CN112553216A

CN112553216A - 一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi-jx及其抗病育种应用

Info

Publication number: CN112553216A
Application number: CN202011551949.2A
Authority: CN
Inventors: 李爱宏; 肖宁; 蔡跃; 吴云雨; 余玲; 周长海; 潘存红; 李育红; 刘广青; 黄年生; 张小祥; 季红娟; 王志平; 陈梓春
Original assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112553216B

Abstract

本发明公开了一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi‑jx及其抗病育种应用。本发明通过全基因组关联分析的方法在水稻第12号染色体上鉴定到一个新的稻瘟病抗性基因Pi‑jx，进一步通过基因编辑以及过表达的方法验证了该基因的抗病分子功能。针对Pi‑jx编码框第2552位碱基能特异性区别抗病、感病等位类型，我们开发了该位点的特异性KASP分子标记pi‑jx‑kasp2552，利用该标记通过分子标记辅助选择的方法，将Pi‑jx导入到感病品种07GY31中，实现了导入系稻瘟病抗性水平的提升和新的抗病种质资源创制。

Description

一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi-jx及其抗病育种应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi-jx以及抗病育种应用。

背景技术

稻瘟病是威胁世界水稻安全生产的最主要真菌类病害之一，全球每年由稻瘟病引起的稻谷减产达10％～30％。近年来，稻瘟病在我国西南、长江中下游和东北等稻作区持续大爆发，给我国水稻安全生产带来了巨大隐患(何峰等,2014；Wang et al.2018)。利用稻瘟病抗性基因培育抗病品种是防治此类病害最为经济有效的方法，迄今为止已经鉴定出100多个抗性基因，至少31个已被克隆(Xiao et al.,2020)，已克隆基因中只有少数表现出兼顾苗瘟、穗瘟广谱抗性特征，例如Pigm、Piz-t等(Deng et al.,2017；Wu et al.,2017,2019)。因此，克隆新的兼顾苗瘟、穗瘟抗性基因对丰富抗病基因资源和培育广谱抗性品种具有重要意义。

全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)是利用自然种质群体间连锁不平衡快速定位目标基因的遗传方法，利用该方法可以实现已克隆抗病基因变异类型的鉴定和新基因的挖掘(Wang et al.2014；Mgonja et al.2016；Kang et al.2016)。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种针对特异性SNP以及插入/缺失(insertion-deletion,InDels)进行基因分型的技术，利用该技术开发稻瘟病抗性基因中特异性SNP位点的分子标记可快速、高通量筛选育种群体中的抗病基因型，加速育种进程，目前已在作物分子育种中被广泛应用。

本发明通过全基因组关联分析的方法挖掘新的兼顾苗瘟、穗瘟广谱抗性基因，并通过抗病基因功能性KASP标记开发实现抗病种质的快速创制，该发明对培育抗病品种具有重要应用价值。

参考文献：

何峰,张浩,刘金灵,王志龙,王国梁.水稻抗稻瘟病天然免疫机制及抗病育种新策略.遗传,2014,36(8):756-765.

Deng Y.et al.Epigenetic regulation of antagonistic receptors confersrice blast resistance with yield balance.Science,2017,355:962-965.

Kang H.et al.Dissection of the genetic architecture of riceresistance to the blast fungus Magnaporthe oryzae.Mol Plant Pathol,2016,17(6):959-72.

Mgonja EM.et al.Genome-wide association mapping of rice resistancegenes against Magnaporthe oryzae isolates from four Africancountries.Phytopathology,2016,106(11):1359-1365.

Wang CH.et al.Genome-wide association study of blast resistance inindica rice.BMC Plant Biol,2014,14:311.

Wang J.et al.A single transcription factor promotes both yield andimmunity in rice.Science,2018,7:361(6406):1026-1028.

Zhao HJ.et al.The rice blast resistance gene Ptr encodes an atypicalprotein required for broad-spectrum disease resistance.Nat Commun,2018,9:2039.

Wu YY.et al.Characterization and evaluation of rice blast resistanceof Chinese indica hybrid rice parental lines.The Crop Journal,5(6):509–517(2017)

Wu YY.et al.Development and evaluation of Near isogenic lines withdifferent blast resistance alleles at Piz locus in japonica rice from thelower region of yangtze river,China.Plant Disease,101(7):1283–1291(2017).

