CN112624949B - 手性二芳基-β-内酰胺类化合物及其制备方法和制药用途 - Google Patents

手性二芳基-β-内酰胺类化合物及其制备方法和制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于新药研发中合成药物化学领域，涉及如下通式结构的具有抗肿瘤活性的新型手性二芳基‑β‑内酰胺类化合物及其在抗肿瘤药物研发中的应用。本发明还包括所述化合物、其药学盐及其复方药物在制备预防或治疗与肿瘤相关疾病的药物中的应用。本发明提供的化合物或其在药学上可接受的盐能通过抑制微管蛋白聚集抑制肿瘤细胞增殖的调控机制，在体外、体内有效抑制裸鼠移植肿瘤的生长，可用于制备预防或治疗与肿瘤相关疾病的药物；所述与肿瘤相关疾病包括良、恶性肿瘤以及肿瘤引起的其他疾病。

Description

手性二芳基-β-内酰胺类化合物及其制备方法和制药用途
技术领域
本发明属于新药研发合成药物化学领域，涉及具有抗肿瘤活性的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物、制备方法、体内外抗肿瘤活性以及该类化合物及其可接受的药学盐或以其为成分之一的复方药物在制备预防和治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
背景技术
据资料记载，2018年9月世界卫生组织于美国《CA:A Cancer Journal forClinicians》杂志在线发表了《Global Cancer Statistics 2018》报告，报道了全球癌症的发病情况日益严峻，其中2018年新发病例高达1810万，同期死亡病例高达 960万。由于人口老龄化、吸烟、不健康饮食等因素，预测到2030年全世界每年新增病例将达2200万例，同期癌症的死亡人数也将从每年的960万例上升至 1300万例。
业内共识，癌症的发生与发展是一复杂的过程，其诱发因素多种多样，既有基因遗传与变异等内在因素，又有饮食习惯与生活环境等外在因素。目前的干预治疗手段也多种多样，包括手术切除、放射疗法以及化疗等；其中化疗是癌症治疗最为常见的一种手段，即采用一种或多种具有细胞毒性的抗肿瘤药物对癌症患者进行治疗。经过几十年的发展，被批准上市的抗肿瘤药物已有近百种，但是由于其易引起耐药性和缺乏选择性等缺点，传统的抗肿瘤药物并不能满足临床的需要；因此，克服传统化疗药物的缺点，寻找到更为高效、低毒的新型抗肿瘤药物是新药研发的热点和急需解决的重要问题。近年来以微管为靶点的新型抗肿瘤药物成为了抗肿瘤药物研究的热点之一，特别是以治疗实体瘤最有效的药物——紫杉醇、长春新碱为代表，更显示出微管作为肿瘤治疗的药物靶点具有十分优秀的效果和潜力。
研究报道了微管(Tubulin)是构成细胞骨架的主要成分，是由α-微管蛋白与β-微管蛋白异二聚体聚合形成的细长中空管状蛋白；在细胞内，微管以其特有的聚集和解聚的动力学特性，在保持细胞形态、细胞运动以及细胞分裂与增殖等方面发挥不可或缺的作用，特别是在细胞有丝分裂过程中，α-微管蛋白与β-微管蛋白不断的聚合与解聚引起微管的运动，运动的微管将复制出的两套DNA分别迁移至细胞两级，最终完成细胞的分裂与增殖；恶性肿瘤细胞生长速度极快，细胞有丝分裂与转移异常旺盛，因此以微管为靶标，打破微管蛋白聚合与解聚的动态平衡，影响微管的正常生理功能，即可有选择性地抑制肿瘤细胞的分裂增殖 (Science2013,339,587-590)。
据最新研究表明，有关微管蛋白聚集抑制剂的研究尤其是针对康普立停(CombretastatinA-4)的结构改造研究已取得了大进展，其中康普立停的磷酸酯二钠盐(CA-4P)与BNC105的磷酸酯二钠盐(BNC105P)已分别进入III期和 II期临床试验，用于多种实体瘤的治疗(J.Med.Chem.2016,59,8685-8711)；但该些药物仍具有一定毒副作用，在延长患者生存期等方面也存在不足，截止目前尚无一个药物被批准上市。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供具有显著抗肿瘤活性的新型手性二芳基-β-内酰胺类微管蛋白聚集抑制剂以及血管生成抑制剂，具有较好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供新型微管蛋白聚集抑制剂以及血管生成抑制剂，具体涉及具有显著抗肿瘤活性的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物及其制备方法以及该类化合物及其药学盐或以其为成分的复方药物在制备预防和治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
本发明提供了下述通式Ⅰ结构的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物或其药学盐，
其中，R取自烷氧基、取代烷氧基、卤素、氨基、烷氨基、磺酰氨基、酰氨基。 R’取自羟基、烷氧基、氨基、烷氨基、卤素、烷基、氢。
本发明中，优选的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物具有通式Ⅱ结构，
其中，R基团为氢原子、烷基、烷基酰基、氨基取代的烷酰基、羧基取代的烷酰基、环烷基酰基、芳酰基、取代芳酰基、磺酰基。R’取自羟基、烷氧基、氨基、烷氨基、卤素、烷基、氢。优选化合物为：
本发明中，优选的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物还具有通式Ⅲ的结构，
其中，R基团取自烷基、环烷基、卤素取代的烷基、苯基以及取代的苯基。R’取自羟基、烷氧基、氨基、烷氨基、卤素、烷基、氢。优选化合物为：
本发明中，优选的新型手性二芳基-β-内酰胺类化合物还具有通式Ⅳ的结构，
其中，X基团为F、Cl、Br、I。R取自羟基、烷氧基、氨基、烷氨基、卤素、烷基、氢。优选化合物为：
本发明中所述的“药学上可接受的盐”，具体地可列举为与苹果酸、乳酸、樟脑磺酸、枸橼酸、富马酸、草酸等有机酸，以及磷酸、氢卤酸、硫酸、硝酸等无机酸形成的盐。
本发明提供了手性二芳基-β-内酰胺类化合物及其制备方法，本发明的一个实施例中，参照文献(J.Med.Chem.2016,59,10329-10334)方法，按如下路线合成目标化合物1：
试剂与条件:(a)Pd2(dba)3(1％),(R,R,R)-Ph-SKP(2.5％),K2CO3(aq.),CH2Cl2,25℃, 3h；(b)Sn[N(TMS)2]2,toluene,reflux,3h；(c)TBAF,THF,0℃,1h；(d)i)BnCl, K2CO3,MeCN,reflux,12h；ii)B2(pin)2(1.3equiv),CuCl(5％),MeOH(1.5equiv), PPh3(15％),t-BuOLi(10％),THF,25℃,12h；iii)NaBO3·4H2O,H2O,THF,25℃,2 h；(e)Isoindoline-1,3-dione,DIAD,PPh3,THF,25℃,3h；(f)N2H4.H2O,EtOH,reflux, 4h；(g)Pd/C,H2,EtOH,25℃,12h.。
