CN106544370A - 一种降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法及基于此方法制备纤维素乙醇 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化工程及发酵工程领域,具体公开了一种降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,通过用葡萄糖氧化酶处理木质纤维素碱法预处理液来实现,具体包括如下步骤,S1:木质纤维素加入碱液进行处理得预处理液;S2:将葡萄糖氧化酶加入步骤S2中的预处理液中进行反应。本发明还公开了基于降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法制备纤维素乙醇的工艺,在不需要更换反应容器的前提下,仅仅通过在预处理液中加入一定量的葡萄糖氧化酶便能很大程度消除副产物的抑制效应,从而实现木质纤维素到乙醇的高效转化。
Description
技术领域
本发明涉及生化工程及发酵工程领域,尤其涉及一种降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法及基于此方法制备乙醇。
背景技术
木质纤维素由于其来源广泛、含量丰富、可再生,成为一种理想的替代化石能源的原料物质。以木质纤维素为原料生产生物乙醇、生物丁醇、生物合成气等替代能源成为世界各国的研究热点。由于乙醇可以以各种比例与汽油混合直接用于现有发动机,而且可以经由微生物发酵生产,因此以木质纤维素生产燃料乙醇成为研究的焦点之一。
可以用做生产燃料乙醇原料的木质纤维素主要为农林业废弃物,如农作物秸秆、甘蔗渣、木材加工废弃物等。木质纤维素作为地球上储量最大的可再生能源,占全球每年生物质产量约90%。木质纤维素主要由纤维素(40%~50%)、半纤维素(20%~30%)和木质素(20%~28%)三种高聚物通过共价和非共价结合而成。天然状态下的木质纤维素中,纤维素一般被包埋在木质素、半纤维素等形成的聚合物中,共同组成复杂的网状结构。这种结构在维持植物形态及抵御外来侵害中发挥积极作用,但是由于纤维素酶的底物是非结晶态的单链纤维素分子,所以天然木质纤维素的结构反而在纤维素降解过程中成为障碍。因此木质纤维素原料必须经过预处理步骤,以去除包裹纤维素的木质素和半纤维素,同时打开纤维素的结晶区,从而使纤维素暴露给纤维素酶进行水解糖化。
综合考虑各种方法的操作难易程度以及经济成本因素,稀酸和碱处理是目前获得关注最多的处理方法,但这两种预处理方法,都会导致木质纤维素的三种主要成分不同程度的降解和产生一系列化学反应,从而生成多种副产物,而这些副产物往往对酶解和发酵过程具有抑制作用,限制了其推广应用。因此,探索消除副产物对酶解和发酵的抑制的方法,是当前国内外木质纤维素预处理领域的研究热点。
木质纤维素的预处理过程中产生的副产物抑制物大多由半纤维素和木质素的分解产生,主要分为三类:i)来源于戊糖和己糖的呋喃衍生物,包括糠醛(furfural)和羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF);ii)有机酸(又称脂肪酸,aliphatic carboxylicacids),包括来源于半纤维素的乙酸和由糠醛或羟甲基糠醛进一步降解形成甲酸、乙酰丙酸等;iii)来源于木质素的酚类和芳香类化合物。研究表明,糠醛和羟甲基糠醛主要影响发酵过程的氧化还原平衡以及抑制糖酵解酶的活性;有机酸主要抑制酵母的生长及乙醇的生成;酚类化合物则通过影响细胞膜的通透性从而影响酵母的生长及发酵。酵母等微生物能够代谢有机酸及糠醛、HMF,并将其转换为毒性更低的化合物,因此相对毒性较低,但高浓度存在时仍会产生抑制作用。
与来源于纤维素和半纤维素的副产物相比,酚类化合物虽然浓度低,但是毒性却大很多。例如,阿魏酸(ferulic acid)产生对酵母抑制效应的浓度比甲酸、乙酸和乙酰丙酸所需浓度低两个数量级(1mM vs 100mM),而松柏醛(coniferyl aldehyde)只需要0.1mM即可对酵母产生抑制作用。