Wu YY.et al.Comprehensive evaluation of resistance effects ofpyramiding lines with different broad-spectrum resistance genes againstMagnaporthe oryzae in rice(Oryza sativa L.),Rice,12:11(2019).

Xiao N.et al.Strategy for Use of Rice Blast Resistance Genes in RiceMolecular Breeding.27(4):263-277,(2020)

发明内容

本发明的目的是提供一种新的兼顾苗瘟、穗瘟稻抗性基因“Pi-jx”的核苷酸序列与氨基酸序列。同时，提供Pi-jx基因的功能特异性分子标记用于感病品种的抗性改良。

本发明是这样实现的：

项目组前期工作中从稻瘟病常年重发的武陵山区分离到一种强致病性菌株R5-1，对Piz-t、Pi9和Pi2等广谱抗病基因表现出致病能力。

根据R5-1鉴定199份重测序粳稻品种的抗病表型，利用GWAS的方法在水稻第12号染色体23.15Mb附近检测到一个对R5-1免疫的抗性位点Pi-jx，该位点为一个新的抗性位点，目前尚未有研究报道。进一步精细定位以及抗病功能验证，最终确认了Pi-jx的候选基因为LOC_Os12g37740。

基于此，本发明克隆的Pi-jx的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸序列长度为2922bp，由三个外显子组成，根据预测为典型的NBS-LRR抗病基因，其中103-409肽段为RX-CC结构域，601-1464为NB-ARC结构域，1729-2919为LRR结构域。该基因编码的蛋白具有稻瘟病抗性，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸数目为973个。

所述基因Pi-jx编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的基因在抗稻瘟病水稻育种中的应用。

鉴于Pi-jx抗病、感病等位基因型在CDS序列的第2552碱基存在特异性差异，抗病品种中该位点为“C”，而感病品种中为“T”，我们设计了该基因的功能特异性分子标记Pi-jx-kasp2552，利用该标记通过分子标记辅助选择的方法成功提高了感病品种的苗瘟和穗瘟抗性。

稻瘟病抗性基因Pi-jx的功能特异性KASP分子标记，该分子标记引物如SEQ IDNO:3～SEQ ID NO:5所示，所述的KASP分子标记中包含一个位于Pi-jx基因CDS序列的第2552碱基处的与稻瘟病抗性相关的SNP，抗病品种中该位点为“C”，而感病品种中为“T”。

用于扩增权利要求4所述分子标记的特异性引物，其特征在于，如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:5所示。

所述的分子标记在水稻稻瘟病种质材料抗性鉴定或筛选，或抗性基因检测中的应用。

一种水稻稻瘟病抗性标记辅助育种方法，包括检测本发明所述的分子标记的步骤。

作为本发明的一种优选，所述的方法包括如下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用本发明所述的引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定水稻材料对稻瘟病的抗性。

有益效果：

本发明克隆的Pi-jx基因序列可作为抗性基因供体，针对感病等位基因，利用分子标记辅助选择的方法，导入感病品种遗传背景进而提高其稻瘟病抗性；亦可作为外源DNA片段，通过转基因的方式提高转化体的稻瘟病抗性，培育出新品种。第三，基于公布的Pi-jx抗病基因序列可作为基因编辑的模板序列，通过基因编辑的手段对感病品种中的感病等位基因型进行靶向改良，提升植株的稻瘟病抗性水平。本发明中的功能特异性分子标记可以适用于任何遗传背景下的Pi-jx的种质资源筛、转基因育种、基因聚合以及抗性育种，实现育种效率提高和新的抗病种质资源创制。

综上所述，无论通过何种方式使植物体获得稻瘟病抗性，只要其应用了本发明提供的如上述的Pi-jx抗稻瘟病基因或蛋白使植物体获得稻瘟病抗性即在本发明的保护范围。若本领域科研人员对上述核酸分子或蛋白进行改造使其获得更强的抗病性，也在本专利保护范围内。同时，鉴定该Pi-jx基因的特异性分子标记也在本发明的保护范围内。

