CN112553195A - 一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用 - Google Patents

一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于CRISPR‑Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用。所述试剂包含特定的单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板，通过特定的单链引导RNA序列靶向目标序列，以寡聚脱氧核苷酸模板作为基因修复模板，从而引入单个位点的突变，对DNMT1基因进行单碱基编辑，以制备生成携带该DNMT1定点突变的细胞株；可进一步利用该突变的细胞株来研究该DNMT1突变对γ‑珠蛋白基因(HBG)表达水平的影响极其作用机制，具有较大的应用前景。

Description

一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其 应用
技术领域
本发明涉及细胞模型及基因编辑技术领域，更具体地，涉及一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用。
背景技术
DNA甲基转移酶1(DNMT1)在人体许多组织结构中广泛且高表达，正常生理状态下用于维持特定DNA位点的甲基化水平，介导下游基因的表达沉默。DNMT1蛋白包括位于氮端的调控区域(N-terminal regμLatory domain)和位于碳端的催化区域(C-terminalcatalytic domain)，这两个区域之间形成一定的空间结构，相互作用，协同完成DNMT1的催化功能。氮端调控区域由多个不同的结构域组成，包括：PCNA结合结构域(proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)binding domain，PBD)、TS结构域(targeting sequencedomain，TS)、锌指蛋白结构域(zinc finger domain，CXXC)、两个BAH结构域(bromo-adjacent homology domains，BAH1/2)，每种结构域在DNMT1的功能调节中都发挥着不同的作用。针对49个已报道的与珠蛋白基因表达相关的表观调控因子，对中国南方地贫高发地区的1142例β地贫患者进行目标区域捕获测序，发现了位于DNMT1蛋白BAH1结构域的错义突变(NM_001317830.1:c.2633C＞T,p.Ser878Phe)能显著升高胎儿血红蛋(Hb F)水平，减轻β地贫表型。然而，DNMT1蛋白BAH1结构域的错义突变通过何种机制影响病人的表型并不清楚。因此，通过在HUDEP-2细胞株中构建DNMT1(c.2633G>A,p.Ser878Phe)突变模型对于探讨其对β-地中海贫血患者的γ-珠蛋白基因重新激活表达的分子机制至关重要。CRISPR/Cas9技术是近几年兴起的基因编辑技术，通过设计合适的sgRNA，可对目标序列进行定点编辑，具有快速、高效的特点。中国专利CN109971755A公开了一种CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其CRISPR/Cas9载体，可快速高效、特异性敲除人DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长，然而其并不能实现DNMT1的定点突变，因此无法适用于构建DNMT1(c.2633G>A,p.Ser878Phe)突变模型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的试剂。
本发明的第二个目的在于提供所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的细胞模型的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的试剂，包含单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板；
所述单链引导RNA序列为：
mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU；
所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为：