为了解决副产物抑制的问题,通常需要采用脱毒步骤来对预处理的原料进行脱毒。常用的脱毒方法包括物理法、化学法和生物法。通过真空蒸发,可以去除木材水解液中的98%以上的糠醛及部分乙酸;活性炭吸附可以除去95%的酚类化合物;用膜吸附去除玉米秸秆水解液中60%的乙酸。饱和生石灰(over-liming)是比较常用的化学脱毒法,能去除木质纤维素水解液中大部分的糠醛;但由于吸附作用,会造成约10%的可发酵糖的损失。大多数的物理或化学脱毒方法都有一个缺点,就是需要额外的处理步骤,这不仅加大工艺的复杂性,而且带来试剂、能源上的额外消耗。生物法是使用漆酶和过氧化物酶或白腐菌等微生物来通过氧化降解水解液中的酚类化合物,不需要新增设备和操作,然而目前的生物法耗时长,条件苛刻影响了其广泛应用。
在此背景下,为改进木质纤维素转化乙醇的工艺,尤其针对目前脱毒工艺繁琐、耗时、废水、耗能的缺点,本发明提出对木质纤维素碱法预处理液进行新型生物脱毒的方法,只需要增加一步酶解反应,即可完成脱毒,消除副产物对纤维素酶和酵母发酵能力的抑制。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种能降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法及基于此方法制备纤维素乙醇的工艺。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下方案实现:
一种降低木质纤维素减法预处理液中副产物抑制效应的方法,用葡萄糖氧化酶处理木质纤维素碱法预处理液。所述的碱法预处理液为现有技术中采用的碱液对木质纤维素进行预处理,以去除包裹纤维素的木质素和半纤维素,并打开纤维素的结晶区,使得纤维素暴露给纤维素酶进行水解糖化。如背景技术中提及到的,木质纤维素经过碱法处理后会产生多种对后续纤维素酶酶解和酵母发酵产生抑制效应的副产物,本发明创新地添加葡萄糖氧化酶(GOD)对预处理液进行生物脱毒,不仅降解了预处理液中的酚类化合物,而且还能代谢有机酸、糠醛、羟甲基糠醛等大多数副产物,大大降低了副产物的含量。本发明工艺简单,只需在利用碱法处理木质纤维素后添加葡萄糖氧化酶进行反应,即可完成脱毒,消除副产物对纤维素酶酶解和酵母发酵的抑制。
具体的,包括如下步骤:
S1:木质纤维素加入碱液进行处理得预处理液;所述的碱液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、乙醇钾等,均可根据现有技术进行选择;碱法处理涉及到的用量配比、温度、时间等条件,同样根据现有技术进行选择即可;
S2:将葡萄糖氧化酶加入步骤S2中的预处理液中进行反应。
上述步骤S2中,在葡萄糖氧化酶加入预处理液前先将预处理液冷却至室温并调节pH至4.5-5.5。碱法处理后的预处理液具有较高的温度以及较高碱性,会抑制葡萄糖氧化酶的活性,因此需要将温度以及酸碱性调节至合理范围以提供更适宜的环境。
进一步的,步骤S2中,使用浓磷酸对pH进行调节。葡萄糖氧化酶能降解预处理液中的酚类化合物,但是酚类化合物只是预处理液中副产物中的一种,其中还含有大量的有机酸、糠醛、羟甲基糠醛等。虽然在后续酵母等微生物发酵过程中,能代谢有机酸、糠醛、羟甲基糠醛等,但是有机酸、糠醛、羟甲基糠醛等浓度较高时,酵母等微生物不能完全将它们代谢,继而对发酵产抑制。发明人发现,使用浓磷酸对pH进行调节后,相对于硫酸,具有更好的pH缓冲容量,有利于维持pH的稳定,从而有利于葡萄糖氧化酶及后续纤维素酶的活性保持,便于将有机酸、糠醛、羟甲基糠醛等进行降解代谢,最大程度上消除这部分副产物的抑制效应;相比于稀磷酸,用量少,可以尽可能减少体积,从而提高后续纤维素酶解所得的可发酵糖的浓度,可以节省乙醇蒸馏过程的能耗。
再进一步的,步骤S2中,相混合的葡萄糖氧化酶和预处理液反应24~48h。葡萄糖氧化酶和预处理液的用量比例、反应温度、搅拌速度等都可根据有限次试验作出选择,而正是由于使用了葡萄糖氧化酶来处理预处理液,能在较短时间内最大程度上(24~48h)完成对副产物的降解。
一种利用木质纤维素生产乙醇的方法,包括如下步骤:
ⅰ)木质纤维素碱法预处理及脱毒:采用上述降低木质素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法进行处理;
