CN112587643A - 一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肝纤维化中药复方组合物，涉及中药复方组合物技术领域，包括下列重量份数的原料：黄连20‑30份、炮姜15‑25份、苦参13‑24份、青黛8‑15份、三七8‑14份、木香5‑15份、地榆炭4‑13份、甘草5‑15份，还公开了其制备方法，本发明能降低肝纤维化指标，对肝纤维化具有良好防治作用和效果，是一个极其有前途的中药新药，且没有副作用，具有较好的市场推广价值。

Description

一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及中药复方组合物技术领域，具体为一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法。
背景技术
肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化，因此它不是一个独立的疾病，肝纤维化的病因有很多，在临床上多见有病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等，据报道，肝炎在我国的发病率占总人口的10％以上，我国又是世界上的饮酒大国，加上环境污染和饮食结构的改变，目前，肝纤维化的发病率已在不断上升，现已成为我国卫生部门最关心、重视的课题之一，近年来，国内外学者对肝纤维化的形成机制，提出了一系列抗肝纤维化治疗药物与方法，如应用肾上腺皮质素，干扰素等治疗，但这些药物的疗效不能肯定，虽然有秋水仙在抗肝纤维化方面的治疗得到了肯定，但其具有较大的毒副作用，不易长期服用。
中草药及其制剂对抗肝纤维化的作用，一直是国内外医疗科研单位重点研究的课题之一，肝纤维化在中医证候中可以解释为肝病久病而致脾虚湿热证。近期，我国已开始出现相关复方抗肝纤维化中药制剂，但其均为中药大复方粗制剂，具有服用量大，服用周期长，疗效不确切，治疗机理难以研究等缺点，难以应付市场抗肝纤维化病人的需要，为此，提出一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗肝纤维化中药复方组合物，包括下列重量份数的原料：黄连20-30份、炮姜15-25份、苦参13-24份、青黛8-15份、三七8-14份、木香5-15份、地榆炭4-13份、甘草5-15份。
所述抗肝纤维化中药复方组合物，包括下列重量份数的原料：黄连22-28份、炮姜18-24份、苦参15-22份、青黛10-14份、三七10-13份、木香8-12份、地榆炭8-12份、甘草8-14份。
所述抗肝纤维化中药复方组合物，包括下列重量份数的原料：黄连25份、炮姜20份、苦参20份、青黛12份、三七12份、木香10份、地榆炭10份、甘草10份。
所述抗肝纤维化中药复方组合物，中药复方组合物的剂型为口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。
所述抗肝纤维化中药复方组合物，制备方法包括以下步骤：按重量配比称取各种原料药，粉碎，加入质量浓度为30％的乙醇-水溶液，恒温冷凝回流提取，提取2-4次，合并提取液，过滤，蒸馏除去乙醇，得提取液，浓缩，加入辅料，制备成中药复方组合物。
所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，所述各种原料药粉碎2-4次，粉碎时间为10-20min。
所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，中药粉碎物与乙醇-水溶液的质量比为1:5。
所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，中药粉碎物与乙醇-水溶液在70-100℃下缓慢搅拌120-180min，恒温冷凝回流提取。
所述抗肝纤维化中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种抗肝纤维化中药复方组合物及其制备方法，具备以下有益效果：肝纤维化在中医证候中可以解释为肝病久病的脾虚湿热证，而肝与大肠“相通”，本发明君药为黄连、炮姜，起到清肠止血，温脾止泻，平调寒热的作用，臣药为苦参、青黛、三七，起到清肠化湿，化瘀止血的作用，佐药为木香、地榆炭，起到调气活血，凉血止血的作用，使药为甘草，调和诸药。因此本中药复方组合物是一个极其有前途的中药新药，利于降低肝纤维化，且没有副作用，具有较好的市场推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的中药复方对LO2增殖活性影响示意图