附图说明

图1稻瘟病抗性新基因Pi-jx的定位

A：Piz-t、Pi9和Pi2单基因系对稻瘟病菌株R5-1的苗瘟、穗瘟表型，R：抗病表型，S：感病表型。B：利用R5-1菌株对199份重测序粳稻品种进行GWAS抗病位点的定位；D：Pi-jx区间精细物理图谱和候选基因。

图2Pi-jx候选基因抗病功能的验证

A：Pi-jx候选基因ORF1受菌株R5-1诱导表达，*:P<0.01。B：ORF1基因具有典型的NBS、LRR、RX-CC蛋白结构域；C：CRISPR/Cas9编辑候选基因ORF1后获得不同类型的突变体；C：ORF1编辑系的苗瘟、穗瘟抗性普遍下降，R：抗病表型；S：感病表型，接种菌株为R5-1；E:ORF1的编码框连接UBI启动子转化感病品种07GY31，过表达转基因系的苗瘟、穗瘟抗性呈提高趋势，接种菌株为R5-1。

图3Pi-jx编辑系、过表达转基因系的穗瘟抗谱鉴定

A：Pi-jx编辑系接种江苏、安徽、湖北等地区10个菌株后穗瘟抗性呈普遍下降趋势；B：Pi-jx过表达转基因系接种江苏、安徽、湖北等地区10个菌株后穗瘟抗性呈普遍上升趋势。Jun1、Jun2、Jun3采自江苏，Jun4、Jun5、Jun6、Jun7采自安徽，Jun8、Jun9、Jun10采自湖北。

图4Pi-jx基因特异性KASP分子标记开发及育种应用

A:Chr12:23,167,642(日本晴，MSU4.0)为能区别Pi-jx抗病、感病等位基因型的特异性SNP变异位点；B:特异性SNP变异位点开发的KASP标记(Pi-jx-kasp2552)的分型效果；C:利用Pi-jx-kasp2552开展分子标记辅助选择，在感病品种07GY31背景下导入Pi-jx，创制穗瘟抗性提高的新种质。

具体实施方式：

实施例1 新的稻瘟病抗性基因Pi-jx的克隆

1.1 稻瘟病抗病位点Pi-jx的定位

项目组前期工作中从稻瘟病常年重发的武陵山区分离到一种强致病性的稻瘟病菌株“R5-1”，利用该菌株接种Piz-t、Pi9和Pi2单基因系的幼苗叶片和孕穗幼穗后，以上单基因系均表现出感病表型(图1A、B)。但是，来自嘉兴地区的品种(Xiushui134)对R5-1表现出抗病表型，因此该品种中可能存在新的稻瘟病抗性位点，我们对此进行了进一步研究，方法如下：

1.1.1 测序品种基因型分析。利用国内外搜集的199份籼稻、粳稻品种进行简易基因组测序，参考基因组为日本晴参考基因组(IRGSP-1.0，https://rapdb.dna.affrc.go.jp)，序列比对分析软件为BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net)，SNP信息提取质量控制参数设置为：每个位点的mapping质量值大于20、变异质量值大于50，而且每个碱基至少有2个以上reads数据的支持，MAF值>0.05，SNP提取软件为GATKV4.1.4.1。

1.1.2 抗性表型鉴定。使用菌株R5-1鉴定以上重测序水稻品种的苗期稻瘟病抗性，病级调查标准参照“水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程”(国家农业行业标准NY/T2646-2014)中所述的苗瘟调查分级标准。

1.1.3 Pi-jx定位抗病位点。将以上获得的品种基因型和抗病表型分别导入Tassle(5.0)软件中，使用混合线性模型方法，在水稻第12号染色体上定位到一个新的抗性位点“Pi-jx”(图1C)。根据最显著SNP对应的物理位置，Pi-jx的候选区间在第12号染色体的23,163,515..23,183,362区间内，内部存在两个候选基因，即ORF1：LOC_Os12g37740和ORF2：LOC_Os12g37750(图1D)。