C*G*ACGGGAAGACCTACTTCTACCAGCTGTGGTATGATCAAGACTACGCGAGATTCGAGTTCCCTCCAAAAACCCAGCCAACAGAGGACAACAAGTTCAAGTGAGCACTGGGGCTGGAC*T*C。
上述序列中，m：核苷酸糖/脱氧核苷酸中核糖/脱氧核糖的2’-O-甲基修饰；*：核苷酸/脱氧核苷酸间的硫代磷酸酯连接修饰。
本发明通过提供特定的单链引导RNA(sgRNA)序列靶向目标序列，并提供单链DNA序列(寡聚脱氧核苷酸模板)作为基因修复模板，从而引入单个位点的突变，对DNMT1基因进行单碱基编辑，模拟生成携带该DNMT1突变(c.2633G>A,p.Ser878Phe)的细胞株，进一步利用该突变的细胞珠来研究该DNMT1突变对γ-珠蛋白基因(HBG)表达水平的影响极其作用机制。
优选地，还包含重组Csa9蛋白。
本发明还提供上述任一所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。
本发明还提供一种定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的细胞模型的制备方法，为利用CRISPR/Cas9技术和上述任一所述的试剂对细胞进行定点单碱基编辑。
优选地，所述方法包括以下步骤：
S1.对细胞进行培养和增殖、传代培养；
S2.对培养中的细胞进行换液，换液后取5～6×105(优选5×105)个细胞离心弃上清，清洗，再离心弃上清；
S3.向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散，随后向细胞悬液中加2～4％甘油、重组Csa9蛋白、单链引导RNA、单链寡核苷酸序列，进行电转；
S4.电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养，再进行低速离心，随后将细胞重悬，进行单克隆分选，分选的单克隆细胞分别培养，挑选长起来的单克隆细胞继续生长培养，再验证细胞目的位点突变编辑情况，选取纯合突变的单克隆细胞株。
优选地，步骤S2所述离心为700～900rpm，4～6min。
进一步优选地，步骤S3所述重组Csa9蛋白添加量为15～17μg(优选16μg)。
进一步优选地，步骤S3所述单链引导RNA添加量为200～300pM(优选200pM)。
进一步优选地，步骤S3所述单链寡核苷酸序列添加量为20～30pM(优选20pM)。
进一步优选地，所述细胞为永生化红系祖细胞(HUDEP-2)。
本发明还提供上述任一所述方法制备得到的DNMT1基因定点突变细胞模型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因，所述试剂包含特定的单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板，通过特定的单链引导RNA序列靶向目标序列，以寡聚脱氧核苷酸模板作为基因修复模板，从而引入单个位点的突变，对DNMT1基因进行单碱基编辑，可制备携带该DNMT1定点突变的细胞株；可进一步利用该突变的细胞株来研究该DNMT1突变对γ-珠蛋白基因(HBG)表达水平的影响极其作用机制，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为野生型序列(左)及突变后序列验证图(右)。
图2为分别用QPCR(A)、Western Blotting(B)和HPLC验证DNMT1(c.2633G>A,p.Ser878Phe)提高HBG表达。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
HuDEP-2细胞、重组Cas9蛋白(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.A36498)、细胞电转系仪(Neon Transfection System)、细胞电转液(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.MPK1025)、细胞培养瓶、12孔板、48孔板、96孔板、SFEM培养基(Serum-FreeExpansion Medium)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、多西环素(DOX)、地塞米松(DEX)。
实施例1 DNMT1定点突变(c.2633G>A,p.Ser878Phe)细胞模型的构建