图2为本发明实施例1的中药复方对LX2增殖活性影响示意图
图3为本发明实施例2的中药复方在40μg/ml剂量下可以显著降低肝纤维化相关指标示意图
图4为本发明实施例3的体内不同浓度中药复方对α-SMA的mRNA表达的影响示意图
图5为本发明实施例3的体内不同浓度中药复方对α1-procollagen的mRNA表达的影响示意图
图6为本发明实施例5中体内实验的染色实验显示示意图
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
取黄连20g、炮姜15g、苦参13g、青黛8g、三七8g、木香5g、地榆炭4g、甘草5g，粉碎2次，粉碎时间为10min，加入质量浓度为30％的乙醇-水溶液，中药粉碎物与乙醇-水溶液的质量比为1:5，在70℃下缓慢搅拌120min，恒温冷凝回流提取，提取2次，合并提取液，过滤，蒸馏除去乙醇，得提取液，浓缩，加入辅料，压片。
实施例2：
取黄连25g、炮姜20g、苦参18g、青黛16g、三七12g、木香12g、地榆炭8g、甘草10g，粉碎4次，粉碎时间为20min，加入质量浓度为30％的乙醇-水溶液，中药粉碎物与乙醇-水溶液的质量比为1:5，在85℃下缓慢搅拌150min，恒温冷凝回流提取，提取3次，合并提取液，过滤，蒸馏除去乙醇，得提取液，浓缩，加入辅料，灌胶囊。
实施例3：
取黄连30g、炮姜25g、苦参24g、青黛15g、三七14g、木香15g、地榆炭13g、甘草15g，粉碎3次，粉碎时间为15min，加入质量浓度为30％的乙醇-水溶液，中药粉碎物与乙醇-水溶液的质量比为1:5，在100℃下缓慢搅拌180min，恒温冷凝回流提取，提取4次，合并提取液，过滤，蒸馏除去乙醇，得提取液，浓缩，加入辅料，制备成颗粒剂。
实施例4：中药复方组合物对LO2和LX2细胞增殖活性的影响(体外实验)
为验证上述中药复方组合物的活性，采用上述实施例1制得的中药复方组合物作用于人星状细胞LX2以及人正常肝细胞LO2。
细胞株：人源性星状细胞LX2以及人源性正常肝细胞LO2
技术方法：
1、细胞的培养
人肝星状细胞LX2和人肝细胞LO2培养于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中。所有细胞均培养在37℃恒温培养箱(湿度95％，5％CO2浓度)中。
2、MTT法测定细胞增殖
取对数期的细胞消化后根据其增殖速度以不同密度(肝星状细胞2×104个/孔，肝细胞细胞1.5×104个/孔)接至96孔板，每孔100μL培养基。24h后，肝细胞和肝星状细胞组分别加入不同浓度实施例1所述中药复方组合物提取液(10μg/ml组、20μg/ml组、40μg/ml组)，正常对照组加入等量的PBS，各组设6个复孔。继续培养24h，加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h，然后吸掉上清，每孔加入200μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6复孔，计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100％。
图1结果所示，本发明实施例1的中药复方在体外对肝细胞增殖活性没有影响，图2结果所示，本发明实施例1的中药复方在体外抑制肝星状细胞增殖，并呈剂量依赖性。
实施例5：中药复方组合物对LX2细胞中肝纤维化相关特征蛋白表达的影响(体外实验)
为验证上述中药复方组合物的活性，采用上述实施例1制得的中药复方组合物作用于人星状细胞LX2。
技术方法：
1、细胞的培养
人肝星状细胞LX2培养于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中。所有细胞均培养在6孔板，37℃恒温培养箱(湿度95％，5％CO2浓度)中。各组加入不同浓度药物(实施例2制备的药品)，培养24h。
2、细胞蛋白提取和浓度测定
