CN111154664A - 一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株是酿酒酵母经阿魏酸抑制物培养基适应性进化后，得到的对阿魏酸耐受性明显提高的菌株，分类命名为Saccharomyces cerevisiae PAT02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18022。所述酿酒酵母菌株能够耐受阿魏酸，在应用于含有阿魏酸的发酵体系时，生长性能和阿魏酸降解速率均高于原始菌株。

Description

一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于在生物技术的领域，具体涉及一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株及其在阿魏酸耐受发酵菌剂中的应用。
背景技术
木质纤维素类生物质因其资源丰富、环境友好和可再生等特点，已经成为目前最具发展潜力的化石资源替代品之一。生物质资源的转化和利用对国家的能源安全和发展有着重大意义。木质纤维素在酶解转化为微生物可发酵的糖类物质前需要进行高温高压和酸碱作用的预处理破坏其复杂致密的结构。但预处理同时会产生对微生物有抑制作用的副产物，包括：酚类、呋喃类和有机弱酸。其中，酚类与其他两类抑制物相比，具有毒性强、抑制物种类多、常规方法（水洗法，生物降解法）难去除等特点，已成为影响微生物利用木质纤维素生物质生产燃料和大宗化学品的重要问题之一。
阿魏酸是一种广泛存在于各种植物细胞壁中的酚类化合物，其作为木质素的主要成分与半纤维素中阿拉伯木聚糖侧链形成共价键相连。在不同种类的木质纤维素生物质（玉米秸秆、甘蔗渣、玉米芯、云杉、杨木和松木）经不同预处理方式（稀酸、稀碱、碱性过氧化氢和水热处理等）所得的水解物中，阿魏酸广泛出现，并在酚类抑制物中含量较高（Bioresource Technology, 2016, 199: 103-112）。另外，在预处理产生的酚类抑制物中，阿魏酸对酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母、乳酸菌和大肠杆菌等模式微生物的生长和发酵性能产生强烈的抑制作用。尽管，酿酒酵母能够通过苯基丙烯酸脱羧酶和阿魏酸脱羧酶对阿魏酸进行降解，但是当阿魏酸浓度超过0.25g/L（1.3mM）时，就会对其生长和乙醇发酵产生明显的抑制作用，当阿魏酸浓度为1.56g/L（8.0mM）时导致酵母细胞生长完全停滞。过表达上述酶的编码基因PAD1和FDC1虽然能够提高酵母对阿魏酸的降解速率，但是对其生长和发酵的改善并不显著（Applied Microbiology Biotechnology, 2001, 57:167-174）。
已有文献报道通过长期适应性进化方法获得耐受乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛的酿酒酵母菌株（Biotechnology for Biofuels, 2012, 5: 32; Biotechnology forBiofuels, 2016, 9: 173.）。但是，对酚酸类抑制物，特别是提高阿魏酸耐受性并没有利用进化工程策略构建耐受性酵母菌株的相关研究报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株，及其在耐受阿魏酸的发酵菌剂中的应用。以期进一步解决木质纤维素类生物质预处理后水解物中阿魏酸对酿酒酵母生长和发酵强烈抑制作用的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株，所述菌株的分类命名为Saccharomyces cerevisiae PAT02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18022。
本发明还提供上述的酿酒酵母菌株PAT02在制备阿魏酸耐受生物发酵菌剂中的应用。
上述应用中，所述菌剂对于阿魏酸的耐受上限浓度是2.20g/L。
本发明提供的酿酒酵母菌株，具有如下有益效果：
1、本发明的酿酒酵母菌株PAT02比原始菌株对阿魏酸耐受性明显增强，对阿魏酸耐受浓度上限为2.20g/L，能在含有阿魏酸的培养基中快速生长、发酵乙醇和降解阿魏酸，并且耐受性状能够稳定遗传；并能够在含有阿魏酸的木质纤维素预处理产物中进行发酵，表现出良好的生长和发酵性能；
2、培养基中阿魏酸浓度为1.29g/L时，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率、乙醇生产速率和阿魏酸降解速率分别比原始菌株提高1.0、1.9、0.5、0.6和5.1倍。
保藏信息：
保藏编号CGMCC No.18022，分类命名为Saccharomyces cerevisiae ，株：PAT02，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为实施例2中酵母菌株PAT02和原始酵母菌株在含有阿魏酸的合成培养基平板上菌落生长状况的对比示意图。
图2为实施例2的阿魏酸耐受性遗传稳定性验证中酵母菌株PAT02和原始酵母菌株的OD600吸光值的对比示意图。
图3为实施例2中酵母菌株PAT02和原始酵母菌株在阿魏酸培养基中葡萄糖和乙醇浓度随时间变化的对比示意图。
