CN112595784B

CN112595784B - 一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法

Info

Publication number: CN112595784B
Application number: CN202011120746.8A
Authority: CN
Inventors: 崔宗岩; 纪涌彦; 柳吉芹; 纪欣欣; 黄学者; 张进杰
Original assignee: Qinhuangdao Customs Technical Center
Current assignee: Qinhuangdao Customs Technical Center
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112595784A

Abstract

本发明涉及一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法，所述方法包括以下步骤：(1)称取检测量的待测蜂蜜样品；(2)使用HS‑SPME‑GC‑MS对待测蜂蜜中挥发性碳氢化合物进行检测，得到检测谱图并依据谱图对待测蜂蜜样品中的顺‑9‑二十三烯(Cis‑9‑Tricosene，C9T)及其异构体反‑9‑二十三烯(Iso‑9‑Tricosene)、顺‑9‑二十五烯(Cis‑9‑Pentacosene，C9P)及其异构体(Iso‑9‑Pentacosene)进行定量；(3)根据蜂蜜中C9T、C9P的含量和C9T、C9P与各自异构体的比例，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。

Description

一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体的，涉及一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法。

背景技术

蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露并与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜具有丰富的营养价值和天然的甜味，深受消费者青睐。

意大利蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)产蜜能力强，是目前中国国内蜜蜂养殖的主要品种，意蜂主要被饲养于主要蜜粉源植物的区域，适合采集大面积连片分布的蜜粉源，主要产单花蜜。中华蜜蜂(Apis cerana cerana，简称中蜂)是中国独有的一个亚种，中蜂主要被饲养于中国山区及边远地区，主要采集零星蜜源植物，但其蜂蜜产量较低，主要生产多花蜜，经济效益相对较低。

中蜂蜂蜜也称“土蜂蜜”，其营养和保健功效深受消费者信赖。然而因中蜂蜂蜜产量较低，市场价格是意蜂蜂蜜的3-10倍，在利益的驱使下，市场上亦出现用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜的蜂蜜产品，给中蜂养殖者以及相关中蜂蜂蜜的品牌形象和企业造成损失，也引发了消费者的信任危机，不利于蜂产品市场的良性发展。

因此，建立操作简单快速、灵敏度高的中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的区分鉴别方法，可为中蜂蜂蜜的科学评价提供参考方法。有利于规范市场避免造假，保障蜂产品行业健康发展。

发明内容

本发明目的在于提供一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的区分鉴别方法，本发明以顺-9-二十三烯(Cis-9-Tricosene，C9T)及其异构体反-9-二十三烯(Iso-9-Tricosene)、顺-9-二十五烯(Cis-9-Pentacosene，C9P)及其异构体(Iso-9-Pentacosene)为关键差异物质，采用顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱法(HS-SPME-GC-MS)进行中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴定，方法具有操作简便、快速、灵敏度高的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的区分鉴别方法，所述区分鉴别方法包括以下步骤：

(1)称取检测量的待测蜂蜜样品；

(2)使用HS-SPME-GC-MS对待测蜂蜜中挥发性碳氢化合物进行检测，得到检测谱图并依据谱图对待测蜂蜜样品中的顺-9-二十三烯(Cis-9-Tricosene，C9T)及其异构体反-9-二十三烯(Iso-9-Tricosene)、顺-9-二十五烯(Cis-9-Pentacosene，C9P)及其异构体(Iso-9-Pentacosene)进行定量；

(3)根据蜂蜜中C9T和C9P及其异构体的含量和C9T和C9P及其异构体的比例，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。

步骤(1)中所述的蜂蜜样品为市售样品，检测量为1-5g，优选为2g；

步骤(2)中所述的HS-SPME-GC-MS的方法中，HS-SPME条件为：

固相微萃取纤维：30μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)，或100μm PDMS，或85μmPolyacrylate(聚丙烯酸酯)；

平衡时间：5-30min；

萃取温度：40-80℃；

萃取时间：5-60min；

解析时间：1-5min；

优选的，萃取温度为60℃、萃取时间为30min；

步骤(2)中所述的HS-SPME-GC-MS的方法中，GC条件为：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱；

程序升温：初始温度50℃，保持1min；然后以40℃/min升至250℃；然后以5℃/min升至300℃，保持9min；

柱流量：1.5mL/min；

进样口温度：280℃；

载气：高纯氦气；

步骤(2)中所述的HS-SPME-GC-MS的方法中，MS条件为：

离子源为EI源；

传输线温度为300℃；

离子源温度为230℃；

四极杆温度为150℃；

溶剂延迟时间为5min；

检测方式：全扫描模式(Scan)+选择离子扫描模式(SIM)，

Scan扫描质量数范围为：40-500m/z，SIM扫描各化合物的定量离子如下：

检测目标物为C9T，定量离子m/z＝322.3，保留时间：8.27min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。