移除细胞培养液，用PBS清洗3次后抽吸干净培养皿中残留的PBS。按照蛋白裂解液(RIPA)：蛋白酶抑制剂(PMSF)＝100:1的比例加入者两种试剂，用枪头背面刮几分钟后，吸出放入1.5mL子弹头里；于漩涡震荡仪上混合均匀后置于-80℃过夜。(整个操作于冰上进行)。过夜后拿出蛋白，于冰上将蛋白融化(防止蛋白裂解)。预冷离心机，4℃，12000rpm，离心10min。吸取上清测蛋白浓度。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳和曝光
配置分离胶和浓缩胶，根据目的蛋白的分子量的大小选择相应浓度的分离胶(目的蛋白分子量越大，所需配置的分离胶的浓度越小)，参照表1进行配置。具体步骤：清洗并烘干玻璃板，固定在支架上，在玻璃板之间灌入按上表配制的12％或10％的分离胶，立即用去离子水封闭表面，于室温下聚合。当水封层与分离胶层之间出现明显界面时，表示分离胶的聚合已完成。弃去离子水，用滤纸吸干，再灌入4％的浓缩胶，插入梳子，待胶凝固后，小心拔去梳子。
表1不同分子量蛋白电泳凝胶的配置比例
Figure BDA0002877765160000051
上样，样品的上样量一般为50ug，根据所测的蛋白浓度计算出每个样品的上样体积后进行上样，在槽的一侧加入2μLMark作为电泳参照物。
电泳，保证电泳正负极无误的条件下开始电泳。电泳条件：0.02A/块胶，恒流；电泳约2h左右，至溴酚蓝跑出。
转膜，预先配置1L转移缓冲液并冷却至4℃，先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s后滤纸、凝胶一起放入电转移缓冲液中。按夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵顺序放好，小心去除所有气泡，PVDF膜位于阳极侧，凝胶位于阴极侧插入电泳槽中，倒入转膜缓冲液。恒压100V转移1.5-2小时(以上实验在冰上进行)。
封闭，转膜结束后取出PVDF膜，将PVDF膜置于用1*TBST配制的5％的脱脂奶粉中封闭1～2h。
结合一抗，将PVDF膜从封闭液中拿出(戴手套)，用1*TBST洗2次，之后于封口袋中加入配置好的一抗。于4℃结合过夜(最佳)。一抗的配制：用1*TBST溶解BSA，使其浓度为5％，(脱脂奶粉亦可，但易坏)，按照抗体说明书比例加入相应量的一抗。
结合二抗，将PVDF膜从一抗中拿出于1*TBST中清洗3次，边洗边摇晃，每次10min(少量多次)。之后之后置于用脱脂奶粉稀释的二抗溶液中，于摇床上摇2h。
化学发光，二抗孵育结束后用1*TBST洗3次，每次10min后于伯乐凝胶成像仪中对条带进行成像与分析。
图3结果所示，本发明实施例2的中药复方能够明显剂量依赖性的降低肝纤维化相关特征蛋白的表达，说明其能够有效抑制肝纤维化。
实施例6：中药复方组合物对小鼠肝脏中肝纤维化相关指标mRNA表达的影响(体内实验)
为验证上述中药复方组合物的活性，采用上述实施例1制得的中药复方组合物作用于小鼠。
技术方法：
1、四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型建立
SPF级雄性ICR小鼠(8周龄)，体重20-25g，由实验前，动物进行一周的适应性饲养。造模前，将小鼠饲养在标准条件下，室温为20±2℃，相对湿度为40±5％，光照/黑暗循环为12小时。使用四氯化碳(CCl4)和橄榄油[1:10(v/v)]的混合物通过腹腔注射(0.05mL/10g体重)诱导小鼠肝纤维化。灌胃给药ICR小鼠不同剂量本发明实施例3制备的中药复方：高剂量组(1200mg/kg)、中剂量组(600mg/kg)、低剂量组(300mg/kg)，正常组给与生理盐水灌胃。
2、引物序列设计
α-SMA(F)：CCGACCGAATGCAGAAGG
α-SMA(R)：ACAGAGTATTTGCGCTCCGGA
α1-procollagen-F：AGAGGAAGGAAAGCGAGGAG
α1-procollagen-R：GGACCAGCAACACCATCTG
GAPDH(F)：GGCCCCTCTGGAAAGCTGTG
GAPDH(R)：CCGCCTGCTTCACCACCTTCT
3、RNA提取