本发明通过抑制微管蛋白聚集抑制肿瘤细胞生长的调控机制及其在体外、体内的抗肿瘤实验证实，所述的新型手性反式二芳基-β-内酰胺类化合物或其在药学上可接受的盐对肿瘤具有显著的增殖抑制作用和血管生成抑制作用。
本发明的进一个目的是提供上述化合物或这些化合物在药学上可接受的盐以及包含该化合物或其盐的组合物用于制备预防或治疗与肿瘤相关疾病的药物中的应用。
所述的与肿瘤相关疾病具体可列举为甲状腺癌、淋巴瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、脑胶质瘤、鼻咽癌，神经内分泌癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、骨肉瘤、间质肉瘤、绒癌、恶性葡萄胎、恶性畸胎瘤、胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、未分化癌以及良性肿瘤等，但不受限于此。
本发明提供并证明了具有显著抗肿瘤作用的新型手性反式二芳基-β-内酰胺类化合物或其在药学上可接受的盐，通过抑制微管蛋白聚集抑制肿瘤细胞生长的调控机制及其在体外、体内的抗肿瘤实验中对肿瘤具有显著的增殖抑制作用和血管生成抑制作用。所述化合物或这些化合物在药学上可接受的盐以及包含该化合物或其盐的组合物可用于制备预防或治疗与肿瘤相关疾病的药物。
附图说明
图1.化合物21体外抑制微管自组装实验——吸光度-时间曲线。
图2.免疫荧光法检测化合物21对微管蛋白形态的影响。
图3.化合物21对肿瘤细胞集落生成的抑制。
图4.化合物21对HUVEC细胞生成血管的抑制。
图5.化合物21对肿瘤细胞周期的影响。
图6.化合物21对肿瘤细胞周期相关蛋白表达的影响。
图7.化合物21诱导细胞凋亡测试。
图8.化合物21对凋亡相关蛋白表达的影响。
图9.化合物21的体内抗肿瘤实验。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。这些实施例只是用于进一步说明本发明，并不改变本发明的保护范围。本发明目标化合物的制备方法可以进一步用代表性化合物制备过程体现如下：
实施例1(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-氨甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基) 氮杂环丁烷-2-酮(1)的合成
参照文献(J.Med.Chem.2016,59,10329-10334)方法，本发明按如下路线合成目标化合物1：
试剂与条件:(a)Pd2(dba)3(1％),(R,R,R)-Ph-SKP(2.5％),K2CO3(aq.),CH2Cl2,25℃, 3h；(b)Sn[N(TMS)2]2,toluene,reflux,3h；(c)TBAF,THF,0℃,1h；(d)i)BnCl, K2CO3,MeCN,reflux,12h；ii)B2(pin)2(1.3equiv),CuCl(5％),MeOH(1.5equiv), PPh3(15％),t-BuOLi(10％),THF,25℃,12h；iii)NaBO3·4H2O,H2O,THF,25℃,2 h；(e)Isoindoline-1,3-dione,DIAD,PPh3,THF,25℃,3h；(f)N2H4.H2O,EtOH,reflux, 4h；(g)Pd/C,H2,EtOH,25℃,12h.
1.1(S)-2-[1-(3-叔丁基二甲基硅氧基-4-甲氧基苯基)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)甲基]丙烯酸乙酯(1c)的合成
在50mL Schlenk管中加入原料1a(0.65g,1.59mmol)，3,4,5-三甲氧基苯胺(1b,0.43g,2.07mmol)，碳酸钾(0.66g,4.77mmol)，Pd2(dba)3(0.07g,0.02 mmol)和(R,R,R)-Ph-SKP(0.03g,0.04mmol)，三次抽换气后使体系充满干燥的氮气，后向体系注入无氧二氯甲烷7mL。继续在氮气保护下室温反应3小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，Na2SO4干燥。旋蒸浓缩后柱层析分离(PE/EA3:1)，得到无色油状液体(1c)0.73g，收率85％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.92(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),6.82(d,J＝2.1Hz,1H), 6.80(d,J＝8.3Hz,1H),6.34(s,1H),5.88(s,1H),5.81(s,2H),5.28(s,1H),4.15(q,J＝7.1Hz,2H),3.77(s,3H),3.77(s,6H),3.74(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H),0.96(s,9H),0.11(s,6H).ESI-MS(m/z):532.1(M+H+).
1.2(S)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-4-甲氧基苯基)-3- 亚甲基氮杂环丁烷-2-酮(1d)的合成
在50mL Schlenk管中加入原料1c(0.44g,0.83mmol)，Sn[N(TMS)2]2(0.4 mL,1mmol)和无水甲苯10mL。氮气保护下加热回流反应3小时，后直接柱层析分离(PE/EA4:1)，得到无色油状液体(1d)0.35g，收率87％。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.95(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),6.85-6.81(m,2H),6.58(s,2H),5.80 (s,1H),5.26(s,1H),5.13(s,1H),3.78(s,3H),3.74(s,3H),3.71(s,6H),0.92(s,9H),0.06(s,6H).ESI-MS(m/z):486.1[M+H+].
1.3(S)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-亚甲基氮杂环丁烷-2-酮(1e)的合成
冰浴条件下，于50mL茄形瓶中加入原料1d(0.65g,1.34mmol)，TBAF (0.39g,15mmol)和四氢呋喃8mL。继续冰浴反应20分钟后，加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，Na2SO4干燥。柱层析分离 (PE/EA2:1)，得到淡黄色油状液体(1e)0.35g，收率71％。1HNMR(400MHz, CDCl3):δ6.95(d,J＝2.1Hz,1H),6.90(dd,J＝8.2,2.0Hz,2H),6.83(d,J＝8.2Hz, 1H),6.59(s,2H),5.81(t,J＝1.6Hz,1H),5.71(s,1H),5.27(s,1H),5.14(s,1H),3.88(s,3H),3.75(s,3H),3.73(s,6H).ESI-MS(m/z):372.1[M+H+].
