方法，其还包括自所述第1微生物回收蓄积的脂质的步骤。
项3.项1或2的方法，其中所述发酵肉汤还包括第2微生物，其不耐受所述至少一种微生物生长抑制物。
项4.根据项3的方法，其中所述第2微生物存在于步骤(i)中提供的培养基中，或混杂在步骤(ii)或(iii)的发酵肉汤中。
项5.根据在前项之任一项的方法，其中所述第2微生物是非-产油性微生物。
项6.根据在前项之任一项的方法，其中所述至少一种微生物生长抑制物存在于步骤(i)中提供的培养基中。
项7.根据在前项之任一项的方法，其中所述至少一种微生物生长抑制物以在所述第1微生物的耐受性范围之内及在所述第2微生物的耐受性范围之外的浓度存在于所述发酵肉汤中。
项8.根据在前项之任一项的方法，还包括在发酵肉汤中添加所述至少一种微生物生长抑制物或调整发酵肉汤中所述至少一种微生物生长抑制物的浓度的步骤。
项9.根据在前项之任一项的方法，其中至少一种微生物生长抑制物是酚化合物组(作为总酚/发酵肉汤体积的浓度测量)。
项10.根据项9的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平是至少1g/l。
项11.根据项9或10的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～7g/l或以上范围内(生长培养基)。
项12.根据项9～11之任一项的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～5g/l范围内，优选在1g/l～3g/l范围内。
项13.根据在前项之任一项的方法，其中所述第1微生物选自：丝状真菌、酵母、细菌和藻。
项14.根据在前项之任一项的方法，其中所述第1微生物选自：被孢霉属(Mortierella)、曲霉属(Aspergillus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢属(Rhodosporidium)和隐球菌属(Cryptococcus)。
项15.根据在前项之任一项的方法，其中所述第2微生物是非-油性的，选自：细菌酵母，丝状真菌或微藻。
项16.根据在前项之任一项的方法，其中所述第2微生物是选自下列的细菌：芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)。
项16.根据在前项之任一项的方法，其中包括步骤(i)中提供的木质纤维素水解产物的所述培养基未经灭菌。
项17.根据在前项之任一项的方法，其中包括步骤(i)中提供的木质纤维素水解产物的所述培养基未经历解毒过程而去除所述至少一种生长抑制物。
项18.根据在前项之任一项的方法，其中所述方法未在无菌条件下实施。
项19.根据在前项之任一项的方法，其中所述第1微生物能产生及蓄积多于15％其重量的脂质(每细胞干重)。
项20.发酵肉汤，其包含木质纤维素水解产物，至少一种微生物生长抑制物和产油性微生物，其中所述产油性微生物耐受所述微生物生长抑制物。
项21.项20的发酵肉汤在产生脂质的方法中的用途。
项22.包含至少一种微生物生长抑制物的组合物在产生脂质的方法中的用途，其中所述脂质在产油性微生物中产生及蓄积，且其中所述产油性微生物耐受所述至少一种微生物生长抑制物。
【实施例】
【培养用木质纤维素水解产物的制备】
【自动水解液体A】
通过于195℃使小麦秸秆经历自动水解处理，之后是蒸汽爆炸至环境温度和压力来制备自动水解液体A。在自动水解之后，使物质悬浮于自来水，以分离溶解的半纤维素糖。通过向含有半纤维素的悬浮液形成液相及含有纤维素和木质素的固相加压过滤来实施固体液体分离。将液相(以寡聚体形式含半纤维素糖部分)浓缩而获得在培养中使用的自动水解液体A。自动水解液体A基于由高效液相层析(HPLC)的分析含有112g/L糖，和基于用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)的分析含有13g/L的酚化合物。
在培养实验中，用水稀释水解产物而在培养肉汤中获得期望的浓度。
【自动水解液体B】
用由洗涤秸秆之后自动水解组成的处理自小麦秸秆制备自动水解液体B。在500dm3搅拌箱反应器中用80℃水洗涤第1小麦秸秆(38.1kgDM)。在Seitz滤器中将第1固体级分与第1液体级分分离。将第1固体级分(34.7kgDM)手动装载进500dm3反应器，及与水混合而给悬浮液8.6％一致性。将悬浮液加热达175℃(9.8巴)，及通过打开与反应器连接的阀释放压力。在沉降式离心机中将第2液体级分与第2固体级分分离。将第2固体级分用水悬浮洗涤一次，和获得将第3液体级分与洗涤的固体级分(128kg具有16.9％干物质含量)分离。将第2和第3液体级分组合，使经过袋式过滤器，及将获得的滤出液(514kg)于室温用活性碳(4.1kg)处理。将用活性碳处理的液体澄清，及在降膜蒸发器中浓缩而给23.8kg的具有16.3％干物质含量和18°Bx折射性干物质的浓缩的自动水解液体。通过蒸发再次浓缩该浓缩的自动水解液体而给总碳水化合物含量占78.1％(w/w)的具有pH4.8和44.6％干物质含量的自动水解液体B。在样品的稀酸水解(4％w/w硫酸,121℃,1h)之后通过高效液相层析(HPLC)测定碳水化合物含量。基于Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)的分析的酚化合物的浓度是31g/L。
