CN112553368A - 一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业技术领域，公开了一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，包括设计PCR引物，用PCR方法进行检测；进行亲本选择，并杂交得到F1代种子；将F1代种子种植成苗，收获F2代种子，将F2代种子播种，收获杂交子代；抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定；将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代；将得到的优选杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁以及组培苗的培育、筛选，并进行性状鉴定。本发明能够有效的选育糜子的优异产量性状品种；为糜子分子标记辅助选择育种提供了一个新的方法，在培养高产量糜子品种或研究中具有重要意义。

Description

一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用
技术领域
本发明属于农业技术领域，尤其涉及一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用。
背景技术
目前：糜子(Panicum miliaceumL.)属禾本科黍属，又称黍、稷，其脱皮后的产物一般称为黄米；至今已有一万年的栽培历史，在中国分布广泛，种质资源十分丰富，目前已收集保存8000多份。糜子生育期短，耐旱、耐瘠薄，多属粳糯两类，是重要的抗灾作物；中国的糜子栽培面积约100万hm 2，居世界第二位，在国民经济发展中具有非常特殊的作用。糜子所含营养非常丰富，糜子籽粒含量中8.6％-15.5％为蛋白质，2.6％-6.9％为脂肪，67.6％-75.1％为淀粉，3.5％-4.4％为膳食纤维，1.3％-4.3％为灰分。糜子籽粒蛋白质含量在小米、大米、玉米、高粱米、糜子、大麦和青稞中最高。糜子籽粒脂肪含量与玉米、糜子和高粱相近，高于大米、糜子。糜子籽粒淀粉含量与小米、大米等相近，其中糯性糜子直链淀粉含量在3.7％以下，优质糯性糜子籽粒不含直链淀粉，粳性糜子籽粒直链淀粉含量在4.5％-12.7％之间。糜子籽粒中大量元素有钾、镁、钙、磷等和微量元素有铁、铜、锌、硒等，其中磷、铁含量较大米和糜子高。此外，糜子籽粒中维生素含量也十分丰富的，其中核黄素、硫胺素和维生素E的含量都较大米和糜子高。
利用各种途径来提高糜子产量成为包括育种家在内的许多科学家的主要目的之一。传统的通过表型筛选的育种模式耗时和费力，而功能标记的开发为糜子育种过程中选育优异株系提供了更为方便快捷的方法。随着分子生物技术的发展，重要基因的功能不断被揭示，在作物遗传改良中高效利用这些基因已成为基因发掘的重要目标。分子标记辅助选择技术为提高目标性状选择效率，改良作物提供了一条新的有效途径。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的糜子育种方法费时费力，且现有技术中并无通过分子标记进行糜子育种的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用。
本发明是这样实现的，一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用包括以下步骤：
步骤一，选择与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的区域，并依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测；
所述依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测，具体为：
对糜子基因组DNA进行提取；
进行糜子基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，得到糜子基因组定性PCR扩增引物对；
利用TAIL-PCR方法进行PCR扩增；
所述利用TAIL-PCR方法进行PCR扩增的反应体系为：
第一轮反应：总体积15μL，2μL 1×PCR缓冲液，1μL 2mM dNTPs，0.2μL 5U Taq DNA聚合酶，11.8μL灭菌去离子水；
第二轮反应：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，1μL 2mM dNTPs，0.3μL 5U TaqDNA聚合酶，15.2μL灭菌去离子水和1μL 10倍稀释的第一轮PCR产物；
第三轮反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，1μL 5U Taq DNA聚合酶，22.5μL灭菌去离子水和1μL 20倍稀释的第二轮PCR产物；
进行糜子的定性PCR检测；所述糜子的定性PCR检测中的定性PCR反应体系为：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，0.6μL 5U Taq DNA聚合酶，0.5μL定性引物对，13.4μL灭菌去离子水；反应程序为：85℃，5min；90℃，30s，65℃，30s，70℃，30s，35个循环；70℃，5min；
进行糜子的定量PCR检测；所述糜子的定量PCR检测中的定量PCR反应体系为：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，2μL 2mM dNTPs，0.8μL 5U Taq DNA聚合酶，0.5μL定量引物对，14.2μL灭菌去离子水；反应程序为：95℃，3min；90℃，30s，70℃，30s，82℃，30s，45个循环；65℃，3min；
步骤二，选育高产的糜子品种作为母本，选择能检测到目标分子标记的糜子品种作为父本，将选择的母本与父本进行杂交，得到F1代种子；
步骤三，将F1代种子种植成苗，收获F2代种子，将F2代种子播种，收获杂交子代；
步骤四，抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，得到含有所述分子标记的杂交后代；
步骤五，将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代；
步骤六，将得到的优选杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到含有分子标记的优选杂交子代的组培苗；
步骤七，进行组培苗的培育、筛选，并进行性状鉴定，选取性产量相关性状鉴定优异的子代作为糜子新品种。
进一步，步骤一中，所述糜子基因分子标记为dCAPS-7D-SNP1；
所述糜子基因分子标记dCAPS-7D-SNP1为糜子基因组DNA中对应于序列表中序列1的第532位的核苷酸，所述dCAPS-7D-SNP1为A或C。
进一步，步骤一中，所述依据选取的区域分别设计PCR引物，具体为：所述PCR引物为能与糜子基因组DNA中所述糜子分子标记dCAPS-7D-SNP1上下游特异结合的两条单链DNA。
进一步，步骤二中，所述将选择的母本与父本进行杂交为：通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交。
进一步，所述通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交，具体包括以下步骤：