1.4(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)-3-羟甲基氮杂环丁烷-2-酮(1f)的合成
在50mL茄形瓶中加入原料1e(0.22g,0.59mmol)，溴化苄(0.084mL,0.71 mmol)，碳酸钾(0.1g,0.71mmol)和乙腈5mL。加热回流反应8小时后，加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，Na2SO4干燥。旋蒸浓缩得到白色固体。于50mL Schlenk管中加入该白色固体，联硼酸频那醇酯(0.2g,0.8mmol)，CuCl(3.0mg,0.09mmol)，三苯基膦(24mg,0.09mmol)，叔丁醇锂(4.8mg,0.06mmol)，抽换气使体系充满干燥的氮气，后注入甲醇(15 μL,0.9mmol)和无水THF 10mL。继续在氮气保护下室温反应12小时，加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和NaCl水溶液洗一次，Na2SO4干燥。蒸去溶剂后加入加入四水合过硼酸钠(0.46g,1.5mmol)，THF(10mL)，和水(5mL)，室温反应2小时。加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和NaCl水溶液洗一次，Na2SO4干燥。柱层析分离(PE/EA1:2)，得到白色粘稠液体(1f)92mg，收率32％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.48-7.32(m,5H), 6.97(d,J＝1.5Hz,1H),6.91(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),6.84(d,J＝8.3Hz,1H),6.56(s,2H),5.16(s,2H),4.92(d,J＝1.8Hz,1H),4.00(dd,J＝11.9,3.3Hz,1H),3.90(s, 3H),3.76(s,3H),3.72(s,7H),3.28(d,J＝2.3Hz,1H).ESI-MS(m/z):480.1(M+H+).
1.5(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)-3-邻苯二甲酰亚胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(1g)的合成
于干燥的50mL Schlenk管中称取1f(0.5g,1.04mmol)，邻苯二甲酰亚胺 (0.77g,5.21mmol)和三苯基膦(1.37g,5.21mmol)，三次抽换气后使体系充满干燥的氮气。向体系注入无水四氢呋喃(6mL)，置于冰浴中。充分冷却后，注入偶氮二甲酸二异丙酯(1.05g,5.21mmol)。升至室温，过夜反应。反应液旋蒸浓缩后，柱层析分离(PE/EA2:1)，得到黄色油状液体(1g)0.49g，收率 78％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.87-7.86(m,2H),7.73(m,2H),7.31-7.27(m, 5H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),6.79(s,2H),6.46(s,2H),4.98(s,2H),4.92(s,1H),4.30-4.25(m,1H),4.15-4.09(m,1H),3.82(s,3H),3.77(s,3H),3.66(s,6H),3.38(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ167.3,163.6,152.7,149.3,147.9,135.8,133.6, 132.8,132.1,131.4,131.1,128.7,127.8,127.3,126.7,122.8,118.2,111.4,110.6,94.1,70.2,60.2,59.7,58.5,55.3,35.8.ESI-MS(m/z):609.5(M+H+).ESI-HRMS(m/z): calcd forC35H33N2O8+H+[M+H+],609.5778；found,609.5773.
1.6(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)-3-氨甲基氮杂环丁烷-2-酮(1h)的合成
于50mL圆底烧瓶中加入原料1g(0.4g,0.66mmol)，水合肼溶液(85％,160 μL,2.63mmol)和乙醇(5mL)。加热回流反应1小时，反应液冷却后过滤掉絮状沉淀，滤液浓缩，柱层析分离(CH2Cl2/MeOH30:1)，得到黄色油状液体(1h) 195mg，收率62％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.86(d,J＝7.1Hz,2H),7.74-7.72 (m,3H),6.93(d,J＝8.1Hz,1H),6.87(s,2H),6.47(s,2H),5.11(s,2H),4.72(s,1H),3.87(s,3H),3.75(s,3H),3.66(s,6H),3.24-3.18(m,1H),3.11(d,J＝5.3Hz,2H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ165.9,152.8,149.4,147.9,135.9,133.8,133.2,129.5, 127.8,127.3,126.6,118.6,111.4,111.1,94.0,70.4,61.9,60.3,57.9,55.3,39.3.ESI-MS(m/z):479.5(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C27H31N2O6+H+[M +H+],479.5765；found,479.5761.
1.7(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-氨甲基氮杂环丁烷-2-酮(1)的合成
在25mL茄形瓶中加入1h(20mg,0.042mmol)，Pd/C(3mg)和乙醇(1 mL)。通氢气常压室温反应12小时，过滤除去催化剂后，柱层析分离 (CH2Cl2/MeOH30:1)，得到黄色固体(1)14mg，收率88％。mp 98-100℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.95(s,1H),6.88(d,J＝8.1Hz,1H),6.83(d,J＝8.1Hz, 1H),6.55(s,2H),4.96(s,1H),3.88(s,3H),3.76(s,3H),3.72(s,6H),3.38(m,1H),3.27-3.14(m,2H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ165.9,152.7,146.3,145.7,133.7, 133.1,130.2,117.3,117.2,111.6,110.4,94.3,94.1,61.8,60.3,57.8,55.4,39.3.ESI-MS(m/z):389.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C20H25N2O6+H+[M+ H+],389.1712；found,389.1707.。
实施例2化合物2，3，4，5，6，7，8和9的合成
具体操作如下：于25mL茄型瓶中，称取原料1h(20mg,0.04mmol)，用 1.5mL二氯甲烷溶解，加入酰氯(0.21mmol)与三乙胺(25μL,0.21mmol)，室温下搅拌，TLC点板检测反应进程。待反应完全后，加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后蒸干,用硅胶(300-400目)柱层析分离纯化。
2.1(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-乙酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(2)的合成
洗脱剂：PE/EA 2:1，淡红色固体(2)，收率80％。mp 76-78℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.91(s,1H),6.86(d,J＝6.8Hz,1H),6.81(d,J＝6.9Hz,1H),6.51 (s,2H),6.06(s,1H),5.83(s,1H),4.75(s,1H),3.88(s,3H),3.75(s,3H),3.70(s,6H), 3.21(s,1H),2.95(s,1H),2.87(s,1H),2.00(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3): δ170.1,165.1,152.9,146.2,145.7,134.0,132.8,129.6,117.4,111.2,110.3,94.3,60.3,59.3,58.2,55.4,36.6,29.1,22.7.ESI-MS(m/z):431.1(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C22H27N2O7+H+[M+H+],431.1819；found,431.1813.