此后，像这样在培养实验中使用自动水解液体(含有寡聚体形式的半纤维素糖部分)。
【自动水解液体C】
实施对于小麦秸秆的自动水解反应和半纤维素寡糖的随后分离，以产生发酵用液体级分，及对于酶促水解灵敏的固体级分。为了达到此，在500dm3搅拌的箱反应器中将35.7kg小麦秸秆(89.8％干物质含量)与240kg的水混合而给出11.6％一致性的悬浮液。将悬浮液加热达180℃，之后冷却到100℃以下。自反应器排出水热地处理的悬浮液，和使用沉降式离心机将第1液体级分与固体级分分离。将固体级分在用磷酸调整到pH4的酸性水中悬浮洗涤。在沉降式离心机中将固体级分与第2液体级分分离。将第1和第2液体级分组合，及在降膜蒸发器中浓缩而给18.3kg的形成自动水解液体C的浓缩的自动水解液体，所述自动水解液体含有寡聚体形式的半纤维素糖部分，及具有42％干物质含量和38°Bx折射性干物质。将洗涤的固体级分(96.7kg，具有23.0％干物质含量)用作酶促水解用的给料物质而产生培养用纤维素水解产物。
自动水解液体浓缩物所含有的酚化合物部分由通过添加40g/l活性碳，在4℃轻轻混合20小时来处理液体而去除，和最终使用400瓮过滤布将碳滤去。此液体在实施例3中使用(纯化的自动水解液体C)。在实施例4中，像这样不纯化地使用水解产物。
从制备自动水解液体C的自动水解实验，从含有纤维素的固体级分制备(在洗涤之后)来自小麦秸秆的纤维素级分的酶促水解产物。将来自形成自动水解液体C的自动水解处理的洗涤的固体级分(17.3kg，具有23.1％干物质含量)称重到40dm3搅拌箱反应器，及与14.7kg水和10mL50％NaOH(w/w)混合而产生12.5％一致性及pH5的悬浮液。对反应器加热，及维持于50℃，和216ml的包含82％纤维素(EconaseCE,RoalOy)，10％纤维二糖酶(Novozyme188,Sigma/Novozymes)和7％木聚糖酶(GC140,Genencor)的酶混合物。在酶处理期间，将悬浮液经5min周期性地搅拌3次/小时。在48h驻留时间之后，悬浮液补充合计10％的初始酶剂量及具有类似个体酶比例的新鲜酶混合物。在于50℃72h驻留时间之后，通过使用液压机过滤来将液体级分与固体级分分离。将固体级分用水洗涤一次，和再次将液体级分与固体级分分离。将液体级分组合，及通过蒸发在减压下浓缩。纤维素水解产物浓缩物(1.57kg)含有220g/l总糖。
像这样在培养中使用含有单体糖的纤维素水解产物。
【自动水解液体D】
通过在100dm3容器中混合10.5kg的研磨的小麦秸秆(92.7％干物质含量)和54.1kg的自来水来制备悬浮液。在于室温存储18h之后，将64.2kg的悬浮液称重到水平圆筒形250dm3搅拌的高压釜反应器中。关闭反应器，及在75min内加热至140℃，于140℃维持5h，及在30min之内冷却至室温。将水热地处理的悬浮液自反应器手动排出，及通过过滤将第1液体级分与第1固体分离。将第1固体级分用自来水洗涤两次，及通过使用液压机施压而给出洗涤的固体级分。洗涤的固体级分(20.9kg)具有42.7％干物质含量。将第1液体级分与洗涤-水组合，及在降膜蒸发器中浓缩至11.5％(w/w)干物质含量。浓缩的液体，自动水解液体D，自浓缩的液体的总干物质含有49.3％总糖，如在稀酸水解(4％w/w硫酸,121℃,1h)之后由高效液相层析(HPLC)测定。总糖含量的无水木糖，无水阿拉伯糖，无水葡萄糖和无水半乳糖的相对比例分别是57％，19％，13％和11％。
在此之后，像这样在培养实验中使用以寡聚体形式含有半纤维素糖部分的自动水解液体D。
【实施例1：乙酸和甲酸对真菌生长的效应】
通过使用脂质产生真菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)做实验。由在PDA-平板上生长的孢子形成真菌，通过添加12ml的无菌水制造孢子悬浮液，和用接种环将孢子刮到液体。将孢子悬浮液用于培养基接种。
培养基的基本组分显示于表1。全部它们含有的这些基本营养，及小量精细纤维素，以防止真菌丛聚。
表1：基础培养基组成
g/l
纤维素 2
麦芽提取物 30
胨 3
通过使用自来水制造培养基。