处死动物，取肝脏，放入10ml离心管中，加入1mLTrizol提取液，冰水中匀浆，5000s，10s连续匀浆3次，在通风橱中转移到1.5mL EP管中，室温放置5min，4℃，12000rpm离心5min，小心吸出上清到新的1.5mL EP管中；每1mLTrizol中加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后4℃、12000rpm、离心15分钟。离心后分为3层(下层红色的苯酚-氯仿层，上层无色水样)，RNA存在于水样中，大约为所加Trizol容积的60％。将上层水相吸入至新的1.5mLEP管中(约500μL左右)，每1mLTrizol加入0.5mL异丙醇，混匀后放于15-30℃条件下孵育中4℃、12000rpm、离心15分钟(离心前RNA不见，离心后RNA形成胶状物附于管底)。小心倒掉上清，留取沉淀。每1mL Trizol加入1mL现配的75％的乙醇(预冷)，漩涡振荡混合样品并在4℃、7500rpm、离心5分钟。尽可能的倒掉上清，置超净台风机干(约30分钟，此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)，再用20μL的DEPC水溶解待测。测RNA浓度，而后将所提取的RNA分装(每10μL一小管)保存于-80℃超低温冰箱中，或立即进行逆转录。
4、cDNA合成
在冰上解冻模板RNA，FastQuantcDNA第一链合成试剂盒中Oligo(dt)18primer、5xReaction Buffer、PiboLock RNase Inhibitor、10mM dNTP Mix、Revert Aid M-MuLVRT、RNase-Free ddH2O在冰上解冻，使用前各试剂涡旋仪上快速震荡混匀。
按照表2配制基因DNA去除体系，彻底混匀，简短离心，置65℃孵育5min，然后置于冰上。
表2gDNA反应去除体系
Figure BDA0002877765160000081
按照表3配制成反转录体系，
表3反转录体系
Figure BDA0002877765160000082
将反转录反应中的Mix，加入Gdna去除步骤的反应液中，充分混匀，42℃60min→70℃5min→室温，进一步扩增或-20℃保存。
5、PCR扩增反应
2XQuantiFastSYBR Green PCR Master、RNase-Free water于冰上溶解，按说明书配制Real-time PCR反应体系，见表4，在冰上进行，总体系20ul。
表4PCR反应体系
Figure BDA0002877765160000083
如图4、图5结果所示，本发明实施例的中药复方能够明显剂量依赖性的降低肝纤维化相关指标mRNA的表达，说明其能够有效抑制肝纤维化。
实施例7：血清生化检测评估中药复方在体内对肝纤维化进展的影响作用(体内实验)
为验证上述中药复方组合物的活性，采用上述实施例1制得的中药复方组合物作用于小鼠，以评估药物对体内肝纤维化进展相关血清学指标的影响。
技术方法：
1、四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型建立
SPF级雄性ICR小鼠(8周龄)，体重20-25g，由实验前，动物进行一周的适应性饲养。造模前，将小鼠饲养在标准条件下，室温为20±2℃，相对湿度为40±5％，光照/黑暗循环为12小时。使用四氯化碳(CCl4)和橄榄油[1:10(v/v)]的混合物通过腹腔注射(0.05mL/10g体重)诱导小鼠肝纤维化。灌胃给药ICR小鼠不同剂量中药复方：高剂量组(1200mg/kg)、中剂量组(600mg/kg)、低剂量组(300mg/kg)，正常组给与生理盐水灌胃。
2、血清ALT、AST、TBIL等指标的检测
血清中肝损伤指标ALT、AST、TBIL等指标的检测使用生化检测试剂盒，实验操作方法按照生化检测试剂盒说明书。
如表5结果所示，与四氯化碳模型组相比，本发明实施例的中药复方能够剂量依赖性的减少小鼠血清中ALT、AST、TBIL等指标。表明本发明实施例的中药复方在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中下调肝损伤指标ALT、AST、TBIL等，具有潜在的肝纤维治疗和肝脏保护作用。
表5动物血清学指标比较
Figure BDA0002877765160000091
实施例8：HE/Sirus Red/Masson/α-SMA染色(体内实验)
为验证上述中药复方组合物的活性，采用上述实施例1制得的中药复方组合物，配置成浓度为40μg/ml的药物，小鼠腹腔注射给药。
技术方法：
1、SPF级雄性ICR小鼠(8周龄)，体重20-25g，由实验前，动物进行一周的适应性饲养。造模前，将小鼠饲养在标准条件下，室温为20±2℃，相对湿度为40±5％，光照/黑暗循环为12小时。使用四氯化碳(CCl4)和橄榄油[1:10(v/v)]的混合物通过腹腔注射(0.05mL/10g体重)诱导小鼠肝纤维化。小鼠分为对照组、四氯化碳模型组和四氯化碳+40μg/ml剂量给药组。