2.2(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-丙酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(3)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，淡红色固体(3)，收率78％。mp 80-83℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.91(s,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H),6.50 (s,2H),6.00(s,1H),5.83(s,1H),4.77(s,1H),3.87(s,3H),3.80(m,2H),3.75(s,3H),3.70(s,6H),3.22-3.19(m,1H),2.21(q,J＝7.6Hz,2H),1.12(t,J＝7.6Hz, 3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ173.9,165.1,152.9,146.2,145.7,133.9,132.8, 129.7,117.4,111.2,110.3,94.3,60.3,59.4,58.2,55.4,36.5,29.1,9.2.ESI-MS(m/z):445.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C23H29N2O7+H+[M+H+],445.1974；found,445.1969.
2.3(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-丁酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(4)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，黄绿色固体(4)，收率72％。mp 67-72℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.93(s,1H),6.85(s,2H),6.55(s,2H),5.85(s,1H),4.79(d,J＝2.1 Hz,1H),4.51(s,2H),3.89(s,3H),3.77(s,3H),3.72(s,6H),3.38(s,1H),2.32-2.29 (m,2H),1.64-1.59(m,2H),0.92-0.88(m,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ173.0, 165.1,152.9,146.2,145.7,133.9,132.8,129.7,117.4,111.2,110.3,94.3,60.3,59.4,58.2,55.4,37.9,36.4,29.1,18.5,13.1.ESI-MS(m/z):459.2(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C24H31N2O7+H+[M+H+],459.2129；found,459.2126.
2.4(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-环丙甲酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(5)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，黄色固体(5)，收率86％。mp 82-85℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.91(s,1H),6.86(d,J＝8.2Hz,1H),6.82(d,J＝8.2Hz,1H),6.52 (s,2H),6.11(s,1H),5.77(s,1H),4.79(s,1H),3.89(s,4H),3.76(s,3H),3.72(s,7H),3.21(s,1H),1.38-1.36(m,1H),0.99(s,2H),0.76(s,2H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ173.6,165.1,152.9,146.2,145.7,134.0,132.9,129.8,117.3,111.3,110.3, 94.3,60.3,59.5,58.2,55.4,36.8,14.1,6.8.ESI-MS(m/z):457.1(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C24H29N2O7+H+[M+H+],457.1977；found,457.1969.
2.5(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-异丁酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(6)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，黄色固体(6)，收率68％。mp 73-75℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.92(s,1H),6.88(d,J＝8.1Hz,1H),6.82(d,J＝8.1Hz,1H),6.51(s, 2H),6.00(s,1H),5.82(s,1H),4.79(s,1H),3.88(s,3H),3.79(m,2H),3.76(s,3H), 3.71(s,6H),3.21(s,1H),2.38-2.34(m,1H),1.12(t,J＝7.8Hz,6H).13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ177.0,165.1,152.9,146.2,145.7,133.9,132.8,129.7,117.4,111.2, 110.2,94.2,60.3,59.5,58.1,55.4,36.3,35.0,29.1,19.1,18.8.ESI-MS(m/z):459.2(M +H+).ESI-HRMS(m/z):calcdfor C24H31N2O7+H+[M+H+],459.2131；found,459.2126.
2.6(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-苯甲酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(7)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，淡黄色固体(7)，收率68％。mp 68-71℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.78(s,2H),7.51(s,1H),7.44(s,2H),6.96(s,1H),6.90-6.78(m, 2H),6.53(s,2H),5.31(s,1H),4.88(s,1H),4.07(s,1H),3.94(s,1H),3.89(s,3H),3.76(s,3H),3.71(s,6H),3.34(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ167.5,165.2, 152.9,146.2,145.7,134.0,133.4,132.8,131.2,129.6,128.1,126.3,117.4,111.2,110.3,94.3,60.3,59.3,58.4,55.4,37.1,29.1.ESI-MS(m/z):493.1(M+H+). ESI-HRMS(m/z):calcdfor C27H29N2O7+H+[M+H+],493.1975；found,493.1969.
2.7(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(4-氟苯甲酰胺甲基)氮杂环丁烷-2-酮(8)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，黄色固体(8)，收率70％。mp 85-88℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ8.01(t,J＝8.1Hz,2H),7.09(t,J＝8.1Hz,2H),6.96(s,1H),6.89(d, J＝8.0Hz,1H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.57(s,2H),5.90(s,1H),4.89(s,1H),4.75 (s,2H),3.88(s,3H),3.78(s,3H),3.72(s,6H),3.53(s,1H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ166.4,165.2,152.9,146.3,145.7,134.0,132.8,129.5,128.7,117.4,115.1, 115.0,111.3,110.3,94.3,60.3,59.1,58.4,55.4,37.3.ESI-MS(m/z):511.1(M+ H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C27H28FN2O7+H+[M+H+],511.1881；found,511.1875.