为了研究DNMT1突变对HBG表达的影响，采用永生化红系祖细胞(HUDEP-2)进行实验。发明人通过设计特定的单链引导RNA(sgRNA)序列靶向目标序列，并设计单链DNA序列(寡聚脱氧核苷酸模板，ssODN)作为基因修复模板，对DNMT1基因进行单碱基编辑，模拟生成携带该DNMT1突变(c.2633G>A,p.Ser878Phe)的细胞株，进一步利用突变的HUDEP-2细胞珠来研究该DNMT1突变对γ-珠蛋白基因(HBG)表达水平的影响极其作用机制。所述特定的sgRNA序列和单链寡核苷酸序列(ssOND)如表1所示：
表1 sgRNA和单链寡核苷酸序列(ssOND)
Figure BDA0002763742070000041
具体包括如下步骤：
一、永生化红系祖细胞，悬浮生长，用StemSpan SFEM基础培养基加上50ng/ml SCF(stem cell factor,干细胞生长因子)，3U/ml EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)，1μg/ml DOX(Doxycycline，多西环素)和10-6M DEX(Dexamethasone,地塞米松)培养。置于37℃恒温培养箱中进行培养，2-3天后进行换液和传代培养。
二、对培养中的HuDEP-2细胞进行换液，换液后30小时取5X105个HuDEP-2离心(800rpm X 5min)弃上清、随后用DPBS清洗，离心弃上清(800rpm，5min)。
三、向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散，随后向细胞悬液中加2％甘油、重组Csa9蛋白16(μg)、表1所示sgRNA(200pM)和单链寡核苷酸序列(ssOND)(20pM)，设置好电转条件(1200v 27ms 1pμLse)进行电转。
四、电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养，电转后60小时对细胞进行低速离心(600rpm，8min)，随后将细胞用PBS重悬后在流式细胞分选仪器(Beckman CoμLter,USA)中进行单克隆分选，分选的单克隆细胞置入96孔板中培养。
五、待分选第7天，挑选长起来的单克隆细胞，转移至48孔板中继续生长，待第12天左右对细胞进行粗提DNA、进行PCR测序，验证目的位点突变编辑情况。包括如下步骤：
1、细胞DNA提取：
(1)消化细胞：按表2配方先配制消化液：
表2消化液
蛋白酶K(20mg/ml) 10μL
10×PCR缓冲液 100μL
ddH<sub>2</sub>O 890μL
(2)取50μL细胞培养液离心去上清，加入15μL消化液，55℃消化45min后95℃10min灭活蛋白酶K。
2、PCR及测序
表3 DNMT1 PCR及测序引物
Figure BDA0002763742070000051
Figure BDA0002763742070000061
六、将编辑成功的细胞转移至12孔板、细胞瓶等进行后续扩大培养10天，提取RNA和蛋白分别进行qPCR和Western Blotting以验证DNMT1(c.2633G>A,p.Ser878Phe)提高HBG表达，或用细胞直接进行HPLC，检测HBG表达。具体包括如下步骤：
1、RNA提取：
(1)收集一处于对数生长期的HUDEP-2(约5×105个细胞)置于1.5mlEP管中，离心(室温，200g×3min)收集沉淀，随后用1X PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心弃上清后向细胞沉淀中加入1ml Trizol溶液，轻柔地重悬吹打细胞均匀，直至无细胞团块(后续提取RNA的操作均需要使用去RNA酶的耗材)。
(2)将细胞悬液在室温中放置30分钟(此时可放-80℃冰箱长期保存)，离心(4℃，12000rpm×5min)后将上清液转移至新的EP管中。
(3)向装有上清的EP管中按照一定比例(200μL/ml Trizol)加入氯仿，盖紧管盖，上下颠倒混匀溶液后静置(室温，15分钟)，随后离心(4℃，12000rpm×5min)。
(4)上一步离心后的液体由上至下分为三层：水相层，蛋白层，酚层，吸取最上层水相，转移至新的EP中(吸取过程注意轻柔操作，尽量不要吸到蛋白层)。
(5)向新的EP管中按照一定比例加入异丙醇(500μL/ml Trizol)后静置(室温，15分钟)，离心(4℃，12000rpm×10min)，离心后可见管壁附着的白色沉淀物即为RNA，弃上清，保留沉淀(此过程注意轻柔操作，勿将沉淀倒出)。
(6)用DEPC处理水和无水乙醇配制成浓度为75％的酒精溶液，对RNA沉淀进行洗涤2-3次，每次加入酒精时可将RNA沉淀轻柔吹起，随后上下颠倒EP管数次，以便充分洗涤RNA，最后一次清洗完后离心(4℃，8000rpm×5min)弃上清后将EP管放入通风处内干燥10-20分钟(注意此干燥过程留意随时观察，以免RNA过于干燥不易溶解)。