2、动物喂养2个月后处死，取的各组小鼠肝脏，分别做HE/Sirus Red/Masson/α-SMA染色实验。
3、H&E染色
小鼠颈椎脱臼处死后，解剖，剥离肝脏，去除多余结缔组织，放置在PBS中清洗一遍。在4％多聚甲醛中充分固定。根据小鼠的解剖位置的冠状面，切取组织，放置在包埋盒中，用铅笔标注相关信息后进行组织的脱水、透明、浸蜡后进行H&E染色。
4、Masson染色
肝脏组织石蜡切片用Bouin液或Zenker液固定至过夜，使用流水冲洗至无色。天青石蓝染色5min，Mayer’s苏木素染色5min，用1％盐酸乙醇液分化，流水冲洗，丽春红酸性品红液染色5-10min，蒸馏水冲洗，用1％磷钼酸水溶液做处理5min，最后直接用苯胺蓝或亮绿染色5min，1％冰醋酸处理5min，95％乙醇、无水乙醇多次脱水，最后使用二甲苯做透明处理后中性树胶封固。在光学显微镜下观察并随机选取视野拍照。
5、苦味酸天狼星红(sirius red)染色
肝脏组织石蜡切片常规脱水。天青石蓝液染色处理5-10min后，蒸馏水洗3遍。天狼星红饱和苦味酸液染色处理15-30min。用无水乙醇分化与脱水。最后用二甲苯做透明处理，中性树胶封固。在光学显微镜下观察并随机选取视野拍照。
6、α-SMA染色，参考α-SMA免疫组化染色试剂盒说明书操作。
如图6结果所示，四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中肝脏结构紊乱，大量胶原沉积，肝纤维化病变明显。中药复方干预治疗后肝脏的结构逐渐恢复，胶原沉积减少，肝纤维化病变减轻。表明发明实施例的中药复方在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中缓解肝纤维化进程。
上述体内外结果表明，该中药复方有较好的抗肝纤维化作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，包括下列重量份数的原料：黄连20-30份、炮姜15-25份、苦参13-24份、青黛8-15份、三七8-14份、木香5-15份、地榆炭4-13份、甘草5-15份。
2.根据权利要求1所述抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，包括下列重量份数的原料：黄连22-28份、炮姜18-24份、苦参15-22份、青黛10-14份、三七10-13份、木香8-12份、地榆炭8-12份、甘草8-14份。
3.根据权利要求1所述抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，包括下列重量份数的原料：黄连25份、炮姜20份、苦参20份、青黛12份、三七12份、木香10份、地榆炭10份、甘草10份。
4.根据权利要求1至3任一项所述抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，中药复方组合物的剂型为口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。
5.根据权利要求1至3任一项所述抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：按重量配比称取各种原料药，粉碎，加入质量浓度为30％的乙醇-水溶液，恒温冷凝回流提取，提取2-4次，合并提取液，过滤，蒸馏除去乙醇，得提取液，浓缩，加入辅料，制备成中药复方组合物。
6.根据权利要求5所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，其特征在于，所述各种原料药粉碎2-4次，粉碎时间为10-20min。
7.根据权利要求5所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，其特征在于，中药粉碎物与乙醇-水溶液的质量比为1:5。
8.根据权利要求5所述抗肝纤维化中药复方组合物的制备方法，其特征在于，中药粉碎物与乙醇-水溶液在70-100℃下缓慢搅拌120-180min，恒温冷凝回流提取。
9.根据权利要求1所述抗肝纤维化中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
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