2.8(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(4-硝基苯甲酰胺甲基)氮杂环丁烷-2-酮(9)的合成
洗脱剂：PE/EA2:1，黄色固体(9)，收率78％。mp 67-72℃.1HNMR(400MHz, CDCl3):δ7.62(d,J＝8.9Hz,2H),6.94(s,1H),6.89(d,J＝7.0Hz,1H),6.81(d,J＝ 7.0Hz,1H),6.55(d,J＝8.8Hz,2H),6.52(s,2H),4.87(s,1H),3.88(s,3H),3.75(s,3H),3.70(s,6H),3.30(s,1H),3.21-3.16(m,2H).13C NMR(150MHz,CDCl3): δ167.3,165.4,152.8,150.5,146.2,145.6,133.9,132.9,129.7,128.1,121.2,117.4,111.3,110.3,94.3,60.3,59.6,58.2,55.4,37.4,36.8.ESI-MS(m/z):536.2(M+H+). ESI-HRMS(m/z):calcdfor C29H34N3O7+H+[M+H+],536.2396；found,536.2391.。
实施例3(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-邻苯二甲酰亚胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(10)的合成
在25mL茄形瓶中加入原料1g(20mg,0.032mmol)，Pd/C(3mg)和乙醇(1mL)。通氢气常压室温反应12小时，过滤除去催化剂后，柱层析分离(展开剂：PE/EA 2:1)，得到黄色固体(10)14mg，收率83％。mp 88-90℃.1HNMR (400MHz,CDCl3):δ7.87-7.85(m,2H),7.74-7.72(m,2H),6.84(s,1H),6.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.73(d,J＝8.2Hz,1H),6.52(s,2H),5.66(s,1H),4.97(s,1H),4.27(dd, J＝14.2,4.8Hz,1H),4.11(dd,J＝13.8,9.8Hz,1H),3.82(s,3H),3.75(s,3H),3.70(s,6H),3.44-3.41(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ167.4,163.1,152.8,146.2, 145.6,133.9,133.6,132.9,131.2,129.6,122.9,117.1,111.3,110.4,94.3,60.3,59.5, 58.4,55.4,55.3,35.9.ESI-MS(m/z):519.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C28H27N2O8+H+[M+H+],519.1768；found,519.1762.。
实施例4(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-甲磺酰胺甲基氮杂环丁烷-2-酮(11)的合成
于25mL茄型瓶中，称取原料1h(20mg,0.04mmol)，用1.5mL二氯甲烷溶解，加入甲基磺酰氯(14μL,0.21mmol)与三乙胺(25μL,0.21mmol)，室温下搅拌，TLC点板检测反应进程。待反应完全后，加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，旋蒸浓缩后加入 10％Pd/C(3mg)，乙醇(1mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C 后蒸干,用硅胶(300-400目)柱层析分离纯化(展开剂：PE/EA2:1)，得到黄色固体(11)16mg，收率69％。mp 61-63℃.1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.94(s, 1H),6.90(d,J＝8.1Hz,1H),6.85(d,J＝8.1Hz,1H),6.52(s,2H),5.74(s,1H),4.92(s,1H),4.62(s,2H),3.89(s,3H),3.76(s,3H),3.72(s,6H),3.44(s,1H),3.07(s, 3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ162.0,152.9,146.4,145.8,134.2,132.6,128.9, 117.5,111.3,110.4,94.4,64.5,60.3,58.3,57.4,55.4,37.1,29.1.ESI-MS(m/z):468.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd forC24H29N2O7+H+[M+H+],468.1326；found,468.1323.。
实施例5化合物12，13的合成
具体操作如下：于10mL茄型瓶中，称取原料1h(16mg,0.03mmol)，用 1.5mL二氯甲烷溶解，加入酸酐(0.1mmol)，DMAP(1mg)与三乙胺(14μL, 0.1mmol)，室温下反应6小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后蒸干,用硅胶(300-400目)柱层析法进行纯化。
5.1(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3-羧基丙酰胺甲基)氮杂环丁烷-2-酮(12)的合成
洗脱剂：CH2Cl2/MeOH 20:1，紫色油状液体(12)，收率71％。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.85(s,1H),6.79-6.74(m,2H),6.46(s,2H),4.73(s,1H),4.45(d,J＝4.2Hz,2H),3.80(s,3H),3.68(s,3H),3.64(s,6H),3.30(s,1H),2.58(s,4H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ176.0,171.4,163.3,152.8,146.3,145.6,134.0,132.9, 129.4,117.1,111.6,110.5,94.4,60.3,60.2,58.5,58.1,55.4,55.3,28.2,28.0.ESI-MS(m/z):489.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C24H29N2O9+H+[M+H+],489.1873；found,489.1868.
5.2(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(4-羧基丁酰氧甲基)氮杂环丁烷-2-酮(13)的合成
/>
洗脱剂：CH2Cl2/MeOH20:1，紫色油状液体(13)，收率68％。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.93(s,1H),6.88-6.83(m,2H),6.54(s,2H),4.80(d,J＝2.1Hz, 1H),4.57-4.46(m,2H),3.89(s,3H),3.77(s,3H),3.72(s,6H),3.41-3.38(m,1H), 2.45-2.38(m,4H),1.97-1.90(m,2H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ176.9,172.0, 163.3,152.9,146.3,145.7,133.9,132.9,129.5,117.2,111.5,110.5,94.3,60.3,59.9,58.6,58.2,55.4,55.3,32.4,32.1,19.2.ESI-MS(m/z):503.2(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C25H21N2O9+H+[M+H+],503.2031；found,503.2024.。
实施例6化合物14，15的合成
具体操作如下：于10mL茄型瓶中，称取原料1h(32mg,0.06mmol)，用 2mL二氯甲烷溶解，加入氨基酸(0.2mmol)，DMAP(2mg)与三乙胺(28μL, 0.2mmol)，室温下反应6小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和NaCl溶液洗一次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3 mg)，乙醇(1mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后旋蒸浓缩，加入二氯甲烷(1.5mL)，冰浴下滴加三氟乙酸(0.5mL)，1小时后加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后用硅胶(300-400目)柱层析法进行纯化。
6.1(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2-氨基乙酰胺甲基)氮杂环丁烷-2-酮(14)的合成
洗脱剂：CH2Cl2/MeOH 20:1，黄色油状液体(14)，收率73％。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.70(s,1H),6.86-6.74(m,3H),6.45(s,2H),4.73(s,1H),3.81(s, 3H),3.75(m,1H),3.69(s,3H),3.64(s,7H),3.32(s,2H),3.16(s,1H).13C NMR (150MHz,CDCl3):δ164.8,152.8,146.2,145.6,133.9,132.9,129.7,117.2,111.4, 110.4,94.3,60.3,59.4,58.4,55.4,36.3,29.1.ESI-MS(m/z):446.1(M+ H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C22H28N3O7+H+[M+H+],446.1928；found,446.1922.