(7)观察RNA沉淀的量，根据经验加入适量的DEPC水进行溶解，随后进行RNA浓度的测定(测量过程中应注意OD260/280的比值应在1.8-2.0之间，若比值不在此范围，则应考虑提取的RNA中含有其他杂质污染)。
(8)溶剂的RAN易降解，产物应放置-80℃保存，待用。
2、RNA逆转录：
使用Promega GoScript(A5001)反转录试剂盒，以下加样操作均在冰上完成。
(1)取一定量的模板RNA加入引物，按表4配制反应体系；
表4反应体系
Figure BDA0002763742070000071
(2)将模板RNA与引物的混合物进行70℃，5min预变性，完成后取出置于冰上。
(3)按表5配制RT-Mix，向每个样品中加入10μL。
表5反应体系
Figure BDA0002763742070000072
(4)设置逆转录程序
表6逆转录程序
Figure BDA0002763742070000073
3、qPCR：
(1)设计qPCR引物，如表7所示
表7 qPCR引物
Figure BDA0002763742070000081
(2)用购自康瑞公司试剂盒(2×RealStar Green Fast Mixture)对转染细胞进行的实时荧光定量PCR实验，分析DNMT1、HBG基因的表达情况，反应体系及条件如表8-9所示：
表8荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002763742070000082
表9荧光定量PCR反应条件
Figure BDA0002763742070000083
Figure BDA0002763742070000091
4、Western Blotting
(1)蛋白样品制备
a.取NP-40细胞裂解液(碧云天公司)100μL，加入1μL蛋白酶抑制剂PMSF，制备裂解缓冲液。
b.分别收集每孔细胞，用预冷的1别收集每缓冲液漂洗细胞2次，离心收集细胞沉淀(4℃，800rpm×10min)。
c.向细胞沉淀中加入配置好的细胞裂解液轻柔地将细胞吹散，将装有细胞的EP管插入冰中，静置30分钟，离心(4℃，12000rpm×20min)，此时的上清液即为蛋白样本，收集至新的500μL EP管中(放置冰上)。
d.取部分蛋白进行BCA法蛋白定量实验，向剩余蛋白样本中加入25μL 5×验蛋白上样缓冲液，轻柔吹打混匀，100℃金属浴中加热8分钟，插入冰中冷却待上样，或放置-20℃保存。
(2)蛋白上样电泳
a.首先根据目的蛋白分子量大小配制合适浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶，见表10：
表10 SDS聚丙烯酰胺凝胶组分
Figure BDA0002763742070000092
制胶过程注意事项：玻璃板需用洗洁精洗净，最后用去离子水冲洗，将与胶解除的以免行下倾斜置于吸水纸上晾干；确保制胶玻璃板下缘水平对齐，夹紧置于制胶架上，确保玻璃板底部与制胶架海绵之间无缝隙，不会漏胶。
b.向架好的玻璃板中灌入2/3体积的分离胶后立即用无水乙醇封胶(确保胶的水平面平齐)，静置30-60分钟，倒掉封胶液，灌入浓缩胶，插入齿梳(此过程轻柔避免产生气泡)，静置30-60分钟，拔掉齿梳。
c.根据测得的蛋白浓度估算上样量(20-30ug蛋白)。
d.将胶板的盖玻片一面向内插入到电极框中(注意玻璃板和电极框的密封胶条之间贴紧放置，以防产生缝隙，在电泳的过程中漏电泳液)。
e.按照电泳槽中的电极指示将电极框正确放入，随后向电极框和胶板之间形成的凹槽内倒入电泳液(液面与玻璃板最上缘齐平)。
f.恒压电泳，浓缩胶80V，30分钟左右；分离胶120V，具体时间根据目的蛋白分子量而定。
(3)转膜：采用湿转方式
a.首先裁剪合适长度的PVDF膜(裁剪过程注意防水、保持干燥)，将膜提前放入甲醇溶液中浸泡2分钟进行活化，再用去离子水浸泡5分钟，最后放在转膜液中。
b.电泳结束后将胶板卸下，根据蛋白Marker的指示保留目的蛋白对应的胶，左上切角做标记，在转膜夹中按照：滤纸、胶、PVDF膜、滤纸的顺序装好(注意每一层之间不应留有气泡)，夹好。
c.向电转槽内先加入适量电转液，将电转夹放有PVDF膜的一面朝正极放置入电转槽的架子中，在槽中加入一块冰板，随后加入电转液直至没过电转夹，盖上槽盖，恒流200mA电转2-2.5小时。(电转过程中将电转槽埋在冰中降温)。
(4)封闭及杂交
a.电转结束取出膜，用1转结束取出膜缓冲液稍加冲洗，至于合适大小的盒中，加入封闭液(5％脱脂奶粉)，室温下振荡孵育(70rpm×1h)。
b.封闭后的膜放入小盒中用TBST冲洗3次，加入适量稀释的目的蛋白抗体(DNMT1、胎儿血红蛋白抗体按照1:2500比例稀释，GAPDH抗体按照1:5000比例稀释)，至于孵育过夜(4℃，缓慢水平摇动)。