检测目标物为C9P，定量离子m/z＝350.4，保留时间：9.45min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。

步骤(2)所述的定量方法为：以C9T、C9P的标准物质绘制标准曲线，随后通过计算检测结果的峰面积，对C9T及其异构体、C9P及其异构体的含量进行定量。

由于没有商品化反式异构体的标准物质，直接使用顺式异构体的标准曲线对两个化合物的反式异构体进行定量。

定义RT为C9T与反-9-二十三烯(Iso-9-Tricosene)的比值，RP为C9P与反-9-二十五烯(Iso-9-Pentacosene)的比值。

RT根据C9T与其异构体(Iso-9-Tricosene)峰面积的比值计算获得；

RP根据C9P与其异构体(Iso-9-Pentacosene)峰面积的比值计算获得。

进一步的，前述HS-SPME-GC-MS实验条件下，以C9T和C9P的添加浓度X为横坐标，以C9T和C9P定量离子的色谱峰面积Y为纵坐标，得到标准曲线，用于C9T和C9P的准确定量，标准曲线拟合方程为：

C9T：Y＝264.5X+778.5，线性相关系数R2＝0.9967；

C9P：Y＝272.4X+707.2，线性相关系数R2＝0.9980。

步骤(3)所述的根据蜂蜜中C9T和C9P及其异构体的含量和C9T和C9P及其异构体的比例，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法为，当待测样品中：

1)C9T≤20mg/kg，RT≤3.0，且C9P≤30mg/kg，RP≤4.0时，判定样品为中蜂蜂蜜；

2)当C9T>20mg/kg，RT>3.0，且C9P>30mg/kg，RP>4.0时，判定样品为意蜂蜂蜜。

本发明还涉及C9T及其反式异构体、C9P及其反式异构体在制备检测中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的区分鉴别方法，所述鉴别方法以蜂蜜中顺-9-二十三烯和顺-9-二十五烯及其异构体为关键差异物质，采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术进行中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴定，方法具有操作简便、快速、灵敏度高的优点，对评价中蜂蜂蜜真实性，保障消费者的合法权益具有重要意义。

附图说明

图1、典型意蜂洋槐蜂蜜的总离子流色谱图；

图2、典型意蜂枣花蜂蜜的总离子流色谱图；

图3、典型意蜂荆条蜂蜜的总离子流色谱图；

图4、典型意蜂椴树蜂蜜的总离子流色谱图；

图5、典型中蜂蜂蜜的总离子流色谱图；

图6、顺-9-二十三烯的质谱图；

图7、顺-9-二十五烯的质谱图；

图8、意蜂蜂蜜中顺-9-二十三烯及其异构体的典型提取离子色谱图；

图9、意蜂蜂蜜中顺-9-二十五烯及其异构体的典型提取离子色谱图；

图10、中蜂蜂蜜中顺-9-二十三烯及其异构体的典型提取离子色谱图；

图11、中蜂蜂蜜中顺-9-二十五烯及其异构体的典型提取离子色谱图；

图12、HS-SPME-GC-MS检测50批蜂蜜样品中C9T和C9P的含量；

图13、HS-SPME-GC-MS检测50批蜂蜜样品中RT和RP的值；

图14、HS-SPME-GC-MS检测15批商品化蜂蜜样品中C9T和C9P的含量；

图15、HS-SPME-GC-MS检测15批商品化蜂蜜样品中RT和RP的值。

具体实施方式

仪器与试剂：

MPS多功能样品前处理平台(配置自动化顶空固相微萃取手柄)(Gerstel)，

7890B-5977B型气相色谱-质谱联用仪(Agilent)，

DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)(Agilent)，

30μm PDMS固相微萃取纤维(Sigma-Aldrich Supelco)，

20mL顶空瓶(Gerstel)；20mm铁盖(Gerstel)，硅胶/聚四氟乙烯隔垫(Gerstel)，压盖器、启盖器(CNW)。

标准品C9T和C9P购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜关键差异性物质发现

样品来源：

从蜂农处采集常见的真实蜂蜜样本共50个：其中意蜂蜂蜜40个，包括洋槐蜜10个、枣花蜜10个、荆条蜜10个、椴树蜜10个；中蜂蜂蜜(土蜂蜜)10个。

实验步骤：

称取蜂蜜样品2.0g于顶空瓶中。置于自动化顶空固相微萃取装置，对蜂蜜样品进行萃取富集，所使用的固相微萃取纤维为30μm PDMS，萃取温度为60℃，萃取时间为30min，平衡时间为5min，进样口解析时间为5min；使用GC-MS进行检测。