6.2(3S,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(L-缬氨酰胺甲基)氮杂环丁烷-2-酮(15)的合成
洗脱剂：CH2Cl2/MeOH 20:1，黄色油状液体(15)，收率70％。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.87(s,1H),6.93(s,1H),6.87(d,J＝8.0Hz,1H),6.81(d,J＝8.0 Hz,1H),6.51(s,2H),4.79(s,1H),4.12(q,J＝7.3Hz,1H),3.87(s,3H),3.79(s,1H),3.75(s,3H),3.70(s,6H),3.27-3.24(m,2H),3.14-3.08(m,1H),2.30-2.26(m,1H), 0.93(d,J＝6.7Hz,3H),0.71(d,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ 174.1,164.9,152.8,146.3,145.7,133.9,132.9,129.7,117.3,111.5,110.4,60.3,59.5,58.3,55.4,36.1,30.0,29.0,18.8,15.4.ESI-MS(m/z):488.2(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C25H34N3O7+H+[M+H+],488.2394；found,488.2391.。
实施例7(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-甲氧甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮(16)的合成
在50mL茄形瓶中加入原料1f(20mg,0.042mmol)，钠氢(2mg,0.084 mmol)，硫酸二甲酯(8μL,0.083mmol)和无水DMF(3mL)。室温下反应 12小时后，加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和NaCl水溶液洗一次，Na2SO4干燥。蒸除溶剂后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去催化剂后，柱层析分离(展开剂：PE/EA1:1)，得到白色固体(16)13mg，收率80％。mp 58-60℃.1HNMR(400MHz,CDCl3): δ6.96(s,1H),6.89(d,J＝8.3Hz,1H),6.84(d,J＝8.3Hz,1H),6.56(s,2H),5.74(s,1H),4.86(s,1H),3.89(s,3H),3.87-3.78(m,2H),3.76(s,3H),3.73(s,6H),3.41(s, 3H),3.30(s,1H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ164.7,152.8,146.1,145.6,133.8, 133.3,130.3,117.2,111.6,110.3,94.2,67.7,60.3,59.8,58.6,57.5,55.4.ESI-MS(m/z):404.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C21H25NO7+H+[M+H+],404.1709；found,404.1704.。
实施例8(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-二氟甲氧甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮(17)的合成
于1.5mL EP管中，称取原料1f(48mg,0.1mmol)和醋酸钾(39mg,0.4 mmol)，用二氯甲烷(0.15mL)和去离子水(0.15mL)溶解，后加入溴代三甲基硅基二氟甲烷(51mg,0.25mmol)，室温下搅拌，TLC点板检测反应进程。待反应完全后，加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。过滤，旋蒸浓缩，后加入10％Pd/C(4mg)，乙醇(2mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去催化剂后，用硅胶(300-400目)柱层析法进行分离纯化(洗脱剂：PE/EA2:1)，旋蒸得到黄色固体(17)40mg，收率 90％。mp 61-63℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.94(s,1H),6.86(d,J＝7.9Hz, 2H),6.54(s,2H),6.46-6.08(m,1H),5.80(s,1H),4.83(s,1H),4.26(s,2H),3.88(s,3H),3.75(s,3H),3.71(s,6H),3.35(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ163.0, 152.9,146.3,145.7,133.9,132.9,129.5,117.3,116.7,114.9,113.2,111.4,110.4,94.2,60.3,58.5,58.3,57.5,55.4.ESI-MS(m/z):440.1(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd for C21H24F2NO7+H+[M+H+],440.1519；found,440.1515.。
实施例9化合物18,19,20的合成
具体操作如下：于10mL茄型瓶中，称取原料1f(48mg,0.1mmol)，芳基硼酸(0.3mmol)，醋酸酮(3.6mg,0.02mmol)，DMAP(7.3mg,0.06mmol) 与乙腈(2mL)，常压氧气下室温反应6小时。加水，用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋蒸浓缩后加入 10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去 Pd/C后旋蒸浓缩，用硅胶(300-400目)柱层析法进行纯化。
9.1(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-苯氧甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮(18)的合成
洗脱剂：PE/EA1:1，白色固体(18)，收率73％。mp 65-66℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.31-7.27(m,3H),7.26-6.84(m,5H),6.58(s,2H),4.97(d,J＝2.1 Hz,1H),4.38-4.34(m,1H),4.14-4.09(q,J＝7.2Hz,1H),3.89(s,3H),3.77(s,3H), 3.73(s,6H),3.52-3.49(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ163.8,157.7,152.9, 146.2,145.7,133.9,133.2,129.9,128.9,120.8,117.3,114.1,111.5,110.3,94.2,63.5,60.3,59.2,57.9,55.4.ESI-MS(m/z):466.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C26H28NO7+H+[M+H+],466.1865；found,466.1860.
9.2(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-(4-氟-苯氧甲基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮(19)的合成
洗脱剂：PE/EA1:1，黄色固体(19)，收率80％。mp 67-68℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ6.98-6.95(m,3H),6.89-6.86(m,4H),6.58(s,2H),5.72(s,1H),4.96 (d,J＝2.0Hz,1H),4.34(s,2H),3.90(s,3H),3.78(s,3H),3.73(s,6H),3.49(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ163.7,157.8,156.2,153.9,152.9,146.2,145.7,133.9, 133.1,129.9,117.3,115.4,115.2,111.5,110.3,94.2,64.3,60.3,59.2,57.8,55.4,55.4.ESI-MS(m/z):484.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C26H27FNO7+H+[M +H+],484.1774；found,484.1766.