(1)将选择的糜子父本和糜子木本的成熟枝条嫁接到糜子砧木苗上；
(2)将嫁接后的砧木移栽进温室中，得到杂交亲本；
(3)对温室进行温度、光照的控制，满足糜子生长的光热需求；
(4)次年春天，在糜子亲本开花后进行自由授粉杂交，待雌花完全凋谢后移出温室继续生长，得到杂交子代。
进一步，步骤四中，所述抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，包括：以抽提出的杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA作为模板，利用设计的PCR引物进行PCR扩增、PCR检测及逆转录PCR检测；鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记。
进一步，所述鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记，包括：
采用限制性内切酶BamHⅠ处理PCR产物，得到酶切产物，检测所述酶切产物的序列和/或大小，根据所述酶切产物的DNA片段数确定待测糜子基因组中对应于序列1的第532位的核苷酸。
进一步，步骤四中，所述含有分子标记的杂交后代获取方法包括辐射诱变或基因定点突变。
进一步，步骤五中，所述将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代中，所述自交代数由实际育种进行需要确定。
进一步，步骤六中，所述组培苗的培育、筛选包括：
优选杂交子代的组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的基因或基因簇的量与转录量，考察其稳定性，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过对糜子的PCR定性和定量检测，能够实现检测特异性和灵敏度的提升，为糜子的PCR定性和定量检测提供依据，能够有效的选育糜子的优异产量性状品种。本发明为糜子分子标记辅助选择育种提供了一个新的方法，在培养高产量糜子品种或研究中具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用方法流程图。
图2是本发明实施例提供的依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测的流程图。
图3是本发明实施例提供的通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交的流程图。
图4是本发明实施例提供的抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定的流程图。
图5是本发明实施例提供的组培苗的培育、筛选的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用包括以下步骤：
S101，选择与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的区域，并依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测。
S102，选育高产的糜子品种作为母本，选择能检测到目标分子标记的糜子品种作为父本，将选择的母本与父本进行杂交，得到F1代种子。
S103，将F1代种子种植成苗，收获F2代种子，将F2代种子播种，收获杂交子代。
S104，抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，得到含有所述分子标记的杂交后代。
S105，将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代。
S106，将得到的优选杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到含有分子标记的优选杂交子代的组培苗。
S107，进行组培苗的培育、筛选，并进行性状鉴定，选取性产量相关性状鉴定优异的子代作为糜子新品种。
如图2所示，本发明实施例提供的依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测，具体为：
S201，对糜子基因组DNA进行提取。
S202，进行糜子基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，得到糜子基因组定性PCR扩增引物对。
S203，利用TAIL-PCR方法进行PCR扩增。
S204，进行糜子的定性PCR检测。
S205，进行糜子的定量PCR检测。
步骤S101中，本发明实施例提供的糜子基因分子标记为dCAPS-7D-SNP1；
所述糜子基因分子标记dCAPS-7D-SNP1为糜子基因组DNA中对应于序列表中序列1的第532位的核苷酸，所述dCAPS-7D-SNP1为A或C。
步骤S101中，本发明实施例提供的依据选取的区域分别设计PCR引物，具体为：所述PCR引物为能与糜子基因组DNA中所述糜子分子标记dCAPS-7D-SNP1上下游特异结合的两条单链DNA。
步骤S102中，本发明实施例提供的将选择的母本与父本进行杂交为：通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交。
如图3所示，本发明实施例提供的通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交，具体包括以下步骤：
S301，将选择的糜子父本和糜子木本的成熟枝条嫁接到糜子砧木苗上。
S302，将嫁接后的砧木移栽进温室中，得到杂交亲本。
S303，对温室进行温度、光照的控制，满足糜子生长的光热需求。
S304，次年春天，在糜子亲本开花后进行自由授粉杂交，待雌花完全凋谢后移出温室继续生长，得到杂交子代。
如图4所示，步骤S104中，本发明实施例提供的抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，包括：
S401，以抽提出的杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA作为模板。
S402，利用设计的PCR引物进行PCR扩增、PCR检测及逆转录PCR检测。
S403，鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记。
本发明实施例提供的鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记，包括：
采用限制性内切酶BamHⅠ处理PCR产物，得到酶切产物，检测所述酶切产物的序列和/或大小，根据所述酶切产物的DNA片段数确定待测糜子基因组中对应于序列1的第532位的核苷酸。
步骤S104中，本发明实施例提供的含有分子标记的杂交后代获取方法包括辐射诱变或基因定点突变。
步骤S105中，本发明实施例提供的将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代中，所述自交代数由实际育种进行需要确定。
如图5所示，步骤S106中，本发明实施例提供的组培苗的培育、筛选包括：
S501，优选杂交子代的组培苗进行壮苗培育。
S502，培育过程中分阶段检测所标记的基因或基因簇的量与转录量，考察其稳定性，淘汰稳定性量较差的子代。
S503，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用包括以下步骤：