1.2 稻瘟病抗病位点Pi-jx候选基因确定

1.2.1 ORF1响应R5-1诱导表达。为进一步明确Pi-jx的候选基因，我们利用R5-1接种抗病品种Xiushui134以及感病对照07GY31幼苗3～4期的叶片，分别取剪取部分叶片于RNase-free离心管中，置于-80℃冰箱备用，设置3个重复。随后使用R5-1稻瘟病菌侵染叶片，方法如1.1.2，剪取适量感染的叶片于RNase-free离心管中，设置3个重复。将感染前与感染后(12h、24h、36h、48h)的叶片液氮研磨粉碎，使用植物组织RNA提取试剂盒提取RNA并进行反转录，使用荧光定量PCR的方法分析ORF1和ORF2的表达量变化，结果表明仅ORF1在受R5-1病菌侵染后表达量显著增加(图2A)，因此，初步判断Pi-jx的候选基因为LOC_Os12g37740，该基因属于具有NBS-LRR典型结构域的抗病基因(图2B)。

1.2.2 LOC_Os12g37740具有稻瘟病抗病功能。为进一步验证Pi-jx候选基因的稻瘟病抗病功能，我们设计了该基因的CRISPR/Cas9编辑载体，转化携带Pi-jx的水稻品种Xiushui134，获得纯合的不同突变类型(图2C)，每个系收取适量种子用于稻瘟病抗性鉴定，幼苗叶片接种菌株R5-1，方法如1.1.2步骤，结果表明不同突变类型的编辑系较野生型均表现出感病表型(图2D)。同时，我们通过过表达方式进一验证Pi-jx的稻瘟病抗病功能，我们将Pi-jx的CDS序列构建到含ubi启动子的过表达载体，并转化高感稻瘟病水稻品种07GY31，获得Pi-jx过表达的纯合转基因株系。具体方法如下：

(1)Pi-jx CDS序列的克隆。使用植物组织RNA提取试剂盒提取叶片RNA并进行反转录得到cDNA，并以此为模板，使用前引物5'-AGGACCGGTCCCGGGGGATCCATGGCGATTTCTTCCT-3'和后引物5'-GCCCTTGCTCACCATGGATCCTCAATTAATTGTATC-3'进行扩增，得到Pi-jx的CDS序列。

(2)ubi1-pCAMBIA1301载体的酶切与重组。使用BamHI核酸内切酶对载体进行酶切得到线性载体，利用DNA重组酶将Pi-jx的CDS序列构建到载体上。

(3)重组载体的转化与鉴定。将重组载体导入根癌农杆菌EHA105，采用农杆菌介导法，将候选基因转化到水稻品种07GY31中，并利用潮霉素的方法进行鉴定，最终得到阳性植株。

每个阳性株系收取适量种子用于苗期划伤接种鉴定，苗瘟抗性表明，不同过表达转化系较野生型对R5-1均表现抗病表型(图2E)。

1.2.3 Pi-jx具有广谱穗瘟抗性。为进一步明确Pi-jx穗瘟的广谱抗性，将1.2.2中的Pi-jx的基因编辑系以及过表达基因系进行穗瘟抗性鉴定，采集江苏、安徽、湖北等地区的10个菌株用于穗瘟接种鉴定，具体鉴定方法如下：接种稻瘟病菌株孢子悬浮液中孢子体密度为30～35个/视野(100倍)，接种时期和方法参照“一种提高稻瘟病穗瘟抗性鉴定准确性的方法”(专利号ZL201510658808.3)，每个病菌随机接种转基因系的10个单穗，接种后的单株抽穗40天后取接种鉴定的单穗考察结实率，结果表明Pi-jx敲除编辑系结实率较野生型显著下降趋势，下降幅度在20％～60％之间(图3A)，同时过表达转基因系较野生型的结实率也显著提高，提升幅度在16％～65％之间(图3B)。

实例2 Pi-jx的抗病育种应用

2.1 Pi-jx功能特异性分子标记的设计

通过对42份抗病水稻品种与619份感病水稻品种中Pi-jx基因的靶向测序，我们发现该基因CDS序列的第2552处碱基存在一个特异性SNP位点，该位点能有效区别抗病、感病基因型，在日本晴参考基因(MSU4.0版本)物理位置为Chr12:23,167,642，携带抗病基因型Pi-jx的品种在该位点为“C”，携带感病基因型pi-jx的品种在该位点为“T”(图4A)。基于该SNP位点，我们设计了KASP分子标记“pi-jx-kasp2552”的引物，如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；具体基因型检测步骤如下：