c.回收一抗，用TBST浸没PVDF膜，振荡清洗(室温，80rpm×10分钟)3次。
d.根据一抗来源选择合适的二抗，按照1:7500比例用TBST稀释，对清洗后的膜进行孵育(室温，70rpm×1h)。
e.孵育结束后倒掉二抗，用TBST浸没PVDF膜，振荡清洗(室温，80rpm×10-15分钟)3次。
(5)曝光
a.提前将曝光仪打开冷却至-30℃。
b.按照1:1的比例将A、B发光液混合(现用现配，注意避光保存)
c.将膜用镊子夹出，滤纸贴角吸干TBST，将膜贴在曝光板上，向膜上均匀滴加发光液，选择合适的曝光模式进行拍摄。
5、高效液相色谱(HPLC)检测HBG表达水平(HBF)
收集1×107个细胞，PBS清洗后尽量去上清，加50～100μl超纯水裂解细胞，然后在干冰和37℃水浴之间进行3次反复冻融循环。使用高效液相色谱Bio-Rad VARIANTβ-thalassemia Short Program分析胎儿血红蛋白(HbF)
结果：挑选出2株目的位点发生纯合突变的HuDEP-2单克隆细胞株：1#、2#。序列验证结果如图1所示，实现了定点突变；HBG表达水平如图2所示，两个突变细胞株的HBG表达均有不同程度的升高。
上述结果表明本发明通过CRISPR-Cas9结合同源重组技术编辑成功获得了携带DNMT1(S878F)突变的HuDEP-2细胞株，显示细胞中的HBG表达显著升高。

Claims (10)

1.一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的试剂，其特征在于，包含单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板；
所述单链引导RNA序列为：
mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU；
所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为：
C*G*ACGGGAAGACCTACTTCTACCAGCTGTGGTATGATCAAGACTACGCGAGATTCGAGTTCCCTCCAAAAACCCAGCCAACAGAGGACAACAAGTTCAAGTGAGCACTGGGGCTGGAC*T*C。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，还包含重组Csa9蛋白。
3.权利要求1或2所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。
4.一种定点突变编辑DNMT1基因(c.2633G>A)的细胞模型的制备方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术和权利要求1或2所述试剂对细胞进行定点单碱基编辑。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1.对细胞进行培养和增殖、传代培养；
S2.对培养中的细胞进行换液，换液后取5～6×105个细胞离心弃上清，清洗，再离心弃上清；
S3.向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散，随后向细胞悬液中加2～4％甘油、重组Csa9蛋白、单链引导RNA、单链寡核苷酸序列，进行电转；
S4.电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养，再进行低速离心，随后将细胞重悬，进行单克隆分选，分选的单克隆细胞分别培养，挑选长起来的单克隆细胞继续生长培养，再验证细胞目的位点突变编辑情况，选取纯合突变的单克隆细胞株。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述重组Csa9蛋白添加量为15～17μg。
7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述单链引导RNA添加量为200～300pM。
8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述单链寡核苷酸序列添加量为20～30pM。
9.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述细胞为永生化红系祖细胞。
10.权利要求4～9任一所述方法制备得到的DNMT1定点突变细胞模型。
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