9.3(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-(4-三氟甲基苯氧甲基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮(20)的合成
/>
洗脱剂：PE/EA 1:1，黄绿色固体(20)，收率81％。mp 65-66℃.1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.00(d,J＝8.3Hz,2H),6.99(s,1H),6.92 (d,J＝8.5Hz,1H),6.86(d,J＝8.5Hz,1H),6.58(s,2H),5.73(s,1H),4.96(s,1H),4.46-4.39(m,2H),3.91(s,3H),3.78(s,3H),3.74(s,6H),3.54(s,1H).13C NMR (150MHz,CDCl3):δ163.3,160.1,152.9,146.3,145.7,133.9,133.0,129.7,126.4, 117.3,114.1,111.5,110.4,94.3,63.7,60.3,58.9,57.8,55.4,55.4.ESI-MS(m/z):534.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd forC27H27FNO7+H+[M+H+],534.1876；found,534.1888.。
实施例10(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-氟甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基) 氮杂环丁烷-2-酮(21)的合成
于50mL聚四氟乙烯管中，称取原料1f(48mg,0.1mmol)和SulFoxFluor (42mg,0.12mmol)，用1.5mL无水甲苯溶解，最后加入DBU(16μL,0.12mmol)，室温下搅拌10分钟，过滤，旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后旋蒸浓缩，用硅胶(300-400目) 柱层析法进行纯化(洗脱剂：PE/EA1:1)。旋蒸得到淡紫色油状液体(21)31.7 mg，收率81％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.97(s,1H),6.91(d,J＝8.1Hz,1H), 6.86(d,J＝8.1Hz,1H),6.56(s,2H),5.87(s,1H),4.92(s,1H),4.85-4.72(m,2H),3.89(s,3H),3.76(s,3H),3.73(s,6H),3.43-3.35(m,1H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ162.7,152.8,146.4,145.8,133.9,132.9,129.4,117.3,111.4,110.4,94.3, 78.9,77.9,60.3,59.9,59.8,57.0,55.4.ESI-MS(m/z):392.1(M+H+).ESI-HRMS (m/z):calcd forC20H23FNO6+H+[M+H+],392.1512；found,392.1504.。
实施例11(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-氯甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基) 氮杂环丁烷-2-酮(22)的合成
于10mL茄型瓶中，称取原料1f(20mg,0.04mmol)，用1.5mL二氯甲烷后加入氯化亚砜(9μL,0.12mmol)与三乙胺(17μL,0.12mmol)，室温反应6 小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，无水 Na2SO4干燥，过滤，旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后旋蒸浓缩，用硅胶(300-400目) 柱层析法进行纯化(洗脱剂：PE/EA2:1)。旋干得到淡黄色固体(22)13mg，收率76％。mp 59-62℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.97-6.84(m,3H),6.55(s, 2H),5.73(s,1H),4.86(d,J＝2.2Hz,1H),3.95-3.93(m,1H),3.90(s,3H),3.87-3.82(m,1H),3.77(s,3H),3.73(s,6H),3.49-3.46(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3): δ162.7,152.9,146.3,145.7,134.10,132.8,129.3,117.4,111.5,110.4,94.3,76.6,60.4260.3,58.6,55.4,40.2.ESI-MS(m/z):408.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C20H23ClNO6+H+[M+H+],408.1214；found,408.1208.。
实施例12(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-溴甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基) 氮杂环丁烷-2-酮(23)的合成
在25mL Schlenk管中加入原料1f(20mg,0.04mmol)，四溴化碳(69mg,0.2 mmol)，三苯基膦(54mg,0.2mmol)，三次抽换气后使体系充满干燥的氮气，后向体系注入无水二氯甲烷(3mL)。继续在氮气保护下室温反应4小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，Na2SO4干燥。旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12 小时。过滤除去Pd/C后旋蒸浓缩，用硅胶(300-400目)柱层析法进行纯化(洗脱剂：PE/EA2:1)。旋干得到淡绿色固体(23)16mg，收率88％。mp 63-65℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.98(s,1H),6.92(d,J＝8.3Hz,1H),6.85(d,J＝8.3 Hz,1H),6.55(s,2H),5.82(s,1H),4.81(s,1H),3.89(s,3H),3.77(s,5H),3.73(s, 6H),3.51(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ162.9,152.9,146.3,145.7,134.1, 132.7,129.1,117.5,111.6,110.4,94.4,60.3,59.9,55.4,55.4,27.7.ESI-MS(m/z):453.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd forC20H23BrNO6+H+[M+H+],453.0708；found,453.0703.。
实施例13(3R,4R)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-碘甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基) 氮杂环丁烷-2-酮(24)的合成
在25mL Schlenk管中加入原料1f(20mg,0.04mmol)，碘(42mg,0.16 mmol)，三苯基膦(44mg,0.16mmol)，Imidazole(6mg,0.08mmol)三次抽换气后使体系充满干燥的氮气，后向体系注入无水二氯甲烷(2mL)。继续在氮气保护下室温反应4小时。加水，用二氯甲烷萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗一次，Na2SO4干燥。旋蒸浓缩后加入10％Pd/C(3mg)，乙醇(1.5mL)，常压氢气下室温反应12小时。过滤除去Pd/C后旋蒸浓缩，用硅胶(300-400目)柱层析法进行纯化(洗脱剂：PE/EA2:1)。旋干得到黄固体(24)16mg，收率 78％。mp 62-64℃.1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.01(s,1H),6.95(s,1H),6.85(s, 1H),6.53(s,2H),5.73(s,1H),4.67(s,1H),3.90(s,3H),3.77(s,3H),3.73(s,6H),3.57(s,1H),3.47(s,1H),3.41(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ167.7,157.2, 150.6,149.9,138.4,136.9,133.4,122.1,116.2,114.7,98.7,66.4,64.9,64.6,59.7,3.0.ESI-MS(m/z):500.1(M+H+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C20H23INO6+H+[M+H+],500.0567；found,500.0500.。