如此加入有机酸，甲酸和乙酸单独的浓度是0，1，3，5和7g/l，及对于2种酸一起是0，1，3，5，7和9g/l。在此之后，使用3MNaOH将培养基pH调至5.5～6.0。向250ml锥形瓶中分配培养基至50ml批。将培养基在121℃高压釜中灭菌15min。在冷却下来之后，通过使用0.5ml早先提及的孢子悬浮液接种各细颈瓶。就各浓度，制造并行培养物。将培养物在160rpm振摇下于28℃温育5天。每天用显微镜观察生长，及在培养结束时测定生物质和脂质含量。
通过真空过滤细颈瓶的全体内容物来测定生物质含量，及用50ml的蒸馏水洗涤生物质。在此之后，将生物质块在冷冻干燥器中冷冻及干燥过夜。根据Suutari等人(1990)自干生物质分析脂质含量。将样品中的脂质首先水解为游离的脂肪酸，将其皂化为其钠盐，然后甲基化为甲基酯。以气相层析方式分析脂肪甲基酯。
结果：在全部细颈瓶中，无关于酸浓度，生长几乎在相同的时间开始。生物质和脂质浓度也非常类似。基于这些结果，可以说，测试的，分离的或均经历的酸对于真菌生长或脂质产生无影响。生物质和脂质浓度显示于表2。
表2：以不同酸浓度的生物质浓度和脂质含量
乙酸浓度g/l 生物质浓度g/l 脂质含量(％自细胞干重)
0 12.4 20.1
1 12.4 19.8
3 11.4 20.7
5 11.1 21.2
7 11.5 24.3
甲酸浓度(g/l) 生物质浓度g/l 脂质含量(％自细胞干重)
0 12.9 18.9
1 12.5 19.5
3 12.0 19.5
5 11.2 15.9
7 10.9 19.8
乙酸和甲酸的浓度(g/l) 生物质浓度g/l 脂质含量(％自细胞干重)
0 12.9 18.9
1 12.4 20.3
3 11.6 18.1
5 11.0 22.0
7 10.4 17.4
9 9.5 15.9
【实施例2：酚化合物的抑制效应】
通过使用生产性真菌和酵母株米曲霉(Aspergillusoryzae)，黄褐色被孢霉(Mortierellaisabellina)和斯氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)做实验。测试来自含有半纤维素糖和可检测到的量的酚类的木质纤维素的自动水解处理的2种不同木质纤维素水解产物，自动水解液体A和自动水解液体B。根据Folin-Ciocalteu方法，用棓酸作为标准物测定酚化合物(Waterhouse,2002)。
自在PDA-平板上生长的孢子形成真菌，通过添加12ml的无菌水制造孢子悬浮液，和将孢子用接种环刮到液体中。将孢子悬浮液用于培养基接种。
培养基基本组分显示于表3。全部它们含有这些基本营养物，及小量的精细纤维素，以防止真菌丛聚。
表3：生长培养基的组成
g/l
葡萄糖 20
麦芽提取物 30
胨 3
通过使用自来水制造培养基。
如此加入自动水解液体A或B，使得酚类的浓度是0，1，2，3，4，5，6和7g/l。在此之后，将培养基的pH使用3MNaOH调至6.5。向250ml锥形瓶中分配培养基至50ml批。将培养基在121℃高压釜中灭菌15min。在冷却之后，在真菌的情况下，通过使用0.5ml早先提及的孢子悬浮液接种各细颈瓶，及在酵母的情况下，使用预培养的酵母悬浮液。就各浓度，制造并行培养物。真菌培养在160rpm振摇下，及酵母在160rpm，全部于28℃温育5天。每天用显微镜观察两次生长，及在培养结束时，测定生物质含量。
通过真空过滤细颈瓶的全体内容物来测定真菌生物质含量，及用50ml的蒸馏水洗涤生物质。在此之后，将生物质块在冷冻干燥器中冷冻及干燥过夜，和测定生物质含量。
通过在预称重的管中测量7ml的测试生长悬浮液，来自各细颈瓶的并行样品来测定酵母生物质含量。将样品以6000rpm离心10min，之后移出上清液，添加7ml的蒸馏水，良好混合管内容物，及重复离心。然后移出洗涤水，及生物质沉淀和上清液冷冻。随后，将生物质样品冷冻干燥，和测定生物质含量。
【结果】
由显微观察可见，当酚浓度上升时，开始生长需要的时间用一些微生物变得稍微更长。一天两次监测培养，如此当生长不可能开始，但可进行粗糙估计时测定确切的时刻。以任何测试的酚浓度，用酵母斯氏油脂酵母(L.starkeyi)及真菌米曲霉(A.oryzae)无可检测到的滞后，及全部在温育1天之后生长。另一方面，当酚浓度升高到以上4g/l时，真菌黄褐色被孢霉(M.isabellina)生长更缓慢开始。
米曲霉(A.oryzae)可甚至在测试的最高酚浓度：7g/l中生长，但当酚浓度变得更高时，生物质含量降低。斯氏油脂酵母(L.starkeyi)及黄褐色被孢霉(M.isabellina)可在达6g/l浓度时也生长，在7g/l检测不到生长。类似于米曲霉(A.oryzae)，当酚浓度变得更高时生物质含量降低。检测到来自自动水解抑制的不同水解产物之间无差异。在以下表中给出以各种酚浓度测试的微生物的生物质含量。