2.1.1 提取水稻叶片DNA，以其为模板，以pi-jx-kasp2552为引物，进行PCR扩增，反应体系约5μL。反应体系为：20ng/μL的DNA 2.5μL，2x KASP Master mix 2.5μL，KASPAssay mix(上下游引物混合物)0.07μL，将体系置于384孔PCR仪中进行反应。

2.1.2 PCR扩增程序为94℃预变性15min；94℃变性20s，55℃60s，循环10次(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃复性60s，循环26次。

2.1.3 循环结束后置于384孔荧光定量PCR仪中检测分型结果(图4B)。

2.2 Pi-jx抗病育种应用

2.2.1 07GY31是高感稻瘟病的粳稻品种，以其为母本，携带抗病基因Pi-jx的Xiushui134为父本，杂交获得F₁。

2.2.2 种植20株F₁单株，以07GY31为轮回亲本，回交获得87粒BC₁F₁种子。田间种植60株BC₁F₁单株，并利用步骤2.1中开发的KASP标记pi-jx-kasp2552检测每个单株的基因型，从中选择携带Pi-jx的6个单株与轮回亲本07GY31进行回交，共获得153粒BC₂F₁种子。

2.2.3 田间种植120株BC₂F₁单株，并利用KASP标记pi-jx-kasp2552检测每个BC₂F₁单株的基因型，从中选择携带Pi-jx基因型的10个单株与轮回亲本07GY31进行回交获得265粒BC₃F₁种子。

2.2.4 田间种植200株BC₃F₁单株，每个单株检测Pi-jx基因型，从中筛选获得携带Pi-jx基因型的121个单株，淘汰部分农艺性状差的单株，共获得6个BC₃F₁单株，自交后获得BC₃F₂株系，每个株系种植20株，并检测Pi-jx基因型，每个株系选择基因型纯合、农艺性状优良的1个单株，共获得6个BC₃F₃株系，每个株系经过田间产量比较，最终获得1个在农艺性状上与轮回亲本基本一致的株系(命名为NIL-1^Pi-jx)(表1)。按步骤1.2.3进行穗瘟抗性鉴定，结果表明，携带有Pi-jx的NIL-1^Pi-jx较轮回亲本07GY31穗瘟显著提高(图4C)。

表1 Pi-jx近等基因系的农艺性状

注：不同字母表示两者间存在显著差异

序列表

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi-jx及其抗病育种应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2922

<212> DNA

<213> 水稻日本晴(Oryza sativa)