ⅱ)纤维素酶酶解:往步骤ⅰ)中的体系加入纤维素酶进行酶解;
ⅲ)微生物发酵:往步骤ⅱ)中的体系接种酿酒酵母进行发酵。
步骤ⅱ)中酶解60~80h。
步骤ⅲ)中发酵20~30h。
纤维素酶和酿酒酵母的用量、反应过程的温度、搅拌速度等都可根据现有技术作出选择,经过对木质纤维素预处理中进行脱毒后,降低了其中的副产物对纤维素酶酶解和酿酒酵母发酵的抑制,加速了酶解与发酵的速度,从而可以在短时间内达到酶解和发酵的目的;再者,由于使用葡萄糖氧化酶进行脱毒处理,不需要专门的去除副产物以及水洗等步骤,与现有的木质纤维素生产乙醇的工艺相比,本发明具有操作更为简便、设备需求更简单、能耗及水耗低等优点。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明首次将葡萄糖氧化酶(GOD)应用于木质纤维素碱法预处理液中进行生物脱毒,去除预处理液中副产物对纤维素酶以及酿酒酵母的抑制。本发明利用葡萄糖氧化酶的脱毒能力构建一种在不更换反应容器的情况下,仅仅通过在碱法预处理后加入一定量的葡萄糖氧化酶便能很大程度消除副产物的抑制效应,在同一反应体系中实现木质纤维素预处理、脱毒、酶解及发酵生产乙醇等全部工艺,相比于现有常用的水洗脱毒、化学脱毒等方法,此工艺具有操作简单、环境友好、水耗低、易于实现自动化控制以及易于扩大反应规模等优点,有助于推动木质纤维素乙醇的工业化应用。
附图说明
图1为由木质纤维素生产乙醇流程图;
图2为实施例1数据图;
图3为实施例2数据图;
图4为实施例3数据图;
图5为对比例1数据图。
具体实施方式
为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合附图对本发明作进一步阐述。
实施例1
GOD处理1%NaOH预处理的甘蔗渣并发酵生产乙醇
S1:精确称取甘蔗渣2.5g,以10:1的液固比(底物浓度10%(w/v))加入1%NaOH溶液,在121℃下处理甘蔗渣1h,于室温冷却得预处理液;
S2:无菌条件下,往预处理液中添加市售浓磷酸,调节pH约为5,然后添加10U GOD,30℃,200rpm脱毒反应24h;
S3:无菌条件下,往上述预处理液中加入纤维素酶,酶添加量和底物的比值固定为6mg酶/g底物,然后置于恒温摇床内,45℃,160rpm水解72h;水解过程中取样测定甘蔗渣酶解情况;
S4:然后补加蛋白胨至终浓度为20g/L,并按菌体量为20g湿重/L的量将预先活化的酿酒酵母菌体悬液接入到步骤S3中的酶解液中,30℃,200rpm下进行发酵48h,发酵过程取样检测乙醇发酵的情况。
本实施例重复三次,以不加GOD处理的样品为对照组,以高效液相色谱检测甘蔗渣酶解情况及乙醇产量,结果如图2(空心的为GOD处理的样品,实心为对照组)。由于预处理所用NaOH浓度较低,产生的副产物对纤维素水解酶及酿酒酵母发酵的抑制不明显;不经过GOD处理,也能有葡萄糖(16.6g/L)和乙醇(7.1g/L)生成,但加入GOD可以在一定程度提高了葡萄糖(20.6g/L)和乙醇(8.3g/L)的产量。
实施例2
GOD处理2%NaOH预处理的甘蔗渣并发酵生产乙醇
S1:精确称取甘蔗渣2.5g,以10:1的液固比(底物浓度10%(w/v))加入2%NaOH溶液,在121℃下处理甘蔗渣1h,于室温冷却得预处理液;
S2:无菌条件下,往预处理液中添加市售浓磷酸,调节pH约为5,然后添加15U GOD,30℃,200rpm脱毒反应24h;
S3:无菌条件下,往上述预处理液中加入纤维素酶,酶添加量和底物的比值固定为6mg酶/g底物,然后置于恒温摇床内,45℃,160rpm水解72h;水解过程中取样测定甘蔗渣酶解情况;
S4:然后补加蛋白胨至终浓度为20g/L,并按菌体量为20g湿重/L的量将预先活化的酿酒酵母菌体悬液接入到步骤S3中的酶解液中,30℃,200rpm下进行发酵48h,发酵过程取样检测乙醇发酵的情况。