表4：以不同酚浓度测试的微生物的生物质含量
微生物 自动水解液体 酚类浓度(g/l) 生物质浓度(g/l)
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 0 12.4
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 1 10.7
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 2 10.4
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 3 7.4
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 4 5.1
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 5 1.5
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 6 0
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) A 7 -
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 0 15.0
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 1 15.4
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 2 13.2
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 3 11.4
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 4 11.8
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 5 11.2
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 6 11.1
米曲霉(Aspergillus oryzae) A 7 7.6
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 0 14.7
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 2 13.8
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 3 10.1
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 4 8.5
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 5 3.7
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) A 6 0.621 -->
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 0 12.54
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 2 7.7709
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 3 6.4339
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 4 4.9039
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 5 3.8129
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 6 0.6259
黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina) B 7 -
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 0 14.9
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 3 9.5
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 4 8.0
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 5 6.8
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 6 6.8
米曲霉(Aspergillus oryzae) B 7 5.3
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) B 0 14.7
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) B 2 10.4
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) B 4 6.5
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) B 5 5.6
斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) B 6 3.3
【实施例3：在小麦秸秆半纤维素和纤维素水解产物糖上的真菌生长和脂质产生】
通过使用脂质产生真菌株米曲霉(A.oryzae)做实验。自在PDA-平板上生长的孢子形成真菌，通过添加12ml的无菌水制造孢子悬浮液，和将孢子用接种环刮到液体中。将24ml的孢子悬浮液直接用于发酵罐接种。培养基组成显示于表5。将纯化的自动水解液体C(半纤维素溶液)和来自相同的实验的纤维素水解产物用于培养。在BioStatB加5I发酵罐中以3I体积进行培养，及在其期间，搅拌设置为500rpm，pH用3MNaOH保持在5.5，在生长期间通气是1vvm，及温度35℃，在脂质生产中，其降低至28℃。
表5：生长培养基的组成
培养基组分 浓度(g/l)
半纤维素糖 20
酵母提取物 2
(NH4)2SO4 1.5
MgCl2*6H2O 1.5
K2HPO4 0.8
KH2PO4 1.5
CaCl2*2H2O 0.3
在接种之后，在真菌起始活跃地生长之前耗约30h。在培养期间，将半纤维素溶液小批加入，及在95h的培养之后，将补料改为纤维素水解产物。在培养期间，添加总共236g的半纤维素和484g纤维素水解产物。添加的部分糖在发酵结束时未被利用。在167h，当培养结束时，有16g/l的生物质，其中有43％脂质(图1)。可得出，自小麦秸秆半纤维素和纤维素糖产生微生物油成功了。在发酵开始时，酚浓度是4g/l，及在结束时是6g/l(基于半纤维素的原量计算)。因此，也可以说，尽管高抑制物浓度，达到真菌生长和有效脂质产生。
【实施例4：在含酚的半纤维素溶液上混杂细菌的生长】
用细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)做实验。培养基基本组分显示于表6。全部它们含有的这些基本营养物，及含有酚化合物的半纤维素溶液，从而酚类的终浓度是0，1，2和3g/l。
将自动水解液体C(半纤维素溶液)用于培养，和其基于HPLC分析含有160g/l糖，基于用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)的分析含有DW460g/l和33g/l酚类。
表6：生长培养基的组成
g/l
葡萄糖 20
麦芽提取物 30
胨 3
通过使用自来水制造培养基。
如此加入自动水解液体C(半纤维素溶液)，从而使得酚类的浓度是0，1，2和3g/l。在此之后，将培养基的pH使用3MNaOH调至6.5。向250ml锥形瓶分配培养基至50ml批。将培养基在121℃高压釜中灭菌15min。在冷却下来之后，通过使用0.5ml的预培养的细菌悬浮液接种各细颈瓶。就各浓度，进行并行培养。将培养物在250rpm振摇下，于28℃温育5天。每天用显微镜观察生长，及在培养结束时测定葡萄糖含量。通过将生物质离心下来，由10蒸馏水稀释上清液，和进行HPLC分析来制造糖浓度样品。
【结果】
基于显微镜观察可见，两种细菌仅在那些不含酚类的细颈瓶中生长。在培养结束时，仅在不含酚类的细颈瓶中全部糖被消耗。在含有酚类的细颈瓶中，如开始存在相同的量的糖。可得出，甚至以小浓度酚化合物抑制许多混杂细菌的有效生长。可得出，混杂细菌的生长可通过使用含有抑制性化合物，诸如酚的木质纤维素水解产物抑制或防止，化合物以不显著地抑制油性酵母和丝状真菌的生长的浓度存在(实施例2,3和6)。
【实施例5：控制辅助酚化合物的混杂和快速热处理】
通过使用脂质产生真菌株米曲霉(A.oryzae)做实验。自在PDA-平板上生长的孢子形成真菌，通过添加12ml的无菌水制造孢子悬浮液，和用接种环将孢子刮到液体中。将0.5ml的孢子悬浮液用于各细颈瓶接种。培养基组成显示于表9。
添加来自自动水解的含酚类的液体，自动水解液体A(半纤维素溶液)，从而培养基中的终浓度是3.5g/l。在此之后，将培养基的pH使用3MNaOH调至6.5。向250ml锥形瓶分配培养基至50ml批。将该酵母提取物用作通常的混杂微生物源。