实施例14体外肿瘤细胞增殖活性检测实验
取对数生长期的肿瘤细胞，处理后接种于96孔板中，并于37℃、5％CO2的条件下培养24小时。加入6个梯度浓度的供试化合物，并以paclitaxel和CA-4 作为阳性对照。同样的条件下继续培养48小时，后加入MTT，培养4小时后弃去含MTT的上清液，每孔加入DMSO，震荡溶解掉紫色结晶，后于酶标仪上490 nm或者540nm处测得OD值，并计算出抑制率；化合物的半数抑制浓度(IC50值)根据6个浓度的抑制率计算所得。每个浓度梯度设置三个复孔，重复检测三次；活性结果如表1所示。
表1.化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性(IC50,nM)
其中：化合物的肿瘤增殖抑制活性均由MTT法测定，最终数据取用三次测量的平均值；HUH-7是人肝癌细胞株；A2780是人卵巢癌细胞株；MDA-MB-231是人乳腺癌细胞株；Hela是人宫颈癌细胞株。
实施例15体外微管蛋白自组装实验用浊度法测试优选化合物21在体外对微管聚集的抑制作用，检测试剂盒购自于美国Cytoskeleton公司。操作步骤如下，pH＝6.6的微管聚集体系(0.1M PIPES、 10mM MgCl2、1mM GTP、1mM EGTA和3.4M甘油)预先在冰上预孵育，加入不同浓度的受试化合物21，并设置CA-4处理组作为阳性对照和DMSO(4％， v/v)处理组组作为阴性对照。向以上体系加入微管蛋白(10mM)后，立刻转移，置于37℃条件下进行聚集反应，保持温度不变，每隔1分钟用分光光度计 (Synergy H4 Hybrid)在340nm下测定吸光度，共持续测试30分钟，然后绘制吸光度曲线图(如图1所示)；结果显示化合物21能明显抑制微管聚集，IC50为1.0μM(如表2所示)。
表2.化合物21体外抑制微管自组装实验
实施例16免疫荧光检测微管蛋白形态实验
对数生长期HeLa细胞按8000个/皿接种于共聚焦皿中，24小时后加入不同浓度化合物21，同时设置CA-4处理组作为阳性对照，DMSO处理组作为阴性对照。37℃，5％二氧化碳条件下培养24小时后弃去培养基，PBS洗涤2次，甲醇固定15分钟后再用PBS洗涤3次，0.1％Triton X-100通透10分钟，PBS洗3 次后山羊血清室温封闭0.5小时，抗4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次5 分钟。然后加荧光标记二抗，室温避光孵育1小时，PBST漂洗3次，每次5 分钟。60微升DAPI染色液染色10分钟后PBST洗涤3次，每次5分钟。每皿中加入1毫升PBS，在共聚焦显微镜下观察微管蛋白的形态，检测受试化合物对微管结构的影响。结果显示化合物21能明显地抑制微管的聚集(如图2所示)。
实施例17集落形成抑制实验
取对数生长期的MDA-MB-231与Hela细胞，处理后接种于6孔板中，每孔接种1500个细胞，并于37℃、5％CO2及湿度饱和的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，加入不同浓度的化合物21处理细胞48h，并设置DMSO处理组为阴性对照。更换新鲜培养基并继续培养两周，后弃去上清液，用PBS冲洗两次，细胞用无水甲醇固定30分钟，并用结晶紫染料染色1小时，洗去染色液，充分干燥后于显微镜下计数大于50个细胞形成的集落数，结果显示化合物21能够明显地抑制MDA-MB-231与Hela细胞集落的形成(如图3所示)。
实施例18体外新生血管生成抑制实验
将购买的细胞外基质胶MatriGel(美国BD Biosciences公司)用PBS按1:1 稀释混匀后，于96孔板中每孔加入60μL。置于37℃、5％CO2培养箱中预热孵育2小时，待凝胶形成后，将对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)按浓度3×104个/孔接种到制备好的凝胶上，加入不含FBS的DMEM培养基，并加入不同浓度的化合物21，同时设置DMSO处理组为阴性对照，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养12h，于倒置相差显微镜下观察毛细血管形成情况，拍摄相关照片，结果显示化合物21能明显抑制HUVEC细胞生成毛细血管样结构(如图4所示)。
实施例19体外细胞周期抑制实验
取对数生长期的Hela细胞，处理后按2×105个/孔的数量接种于6孔板中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养12h，待细胞贴壁后更换新鲜培养液，用不同浓度的化合物21处理细胞24h，同时设置DMSO处理组为阴性对照。弃去上清液，收集贴壁细胞，用PBS冲洗两次，再用75％乙醇固定，-20℃条件下固定过夜，用PI染色后采用流式细胞仪进行测试，结果显示化合物21能明显将细胞阻滞于G2/M期(如图5所示)。
实施例20体外细胞周期相关蛋白检测
取对数生长期的Hela细胞，处理后按2×105个/孔的数量接种于6孔板中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养24小时，加入梯度浓度的化合物 21处理肿瘤细胞后(同时设置DMSO处理组为阴性对照)，48小时后收集并用裂解液裂解细胞。蛋白样品经加热变性后，上样于聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE 电泳分离，湿法转膜，封闭，依次经一抗反应、二抗反应后，曝光显色。结果如图6所示，化合物21能明显促进有丝分裂检验点蛋白BuBR1、磷酸化组蛋白 H3、细胞周期蛋白B1的表达。
实施例21体外诱导细胞凋亡实验
取对数生长期的Hela细胞，处理后按2×105个/孔的数量接种于6孔板中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养24小时，加入梯度浓度的化合物 21，同时设置DMSO处理组为阴性对照。继续培养48小时后,收集上清液细胞和贴壁细胞，用PI和AnnexinV双染色，采用流式细胞仪进行检测。结果如图 7所示，化合物21能浓度依赖性地诱导细胞凋亡。
实施例22体外凋亡相关蛋白的检测实验
取对数生长期的Hela细胞，处理后按2×105个/孔的数量接种于6孔板中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养24小时，加入梯度浓度的化合物 21，同时设置DMSO处理组为阴性对照。48小时后收集并用裂解液裂解细胞。上样于聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE电泳分离，湿法转膜，封闭，依次经一抗反应、二抗反应后，曝光显色，结果如图8所示，化合物21能明显促进抑癌基因 p53、促凋亡蛋白Bad、剪切的DNA修复酶PAPR-1的表达.
实施例23动物水平的肿瘤治疗作用和机理研究实验
取对数生长期的A2780细胞(卵巢癌细胞)稀释成细胞浓度为1×107个/mL 的PBS悬浮液，后按每只0.2mL腹腔注射接种于6周龄Balb/C裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型，SPF条件下自然生长。待裸鼠皮下A2780移植瘤长至体积约100 mm3，将裸鼠随机分成4组，每组10只，经腹腔给药，分别注射不同浓度的5mg/kg 的化合物21、10mg/kg的化合物21、10mg/kg紫杉醇和空白对照，记录移植瘤生长大小。移植瘤体积按以下公式计算：肿瘤体积(mm3)＝a×b2×0.52(a为最长的直径，b为最短的直径，0.52是经验系数)。当空白对照组移植瘤平均体积达到2000mm3后，处死裸鼠，剥离瘤组织，称取瘤质量并计算抑瘤率：
抑瘤率＝(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％
结果如图9所示，化合物21在小鼠体内能明显抑制肿瘤生长，并且对小鼠体重无明显影响。

Claims (3)

1.具有通式Ⅳ结构的手性二芳基-β-内酰胺类化合物，
所述的手性二芳基-β-内酰胺类化合物为：
2.权利要求1所述的化合物及其在药学上可接受的盐在制备预防和治疗与肿瘤相关疾病的药物中的应用，所述疾病是间质肉瘤、绒癌、恶性葡萄胎、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、骨肉瘤、胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴瘤、脑胶质瘤、鼻咽癌、神经内分泌癌、未分化癌、恶性畸胎瘤以及良性肿瘤；
所述的“药学上可接受的盐”，为与有机酸或无机酸形成的盐，所述的有机酸选自苹果酸、乳酸、樟脑磺酸、枸橼酸、富马酸、草酸，所述的无机酸选自磷酸、氢卤酸、硫酸、硝酸。
3.一种用于预防和治疗与肿瘤相关疾病的复方药物，其特征在于其含有权利要求1所述的化合物，所述的与肿瘤相关疾病是甲状腺癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、骨肉瘤、肾癌、未分化癌、间质肉瘤、绒癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、鼻咽癌、神经内分泌癌、恶性葡萄胎、恶性畸胎瘤以及良性肿瘤。
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