本实施例重复三次,以不加GOD处理的样品为对照组,以高效液相色谱检测甘蔗渣酶解情况及乙醇产量,结果如图3(空心的为GOD处理的样品,实心为对照组)。不经过GOD的处理,由于NaOH浓度增加,产生的副产物对纤维素水解酶及酿酒酵母发酵的抑制更加明显,酶解48h后葡萄糖浓度只达到2.2g/L,而且检测不到乙醇的产生;经过GOD处理后,纤维素酶的活性得到恢复,酶解48h后葡萄糖浓度达到25.2g/L,最终乙醇浓度达到9.9g/L。
实施例3
GOD处理3%NaOH预处理的甘蔗渣并发酵生产乙醇
S1:精确称取甘蔗渣2.5g,以10:1的液固比(底物浓度10%(w/v))加入3%NaOH溶液,在121℃下处理甘蔗渣1h,于室温冷却得预处理液;
S2:无菌条件下,往预处理液中添加市售浓磷酸,调节pH约为5,然后添加25U GOD,30℃,200rpm脱毒反应24h;
S3:无菌条件下,往上述预处理液中加入纤维素酶,酶添加量和底物的比值固定为6mg酶/g底物,然后置于恒温摇床内,45℃,160rpm水解72h;水解过程中取样测定甘蔗渣酶解情况;
S4:然后补加蛋白胨至终浓度为20g/L,并按菌体量为20g湿重/L的量将预先活化的酿酒酵母菌体悬液接入到步骤S3中的酶解液中,30℃,200rpm下进行发酵48h,发酵过程取样检测乙醇发酵的情况。
本实施例重复三次,以不加GOD处理的样品为对照组,以高效液相色谱检测甘蔗渣酶解情况及乙醇产量,结果如图4(空心的为GOD处理的样品,实心为对照组)。不经过GOD的处理,由于NaOH浓度进一步增加,产生的副产物完全抑制纤维素水解酶及酿酒酵母发酵,完全检测不到葡萄糖的生成,也没有检测到乙醇的生成;经过GOD处理后,纤维素酶的活性得到恢复,酶解48h后葡萄糖浓度达到25.9g/L,最终乙醇浓度达到10.3g/L。
对比例1
本对比例与实施例3类似,区别在于,步骤S3中,分别使用40U和100U漆酶替代GOD。
本实施例重复三次,以不加漆酶处理的样品为对照组,以高效液相色谱检测甘蔗渣酶解情况及乙醇产量,结果如图5(空心的为100U漆酶处理的样品,交叉为40U漆酶处理的样品,实心为对照组)。由于NaOH浓度较高,产生的副产物完全抑制纤维素水解酶及酿酒酵母发酵,完全检测不到葡萄糖的生成,也没有检测到乙醇的生成;即使经过40U的漆酶处理,抑制情况没有任何改善,仍然检测不到葡萄糖和乙醇;加入100U漆酶处理后,纤维素酶的活性得到一定恢复,酶解48h后葡萄糖浓度为17.4g/L,最终乙醇浓度达到7.9g/L。无论是葡萄糖还是乙醇产量,均不及25U GOD处理的结果。
上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,其特征在于,用葡萄糖氧化酶处理木质纤维素碱法预处理液。
2.根据权利要求1所述的降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
S1:木质纤维素加入碱液进行处理得预处理液;
S2:将葡萄糖氧化酶加入步骤S2中的预处理液中进行反应。
3.根据权利要求2所述的降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,其特征在于,步骤S2中,加入葡萄糖氧化酶前先将预处理液冷却至室温并调节pH至4.5-5.5。
4.根据权利要求3所述的降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,其特征在于,步骤S2中,使用浓磷酸进行pH调节。
5.根据权利要求4所述的降低木质纤维素碱法预处理液中副产物抑制效应的方法,其特征在于,步骤S2中,相混合的葡萄糖氧化酶和预处理液反应24~48h。
6.权利要求1至5任一项所述方法在乙醇生产中的应用。
7.一种利用木质纤维素生产乙醇的方法,其特征在于,包括如下步骤:
ⅰ)木质纤维素碱法预处理及脱毒:采用权利要求1至5任一项所述的方法进行处理;
ⅱ)纤维素酶酶解:往步骤ⅰ)中的体系加入纤维素酶进行酶解;
ⅲ)微生物发酵:往步骤ⅱ)中的体系接种酿酒酵母进行发酵。
8.根据权利要求7所述的利用木质纤维素生产乙醇的方法,其特征在于,步骤ⅱ)中酶解60~80h。
9.根据权利要求8所述的利用木质纤维素生产乙醇的方法,其特征在于,步骤ⅲ)中发酵20~30h。
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