表9：生长培养基组成
g/l
葡萄糖 40
酚类 3.523 -->
酵母提取物 5
(NH4)2SO4 2
MgSO4*7H2O 1.0
K2HPO4 0.5
KH2PO4 1.0
CaCl2*2H2O 0.2
将以此方式制备的培养基的一半快速加热至80℃，然后冷却下来。对于其余的培养基，不进行热处理。向一半的各不同处理的细颈瓶接种0.5ml的米曲霉(A.oryzae)孢子悬浮液。另一半的细颈瓶保持未接种。而且，制造以上描述的无酚类添加的培养基的2个细颈瓶。将其于80℃热处理，及作为其他培养物接种。将全部培养物于28℃和以160rpm振摇温育7天。每天用显微镜检查微生物生长。
【结果】
在1天的温育之后，观察到真菌在用孢子悬浮液接种的全部培养基中生长。在未用孢子热处理及不含酚类的细颈瓶中，有可观测到的量的不同混杂细菌和酵母。含酚类的培养基不被混杂。在未接种或热处理的细颈瓶中2天的温育之后，混杂酵母起始生长。在培养结束时，真菌在用孢子接种的全部细颈瓶中良好生长。在它们之中未检测到混杂微生物。在未接种的和未热处理的细颈瓶中，除了早先提及的酵母外，也检测到细菌混杂。与此相反，不含接种物但被热处理的细颈瓶保持自由生长，直到实验结束。
基于这些结果，与添加酚化合物一起80℃热处理似乎能保持无最常见的混杂微生物的基于半纤维素的培养。另一方面，必需注意到，无酚类未热处理的生长培养基容易发生混杂，如此，从卫生学观点，两种操作，酚化合物的添加和轻热处理是需要的。
【实施例6：基于半纤维素糖产生微生物油】
通过使用脂质产生真菌株米曲霉(A.oryzae)做实验。自在PDA-平板上生长的孢子形成真菌，通过添加12ml的无菌水制造孢子悬浮液，和用接种环将孢子刮到液体中。将24ml的孢子悬浮液用于6个细颈瓶的接种。培养基组成显示于表10。将接种的细颈瓶于30℃以160rpm振摇温育1天，然后用于发酵罐接种。
表10：接种培养基的组成，pH设为5.5。
g/l
半纤维素糖 40
酵母提取物 1
(NH4)2SO4 1
MgSO4*7H2O 1
K2HPO4 0.5
KH2PO4 1
CaCl2*2H2O 0.2
使用自动水解液体D(以寡聚体形式含半纤维素糖部分)，且其基于用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse,2002)的分析含有4.2g/l酚化合物。在BioStatB加5I发酵罐中以3I体积进行培养，及在此期间，搅拌设置为400rpm，pH用3MNaOH保持在5.5，通气是1vvm及温度30℃。培养基组成显示于表11。
表11：发酵培养基的组成
培养基组分 浓度(g/l)
半纤维素糖 60
酵母提取物 1
(NH4)2SO4 1
MgCl2*6H2O 1.0
K2HPO4 0.5
KH2PO4 1.0
CaCl2*2H2O 0.2
【结果】
在培养期间，小批加入半纤维素溶液。总共150g的半纤维素添加。添加的部分糖在发酵结束时未被利用。在142h，当培养结束时，有14g/l的生物质，其中有21％脂质。可得出，自小麦半纤维素糖(寡聚体形式的部分)产生微生物油成功了。在发酵中，酚化合物的浓度是2.8g/L。因此，也可以说，尽管高抑制物浓度，真菌生长和脂质产生是可能的。
【实施例7：糠醛对微生物生长的影响】
【培养条件】
在细颈瓶中，在添加糠醛的标准培养基(表12)中培育2种真菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)TKK-4和黄褐色被孢霉(Mortierellaisabellina)TKK-1及一种酵母株斯氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)TKK-1。使微生物于28℃以160rpm(对于真菌)和250rpm(对于酵母)生长6天。加入纤维素以辅助真菌以更佳形态生长。将糠醛以不同量加入培养基(0～4g/l)，和观察微生物的生长。
表12.培养基组分
培养基组分 g/l
麦芽提取物 30
胨 3
右旋糖一水合物 20
纤维素 2
【结果】
在1周之后，米曲霉(A.oryzae)TKK-4在0.5g/l糠醛中生长，但更高浓度(≥0.75g/l)完全抑制生长。黄褐色被孢霉(M.isabellina)TKK-1未在≥1g/l糠醛中生长，但在4～6天之后，在0.8g/l中观察到一些生长。斯氏油脂酵母(L.starkeyi)TKK-1最耐受糠醛。其在几天之后在1.2g/l糠醛中生长。抑制浓度是≥1.8g/l。表13显示用于以0～1.2g/l的糠醛浓度细颈瓶培养的干重浓度。
表13.当糠醛浓度是0～1.2g/l时，在以真菌米曲霉(A.oryzae)TKK-4和黄褐色被孢霉(M.isabellina)TKK-1和酵母斯氏油脂酵母(L.starkeyi)TKK-1的6天的培养之后测量的干重浓度。