<400> 1

atggcgattt cttcctcagg cgctgcggtt ccattggccg gtctcttgca gagcacacca 60

tacccacgaa cagagagggg gatggaagct gtcgtatgcg catcacatgg agttataggg 120

tccctgctat ggaagctaag tgccttgctc tctgatgaat ataaccttct cactggtgtt 180

aagagtaata ttatattcct taaagctgag cttgagagca tagatgtttt cctcaagaag 240

atgtatgagt ttgaggaccc cgatgagcaa tctttgttct ggatgaagga gttcagggag 300

ctgtcctatg acattgaaga catcattgat gcttctatgt tctcccttgg ttatgagtcc 360

aatcgcagac cccgtggctt caaggggttt gctggcaggt gcatggactt cttgacaaat 420

gtcaagacgc gccattggat tgccaagaaa atccaatgtc tcaaatgctg tgttatagaa 480

gctagcaatc ggcgtgcaag gtacaaggtc gatggttctg tctccaaact gagtaggaca 540

agcttagacc ctcgcttacc agcattctac acagagacga caaggcttgt tggaattgat 600

ggcccaaggg ataaactcat caagatgcta gtggaagggg acgacgcatt ggtgcatcag 660

ctgaaggtgg tctccattgt tggatttgga ggccttggaa agactactct tgcaaatgaa 720

gtgtgccgga agcttgaagg acaatttaag tatcaagctt ttgtgtcagt gtcccaaaaa 780

ccagacatta agaagattct gagacatata ctctctcaga tctgctggcg agagtgtatc 840

agtgatgaag catgggatga gcagcagctc atccacacaa taagacaatt ccttaaggat 900

aagaggtatt ttattgttat cgatgatata tggagcacat cagcatggag aacaatcaaa 960

tgtgcttttc ccgaaaataa ctgttccagt agaatattga cgacgacacg tatcatcgca 1020

gttgctaagt attgttgctc acctcaccat gacaatgtat atgaaataaa gcctcttggt 1080

gcaattcact ctaaaagctt atttttcaaa cgaacttttg gttctgaaga taaatgccct 1140

cttcatctga aagaagtttc taatgcaatc ttgagaaaat gtggtggctt gccactggga 1200

attatcacag tagctagctt attggctaat aaagctagta caaaagaaga atgggagagc 1260

atacataatt ctattggttc agctcttgaa aaagatacag atatggaaga aatgaaaagg 1320

atattgctcc ttagttatga tgatcttcct taccatttga agacatgttt gctatatcta 1380

agtatttttc cagaagatta cgagatcaag agagatcggt taataaggag atggattgct 1440

gaaggtttca tccctacaga aggggtgcat gatatggagg aagtaggcga atgctatttc 1500

aacgatctta tcaacaggag tatgattcta ccagttaata tccaatatga tggtcgagct 1560

gatgcttgtc gtgtgcatga tatgattctt gatctcatca tatccatatc tgtcaaagaa 1620

aattttgtaa ccttgcacgg tgaccaaaac tacaaaatag tgcaacaaaa taaggttcgt 1680

cgcctatccc tcaactatca tgctcgagaa gatataatga taccatcaag tatgattgtt 1740

tctcatgtcc gatccctcac tatctttgga tatgctgaac atatgcctgc tctgtcaaaa 1800

ttgcaattta tgcgagtgtt agatgtagaa aataaaatgg tgttggatca cagttttctc 1860

aagcatatac acaggctttc tcaattgaag tacctgcgac tcaatgtaag aagaatcact 1920

gcacttcctg aacaactagg agaattgcag aatttgcaga ccttagactt aagatggaca 1980

caaataaaga aattgccatc tagtatcgtt cgactgcaga aattagtatg cctaagggta 2040

aacagtttag aattgcctga agggattgga aatctgcaag ctctacaaga attatcagag 2100

attgaaatca accacaatac atcagtgtat tctctgcagg agctgggaaa tctgaagaaa 2160

ctaagaattc ttgggctgaa ttggagcatc agtgattcaa attgtgacat caaaatttat 2220

gcagataact tagtcacgtc cctctgtaaa ctaggcatgt tcaatcttcg atctatacaa 2280

attcaaggtt atcatattat ttcccttgat ttcttactgg attcttggtt tcctcctcct 2340

catctcctcc agaaatttga gatgtccata agctactttt tccccagaat cccaaagtgg 2400

atagagtcac ttgagtacct cagttaccta gacatctaca tcaacccagt ggatgaggaa 2460

acattccaaa ttcttgcggg cttgccgtct ttaatatttc tttggatatc ctctagagca 2520

gcaaccccta aaaaagggtt aattatcagc tgtaatgggt tccagtgtct gagggagctc 2580

tacttcacct gttgggaaag caagacaggt atgatgtttg aagcaggagc catgccaaaa 2640

cttgaaaatc ttcgggttcc atataatgca tgtgatatat gctctttgaa tggtggtatg 2700

gattttggca tccaacacct ctgttccctg aaacatctcc atgttgagat tatttgccgt 2760

ggtgcaaagc ttcaggaggt ggaggccttg gagaatgcta tcaaaagcgc agctggcctc 2820

ctttctgatg agctcacttt tgaagtaagt agatgggatg aagaagagat tatcgatatg 2880

gaccaagaac tggcagaaga tgattttgat acaattaatt ga 2922

<210> 2

<211> 973

<212> PRT

<213> 水稻日本晴(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ala Ala Val Pro Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Gln Ser Thr Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Gly Met Glu Ala Val Val

20 25 30

Cys Ala Ser His Gly Val Ile Gly Ser Leu Leu Trp Lys Leu Ser Ala

35 40 45

Leu Leu Ser Asp Glu Tyr Asn Leu Leu Thr Gly Val Lys Ser Asn Ile

50 55 60

Ile Phe Leu Lys Ala Glu Leu Glu Ser Ile Asp Val Phe Leu Lys Lys

65 70 75 80

Met Tyr Glu Phe Glu Asp Pro Asp Glu Gln Ser Leu Phe Trp Met Lys

85 90 95

Glu Phe Arg Glu Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Ile Asp Ala Ser