步骤一，选择与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与糜子优良产量性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的区域，并依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测；
所述依据选取的区域分别设计PCR引物，进行PCR检测，具体为：
对糜子基因组DNA进行提取；
进行糜子基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，得到糜子基因组定性PCR扩增引物对；
利用TAIL-PCR方法进行PCR扩增；
所述利用TAIL-PCR方法进行PCR扩增的反应体系为：
第一轮反应：总体积15μL，2μL 1×PCR缓冲液，1μL 2mM dNTPs，0.2μL 5U Taq DNA聚合酶，11.8μL灭菌去离子水；
第二轮反应：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，1μL 2mM dNTPs，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，15.2μL灭菌去离子水和1μL 10倍稀释的第一轮PCR产物；
第三轮反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，1μL 5U Taq DNA聚合酶，22.5μL灭菌去离子水和1μL 20倍稀释的第二轮PCR产物；
进行糜子的定性PCR检测；所述糜子的定性PCR检测中的定性PCR反应体系为：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，0.6μL 5U Taq DNA聚合酶，0.5μL定性引物对，13.4μL灭菌去离子水；反应程序为：85℃，5min；90℃，30s，65℃，30s，70℃，30s，35个循环；70℃，5min；
进行糜子的定量PCR检测；所述糜子的定量PCR检测中的定量PCR反应体系为：总体积20μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，2μL 2mM dNTPs，0.8μL 5U Taq DNA聚合酶，0.5μL定量引物对，14.2μL灭菌去离子水；反应程序为：95℃，3min；90℃，30s，70℃，30s，82℃，30s，45个循环；65℃，3min；
步骤二，选育高产的糜子品种作为母本，选择能检测到目标分子标记的糜子品种作为父本，将选择的母本与父本进行杂交，得到F1代种子；
步骤三，将F1代种子种植成苗，收获F2代种子，将F2代种子播种，收获杂交子代；
步骤四，抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，得到含有所述分子标记的杂交后代；
步骤五，将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代；
步骤六，将得到的优选杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到含有分子标记的优选杂交子代的组培苗；
步骤七，进行组培苗的培育、筛选，并进行性状鉴定，选取性产量相关性状鉴定优异的子代作为糜子新品种。
2.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤一中，所述糜子基因分子标记为dCAPS-7D-SNP1；
所述糜子基因分子标记dCAPS-7D-SNP1为糜子基因组DNA中对应于序列表中序列1的第532位的核苷酸，所述dCAPS-7D-SNP1为A或C。
3.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤一中，所述依据选取的区域分别设计PCR引物，具体为：所述PCR引物为能与糜子基因组DNA中所述糜子分子标记dCAPS-7D-SNP1上下游特异结合的两条单链DNA。
4.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤二中，所述将选择的母本与父本进行杂交为：通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交。
5.如权利要求4所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，所述通过人工授粉的方式进行母本与父本的杂交，具体包括以下步骤：
(1)将选择的糜子父本和糜子木本的成熟枝条嫁接到糜子砧木苗上；
(2)将嫁接后的砧木移栽进温室中，得到杂交亲本；
(3)对温室进行温度、光照的控制，满足糜子生长的光热需求；
(4)次年春天，在糜子亲本开花后进行自由授粉杂交，待雌花完全凋谢后移出温室继续生长，得到杂交子代。
6.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤四中，所述抽提杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA进行分子鉴定，包括：以抽提出的杂交子代不同生长发育阶段的叶片组织中的总DNA及总RNA作为模板，利用设计的PCR引物进行PCR扩增、PCR检测及逆转录PCR检测；鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记。
7.如权利要求6所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，所述鉴定糜子DNA基因组中是否含有所述分子标记，包括：
采用限制性内切酶BamHⅠ处理PCR产物，得到酶切产物，检测所述酶切产物的序列和/或大小，根据所述酶切产物的DNA片段数确定待测糜子基因组中对应于序列1的第532位的核苷酸。
8.如权利要求6所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤四中，所述含有分子标记的杂交后代获取方法包括辐射诱变或基因定点突变。
9.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤五中，所述将得到的含有所述分子标记的杂交后代自交多代得到优选的杂交子代中，所述自交代数由实际育种进行需要确定。
10.如权利要求1所述糜子基因分子标记在鉴定糜子产量相关性状中的应用，其特征在于，步骤六中，所述组培苗的培育、筛选包括：
优选杂交子代的组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的基因或基因簇的量与转录量，考察其稳定性，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399513A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 中国农业科学院作物科学研究所 小麦基因TaSPL20‑7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用
CN111296273A (zh) * 2020-02-18 2020-06-19 上海市农业科学院 一种具有软米基因杂交水稻恢复系的选育方法

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