GC的检测条件为：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱；

柱流量：1.5mL/min；

进样口温度：280℃；

载气：高纯氦气；

MS的检测条件为：

离子源为EI源；

传输线温度为300℃；

离子源温度为230℃；

四极杆温度为150℃；

溶剂延迟时间为5min；

检测方式：全扫描模式(Scan)，Scan扫描质量数范围为：40-500m/z。

比较不同种类蜂蜜中挥发性碳氢化合物的成分和含量，发现意蜂蜂蜜中疑似为顺-9-二十三烯和顺-9-二十五烯的两种物质(及其异构体)浓度较高，而中蜂蜂蜜中这两种物质及其异构体的含量较少，同时中蜂和意蜂蜂蜜中这两种物质与其各自的异构体之间的比例不同，能在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中形成明显区别。

不同种类意蜂蜂蜜样品的总离子流色谱图见图1-图4，典型中蜂蜂蜜样品总离子流色谱图见图5。

通过美国国家标准与技术研究所(NIST)数据库对这两种物质进行检索，并购买顺-9-二十三烯和顺-9-二十五烯标准品进行对比，确定这两种物质为顺-9-二十三烯(C9T)和顺-9-二十五烯(C9P)，两种物质的质谱图见图6和图7。

进一步建立选择离子扫描(SIM)的分析方法对C9P和C9T进行精准定量，具体参数如下：

C9T定量离子m/z＝322.3，保留时间：8.27min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。

C9P定量离子m/z＝350.4，保留时间：9.45min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。

据此获得意蜂蜂蜜中C9T和C9P的典型SIM色谱图见图8和图9，中蜂蜂蜜中C9T和C9P的典型SIM色谱图见图10和图11。进一步发现意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜中C9T和C9P与各自异构体的比值存在明显差异。进一步定义：

RT为C9T与其异构体(Iso-9-Tricosene)峰面积的比值；

RP为C9P与其异构体(Iso-9-Pentacosene)峰面积的比值。

实施例2中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜区分鉴别方法的优化

样品来源同实施例1。

进一步对萃取温度，萃取时间等实验条件进行优化，并确定了基质工作曲线的定量方法。

1、萃取温度的优化

取2g意蜂蜂蜜于20mL顶空瓶中，分别于40、50、60、70、80℃条件下进行SPME萃取和GC-MS检测。

实验结果显示：随着萃取温度的升高，目标物C9T和C9P的峰面积逐渐增大，但当温度高于70℃时，可能会导致蜂蜜营养成分发生变化，并且过高温度会导致纤维受损，而60℃时目标物响应较高能够满足检测要求，因此选取的萃取温度为60℃。

2、萃取时间的优化

取2g意蜂蜂蜜于20mL顶空瓶中，分别于5、10、30、45、60min下进行吸附萃取，萃取后的物质使用GC-MS检测。

实验结果显示：萃取时间在5-30min内，随着萃取时间的增加，目标物C9T和C9P的萃取效果有明显改善，在30-60min内，随着萃取时间的增加，目标物峰面积增加不明显，因此选取的萃取时间为30min。

3、基质标准曲线的建立

以糖浆为空白样品基质，取多份糖浆样品，每份2.0g，向其中分别加入适量C9T和C9P标准，混匀，获得系列标准工作液浓度分别为0，20，50，100，200mg/kg；按照上述步骤进行实验。分别以C9T和C9P的添加浓度X为横坐标，以C9T和C9P定量离子的色谱峰面积Y为纵坐标，得到标准曲线，用于C9T和C9P的准确定量。

上述实验条件下的标准曲线方程为：

C9T：Y＝264.5X+778.5，线性相关系数R²＝0.9967；

C9P：Y＝272.4X+707.2，线性相关系数R²＝0.9980；

标准样品的回归方程相关系数(R²)均大于0.99，线性关系良好。

应用此标准曲线对蜂蜜中C9T和C9P的含量进行定量分析。

RT根据C9T与其异构体(Iso-9-Tricosene)峰面积的比值计算获得；

RP根据C9P与其异构体(Iso-9-Pentacosene)峰面积的比值计算获得。

针对所采集的40批意蜂蜂蜜真实样品和10批中蜂蜂蜜真实样品进行检测，得到不同种类蜂蜜样品中C9T和C9P的含量见图12，不同种类蜂蜜样品RT和RP的值见图13。

根据中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中C9T、C9P的含量和各自异构体比例的不同，确定中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的区分鉴别标准如下：