100 105 110

Met Phe Ser Leu Gly Tyr Glu Ser Asn Arg Arg Pro Arg Gly Phe Lys

115 120 125

Gly Phe Ala Gly Arg Cys Met Asp Phe Leu Thr Asn Val Lys Thr Arg

130 135 140

His Trp Ile Ala Lys Lys Ile Gln Cys Leu Lys Cys Cys Val Ile Glu

145 150 155 160

Ala Ser Asn Arg Arg Ala Arg Tyr Lys Val Asp Gly Ser Val Ser Lys

165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Leu Asp Pro Arg Leu Pro Ala Phe Tyr Thr Glu

180 185 190

Thr Thr Arg Leu Val Gly Ile Asp Gly Pro Arg Asp Lys Leu Ile Lys

195 200 205

Met Leu Val Glu Gly Asp Asp Ala Leu Val His Gln Leu Lys Val Val

210 215 220

Ser Ile Val Gly Phe Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Asn Glu

225 230 235 240

Val Cys Arg Lys Leu Glu Gly Gln Phe Lys Tyr Gln Ala Phe Val Ser

245 250 255

Val Ser Gln Lys Pro Asp Ile Lys Lys Ile Leu Arg His Ile Leu Ser

260 265 270

Gln Ile Cys Trp Arg Glu Cys Ile Ser Asp Glu Ala Trp Asp Glu Gln

275 280 285

Gln Leu Ile His Thr Ile Arg Gln Phe Leu Lys Asp Lys Arg Tyr Phe

290 295 300

Ile Val Ile Asp Asp Ile Trp Ser Thr Ser Ala Trp Arg Thr Ile Lys

305 310 315 320

Cys Ala Phe Pro Glu Asn Asn Cys Ser Ser Arg Ile Leu Thr Thr Thr

325 330 335

Arg Ile Ile Ala Val Ala Lys Tyr Cys Cys Ser Pro His His Asp Asn

340 345 350

Val Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Gly Ala Ile His Ser Lys Ser Leu Phe

355 360 365

Phe Lys Arg Thr Phe Gly Ser Glu Asp Lys Cys Pro Leu His Leu Lys

370 375 380

Glu Val Ser Asn Ala Ile Leu Arg Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Gly

385 390 395 400

Ile Ile Thr Val Ala Ser Leu Leu Ala Asn Lys Ala Ser Thr Lys Glu

405 410 415

Glu Trp Glu Ser Ile His Asn Ser Ile Gly Ser Ala Leu Glu Lys Asp

420 425 430

Thr Asp Met Glu Glu Met Lys Arg Ile Leu Leu Leu Ser Tyr Asp Asp

435 440 445

Leu Pro Tyr His Leu Lys Thr Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Ile Phe Pro