【实施例8：小麦秸秆的自动水解(预调整的pH)】
通过混合20g之前研磨而过1mm筛的小麦秸秆及180g水来制备悬浮液。将悬浮液用乙酸调整至pH4.5。将悬浮液转移到高压釜反应器，然后伴随连续搅拌用加热套非-等温地加热至170℃和200℃之间的温度。在加热期间记录温度数据，及用来计算自动水解严重性(Eq.1)。将反应器冷却至大致50℃，及手动回收悬浮液而用于过滤。将液体级分和固体级分分离，和通过使用HPLC测量液体级分中的糠醛和羟甲基糠醛(HMF)。在将寡聚和多聚糖转变为单糖的稀酸水解之后测定液体级分中糖的总浓度(g/l)。将固体级分用水(0.5dm3)洗涤及施压。
对获得的固体残留物称重，采样而用于干物质测定，及固体残留物的产率(％)计算为固体残留物与为自动水解处理称重的小麦秸秆的重量比(100％*g干小麦秸秆/g干固体残留物)。通过使用Folin-Ciocalteu方法，以愈创木酚作为标准物测定液体中的可溶性酚物质。
结果显示于图2，和图3总结结果。随着自动水解严重性而固体残留物的产率降低，67％产率在最高严重性(Log(R0)＝4.4)(图2)。液体级分中单糖的浓度首先增加，然后随着增加的自动水解严重性而降低。当自动水解严重性是Log(R0)＝3.8时获得最大糖浓度(23.1g/l)。超过此自动水解严重性，液体级分中的糖浓度大大降低，及糠醛和HMF浓度突然增加，分别达到4.8g/l和0.3g/l的浓度。与糠醛和HMF的突然产生相反，可溶性酚类浓度随着增加的自动水解严重性而渐进地自0.5g/l增加达2.0g/l。
此例显示，可选择关于自动水解严重性(Log(R0))的最佳自动水解条件，以避免糠醛，HMF和可溶性酚类的过量形成，同时最大化液体级分中单糖的浓度。
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Claims (15)

1.产生脂质的方法，包括以下步骤：
(i)提供包含木质纤维素水解产物的培养基，
(ii)通过用第1微生物接种(i)的培养基来提供发酵肉汤，其中所述第1微生物是产油性微生物，
(iii)温育接种所述第1微生物的所述培养基而使脂质蓄积，
其中所述发酵肉汤包含至少一种微生物生长抑制物，且
其中所述第1微生物耐受所述微生物生长抑制物，
其中所述温育在耗氧条件下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述发酵肉汤还包含第2微生物，其不耐受所述至少一种微生物生长抑制物。
3.权利要求2的方法，其中所述第2微生物
存在于步骤(i)中提供的培养基中，或
混杂在步骤(ii)或(iii)的发酵肉汤中。
4.前述权利要求之任一项的方法，其中所述第2微生物是非-产油性微生物。
5.前述权利要求之任一项的方法，其中所述至少一种微生物生长抑制物以下列浓度存在于所述发酵肉汤中：
在所述第1微生物的耐受性范围之内、及
在所述第2微生物的耐受性范围之外。
6.前述权利要求之任一项的方法，还包括以下步骤：
在发酵肉汤中添加所述至少一种微生物生长抑制物，或
调整发酵肉汤中所述至少一种微生物生长抑制物的浓度。
7.前述权利要求之任一项的方法，其中至少一种微生物生长抑制物是作为总酚/发酵肉汤体积的浓度测量的酚化合物组。
8.权利要求7的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平是至少1g/l。
9.权利要求7或8的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～7g/l或以上范围内。
10.权利要求7～9之任一项的方法，其中所述发酵肉汤中所述酚化合物的水平在1g/l～5g/l范围内，优选在1g/l～3g/l范围内。
11.前述权利要求之任一项的方法，其中所述第1微生物选自：丝状真菌、酵母、细菌和藻。
12.前述权利要求之任一项的方法，其中所述第1微生物选自：被孢霉属(Mortierella)、曲霉属(Aspergillus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢属(Rhodosporidium)和隐球菌属(Cryptococcus)。
13.权利要求2～12之任一项的方法，其中所述第2微生物是非-油性的，选自：细菌、酵母、丝状真菌或微藻。
14.权利要求2～13之任一项的方法，其中所述第2微生物是选自下列的细菌：芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)。
15.前述权利要求之任一项的方法，其中所述第1微生物能产生及蓄积多于15％其重量的脂质。
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