(1)当C9T≤20mg/kg，RT≤3.0，且C9P≤30mg/kg，RP≤4.0时，判定样品为中蜂蜂蜜；

(2)当C9T>20mg/kg，RT>3.0，且C9P>30mg/kg，RP>4.0时，判定样品为意蜂蜂蜜。

实施例3实际样品检测与中蜂蜂蜜鉴别

样品来源：

从线下超市和网络平台上购买了15批次样品标识为“土蜂蜜”或“中蜂蜂蜜”的蜂蜜样品。

实验步骤：

按照上述实施例1和2的方法步骤进行实验。根据实施例2确定的判定标准对样品的进行判断：即当C9T<20mg/kg，RT<3.0，且C9P<30mg/kg，RP<4.0，判定样品为中蜂蜂蜜；当C9T>20mg/kg，RT>3.0，且C9P>30mg/kg，RP>4.0，判定样品为意蜂蜂蜜的标准。

15批商品化蜂蜜样品中C9T和C9P的含量见图14，商品化蜂蜜样品中RT和RP的值见图15。

判定结果表明，15批样品中纯正中蜂蜂蜜为8个(对应样品1、2、7、9、10、12、14、15)，占比53.3％，其他蜂蜜为意蜂蜂蜜。本实施例结果表明市场上确实存在着一定的以低价意蜂蜂蜜冒充高价中蜂蜂蜜的情况。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。

Claims

1.一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的区分鉴别方法，所述区分鉴别方法包括以下步骤：

(1)称取检测量的待测蜂蜜样品；

(2)使用HS-SPME-GC-MS对待测蜂蜜中挥发性碳氢化合物进行检测，得到检测谱图并依据谱图对待测蜂蜜样品中的顺-9-二十三烯(Cis-9-Tricosene，C9T)及其异构体、顺-9-二十五烯(Cis-9-Pentacosene，C9P)及其异构体进行定量；

(3)根据蜂蜜中C9T和C9P及其异构体的含量和C9T和C9P及其异构体的比例，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜；

所述的C9T的异构体为反-9-二十三烯(Iso-9-Tricosene)，所述的C9P的异构体为反-9-二十五烯(Iso-9-Pentacosene)；

步骤(2)中所述的HS-SPME-GC-MS的方法中，

1)HS-SPME条件为：

固相微萃取纤维为：30μm聚二甲基硅氧烷；

平衡时间：5-30min；

萃取温度：40-80℃；

萃取时间：5-60min；

解析时间：1-5min；

2)GC条件为：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱；

柱流量：1.5mL/min；

进样口温度：280℃；

载气：高纯氦气；

3)MS条件为：

离子源为EI源；

传输线温度为300℃；

离子源温度为230℃；

四极杆温度为150℃；

溶剂延迟时间为5min；

检测方式：全扫描模式+选择离子扫描模式，

检测目标物为C9T，定量离子m/z＝322.3，保留时间：8.27min，保留时间允许的偏差应小于0.3min，

检测目标物为C9P，定量离子m/z＝350.4，保留时间：9.45min，保留时间允许的偏差应小于0.3min；

2)当C9T>20mg/kg，RT>3.0，且C9P>30mg/kg，RP>4.0时，判定样品为意蜂蜂蜜；

RT为C9T与其异构体(Iso-9-Tricosene)峰面积的比值；

RP为C9P与其异构体(Iso-9-Pentacosene)峰面积的比值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中所述的蜂蜜样品为市售样品，检测量为1-5g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，萃取温度为60℃、萃取时间为30min。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

步骤(2)定量方法为：以C9T、C9P的标准物质绘制标准曲线，随后通过计算检测结果的峰面积，对C9T及其异构体、C9P及其异构体的含量进行定量。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

步骤(2)定量方法为：以C9T和C9P的添加浓度X为横坐标，以HS-SPME-GC-MS得出的C9T和C9P的定量离子的色谱峰面积Y为纵坐标，得到标准曲线，用于C9T和C9P的准确定量，标准曲线拟合方程为：

C9T：Y＝264.5X+778.5，线性相关系数R2＝0.9967；

C9P：Y＝272.4X+707.2，线性相关系数R2＝0.9980。

6.C9T及其异构体、C9P及其异构体在制备检测中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测试剂中的应用。