图4为实施例2中酵母菌株PAT02和原始酵母菌株在阿魏酸培养基中阿魏酸浓度随时间变化的对比示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供一种耐受阿魏酸的酿酒酵母，其特征在于能在含有阿魏酸的发酵体系中快速生长和发酵，同时能够快速降解阿魏酸，从而降低其对酿酒酵母的抑制作用。所述菌种分类命名为Saccharomyces cerevisiae PAT02，已于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18022，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
酿酒酵母菌株PAT02的选育是通过进化工程策略实现的，将原始酿酒酵母菌株置于含有阿魏酸抑制物培养基中进行长期驯化培养，并逐步提高培养基中阿魏酸的浓度，最终通过阿魏酸浓度梯度平板筛选耐受性更强的优良菌株。
实施例1 酿酒酵母适应性进化
获得耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株PAT02的适应性进化方法，包括以下步骤：
（1）合成培养基的配置：每升培养基中无水葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸铵1g，酵母浸粉10g；在121℃灭菌20分钟。
（2）阿魏酸培养基的配置：在上述灭菌后的合成培养基中添加阿魏酸，使培养基中阿魏酸浓度为（0.94-1.79g/L），制成阿魏酸培养基。
（3）酿酒酵母对阿魏酸适应性进化：将酿酒酵母干粉（湖北宜昌安琪酵母有限公司）进行活化培养，其中活化培养条件：在合成培养基中30℃，150转/分的条件下培养18小时，获得菌体密度为OD600吸光值6.0-7.0的原始酵母菌株，然后以10%的接种量转接到0.94g/L阿魏酸的培养基中进行适应性进化培养，其中适应性进化培养条件为30℃，150转/分培养，每培养12小时后，以10%接种量转接到新鲜的阿魏酸培养基中继续培养，直到酵母菌株生长和发酵状况明显改善，并在5次转接培养过程中保持稳定，该过程经过转接培养68批次。然后将其转接到1.29g/L的阿魏酸培养基中继续转接培养，经过64次转接培养，得到阿魏酸耐受性菌液。
（4）阿魏酸浓度梯度平板筛选：将步骤（3）所得菌液稀释涂布在最高浓度为1.79g/L的阿魏酸浓度梯度平板上，在30℃恒温培养48小时；挑取生长在高浓度抑制物一侧较大的单菌落进行菌种保存。最终获得对阿魏酸具有显著耐受性的酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae PAT02）。
实施例2 酵母菌株PAT02对阿魏酸耐受性验证
（1）点滴阿魏酸平板生长比较：将活化18小时的酵母菌株PAT02和原始酵母菌株细胞密度调节为OD600吸光值6.0，然后将细胞悬液依次稀释（10-1、10-2、10-3），并吸取5μL菌液分别滴加到不同浓度的阿魏酸培养基平板上，30℃培养24小时。如图1所示，酵母菌株PAT02的菌落生长状况明显优于原始酵母菌株。
（2）阿魏酸耐受性遗传稳定性验证：将活化18小时的酵母菌株PAT02在不含阿魏酸的合成培养基中连续转接培养6次，其中培养条件：30℃，150转/分，每次培养12小时，然后将其与原始酵母菌株分别以10%接种量转接到含有1.29g/L阿魏酸的培养基中培养24小时，在设定时间取样1mL，10000转/分种离心5分钟。上清液用于液相色谱分析葡萄糖和乙醇含量，菌体用于测定OD600吸光值。
其中，样品上清液稀释10倍，用0.22μm的滤膜过滤，待测。样品中葡萄糖和乙醇含量利用配有示差检测器的液相色谱检测，检测条件：色谱柱为Aminex-HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱温箱温度为65℃，流动相为0.005mol/L稀硫酸，流速为0.60mL/分钟，进样量为20μL。
样品中阿魏酸利用配有二极管阵列检测器的液相色谱检测，检测条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18（150mm×4.6mm，5μm），柱温箱温度为25℃，检测波长为280nm，流动相A为甲醇：乙酸：水=9:1:90，流动相B为甲醇：乙酸：水=90:1:9。流动相梯度洗脱条件：流动相A梯度100%-75%，0-25分钟；75%-30%，25-40分钟；30%-0%，40-45分钟。流速为1mL/分钟，进样量为20μL。
如图2、图3和图4所示，在消除阿魏酸压力胁迫连续培养6次后，重新接种到含有1.29g/L阿魏酸的培养基中，适应进化酵母菌株PAT02仍然能够保持良好的阿魏酸耐受性，其比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别比原始菌株提高1.0、1.9、0.5和0.6倍。另外，所述酵母PAT02能够快速降解阿魏酸，其阿魏酸降解速率比原始菌株提高5.1倍。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，对阿魏酸具有明显耐受性；所述菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae TPA02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18022。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌株在制备阿魏酸耐受生物发酵菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌剂对于阿魏酸的耐受上限浓度是2.20g/L。
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