450 455 460

Glu Asp Tyr Glu Ile Lys Arg Asp Arg Leu Ile Arg Arg Trp Ile Ala

465 470 475 480

Glu Gly Phe Ile Pro Thr Glu Gly Val His Asp Met Glu Glu Val Gly

485 490 495

Glu Cys Tyr Phe Asn Asp Leu Ile Asn Arg Ser Met Ile Leu Pro Val

500 505 510

Asn Ile Gln Tyr Asp Gly Arg Ala Asp Ala Cys Arg Val His Asp Met

515 520 525

Ile Leu Asp Leu Ile Ile Ser Ile Ser Val Lys Glu Asn Phe Val Thr

530 535 540

Leu His Gly Asp Gln Asn Tyr Lys Ile Val Gln Gln Asn Lys Val Arg

545 550 555 560

Arg Leu Ser Leu Asn Tyr His Ala Arg Glu Asp Ile Met Ile Pro Ser

565 570 575

Ser Met Ile Val Ser His Val Arg Ser Leu Thr Ile Phe Gly Tyr Ala

580 585 590

Glu His Met Pro Ala Leu Ser Lys Leu Gln Phe Met Arg Val Leu Asp

595 600 605

Val Glu Asn Lys Met Val Leu Asp His Ser Phe Leu Lys His Ile His

610 615 620

Arg Leu Ser Gln Leu Lys Tyr Leu Arg Leu Asn Val Arg Arg Ile Thr

625 630 635 640

Ala Leu Pro Glu Gln Leu Gly Glu Leu Gln Asn Leu Gln Thr Leu Asp

645 650 655

Leu Arg Trp Thr Gln Ile Lys Lys Leu Pro Ser Ser Ile Val Arg Leu

660 665 670

Gln Lys Leu Val Cys Leu Arg Val Asn Ser Leu Glu Leu Pro Glu Gly

675 680 685

Ile Gly Asn Leu Gln Ala Leu Gln Glu Leu Ser Glu Ile Glu Ile Asn

690 695 700

His Asn Thr Ser Val Tyr Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Leu Lys Lys

705 710 715 720

Leu Arg Ile Leu Gly Leu Asn Trp Ser Ile Ser Asp Ser Asn Cys Asp

725 730 735

Ile Lys Ile Tyr Ala Asp Asn Leu Val Thr Ser Leu Cys Lys Leu Gly

740 745 750

Met Phe Asn Leu Arg Ser Ile Gln Ile Gln Gly Tyr His Ile Ile Ser

755 760 765

Leu Asp Phe Leu Leu Asp Ser Trp Phe Pro Pro Pro His Leu Leu Gln

770 775 780

Lys Phe Glu Met Ser Ile Ser Tyr Phe Phe Pro Arg Ile Pro Lys Trp

785 790 795 800

Ile Glu Ser Leu Glu Tyr Leu Ser Tyr Leu Asp Ile Tyr Ile Asn Pro

805 810 815

Val Asp Glu Glu Thr Phe Gln Ile Leu Ala Gly Leu Pro Ser Leu Ile

820 825 830

Phe Leu Trp Ile Ser Ser Arg Ala Ala Thr Pro Lys Lys Gly Leu Ile

835 840 845

Ile Ser Cys Asn Gly Phe Gln Cys Leu Arg Glu Leu Tyr Phe Thr Cys

850 855 860

Trp Glu Ser Lys Thr Gly Met Met Phe Glu Ala Gly Ala Met Pro Lys

865 870 875 880

Leu Glu Asn Leu Arg Val Pro Tyr Asn Ala Cys Asp Ile Cys Ser Leu

885 890 895

Asn Gly Gly Met Asp Phe Gly Ile Gln His Leu Cys Ser Leu Lys His

900 905 910

Leu His Val Glu Ile Ile Cys Arg Gly Ala Lys Leu Gln Glu Val Glu

915 920 925

Ala Leu Glu Asn Ala Ile Lys Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ser Asp Glu

930 935 940

Leu Thr Phe Glu Val Ser Arg Trp Asp Glu Glu Glu Ile Ile Asp Met

945 950 955 960

Asp Gln Glu Leu Ala Glu Asp Asp Phe Asp Thr Ile Asn

965 970

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 水稻日本晴(Oryza sativa)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tccctaaaaa agggttaatt atcagcta 48

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 水稻日本晴(Oryza sativa)

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tcctaaaaaa gggttaatta tcagctg 47

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 水稻日本晴(Oryza sativa)

<400> 5

gctttcccaa caggtgaagt agag 24

Claims

1.一个新的水稻稻瘟病抗性基因Pi-jx，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述基因Pi-jx编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育种中的应用。

4.稻瘟病抗性基因Pi-jx的功能特异性KASP分子标记，其特征在于：该分子标记引物如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:5所示，所述的KASP分子标记中包含一个位于Pi-jx基因CDS序列的第2552碱基处的与稻瘟病抗性相关的SNP，抗病品种中该位点为“C”，而感病品种中为“T”。

5.用于扩增权利要求4所述分子标记的特异性引物，其特征在于，如SEQ ID NO:3～SEQID NO:5所示。

6.权利要求4所述的分子标记在水稻稻瘟病种质材料抗性鉴定或筛选，或抗性基因检测中的应用。

7.一种水稻稻瘟病抗性标记辅助育种方法，其特征在于，包括检测权利要求4所述的分子标记的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求5所述的引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；