CN112552914B - 一种稀土氟化物杂化纳米花及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种稀土氟化物杂化纳米花及其制备方法。本发明以蛋白质为矿化模板，稀土氟化物为无机组分，与现有技术相比，在低温条件下即可实现蛋白质‑稀土氟化物杂化纳米花的合成，该方法反应条件温和、绿色环保、能耗低；制备的杂化纳米花具有较高的比表面积，在最大程度保证蛋白质的稳定性和活性基础上，附加了镧系金属独特的发光特性；该方法对蛋白质的固定化效果良好，并且不会影响原有镧系金属的发光性能；制备的纳米花掺杂不同种类的镧系元素离子，在生物传感、生物催化和医学诊断和治疗方面应用潜力巨大。

Description

一种稀土氟化物杂化纳米花及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种稀土氟化物杂化纳米花及其制备方法。
背景技术
镧系元素(lanthanideelement)是元素周期系ⅢB族中原子序数为57-71的15种化学元素的统称，由于镧系元素都是金属，所以又称镧系金属。镧系元素用符号Ln表示，包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们也属于稀土元素的成员。由于稀土金属元素具有良好的发光性能，可广泛应用于生物和化学检测的发光传感。
纳米花(Nanoflower)属于纳米材料的一种，具有较高的表面积/体积比，其更有利于提高表面反应效率。近年来，随着纳米科学的发展，已开发出多种形态的纳米花材料。与球形纳米颗粒相比，这些新的纳米花结构具有较高的孔隙率、较大的表面积、通透的立体结构等优点，有利于反应介质的吸附和传输扩散。虽然目前已经开发出了多种形态的纳米花，但是这些纳米花的合成过程复杂，需要比较苛刻的条件，例如大量有毒有机溶剂的使用，以及高温和高压的反应条件等，并且即使在上述苛刻条件下，仍然难以控制纳米花的形态特征和纳米花的结构。
目前已有稀土元素杂化纳米花的报道，而其制备方法主要包括化学气相沉积(CVD)，溶胶-凝胶法，微乳液法，非水解路线和水热法等，这些方法均需在高温下进行，反应条件苛刻、能耗高、环境要求高，不利于维持蛋白质的活性。
发明人发现，当以蛋白质为生物矿化模板，镧系氟化物为无机组分时，在室温条件下即可合成有机-无机杂化纳米花，该方法条件温和，绿色环保；制备的杂化纳米花具有较高的比表面积，可以更好的保持蛋白的稳定性和活性；且对于蛋白的固定化效果良好，不会影响原有镧系金属的发光性能；制备的纳米花掺杂不同种类的镧系元素离子，在生物传感、生物催化和医学诊断和治疗方面有巨大潜在应用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种稀土氟化物杂化纳米花，所述杂化纳米花的通式为：蛋白质-Na5Yb9F32：Ln3+，其中所述的Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种。
本发明的目的在于提供一种稀土氟化物杂化纳米花的制备方法，所述方法步骤为：在Ln3+、蛋白质、硝酸镱的混合溶液中，加入氟化钠溶液，反应即得稀土氟化物杂化纳米花，其中所述Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种。
优选地，所述Ln3+与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.4-1.5：20-25：65-90。
优选地，所述Ln3+与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.475：23：69。
优选地，所述反应温度为0-37℃。
优选地，所述Ln为铕或铽。
优选地，所述的蛋白质为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、胶原蛋白中的一种或几种。
优选地，所述的蛋白质为胰蛋白酶。
本发明的另一目的在于提供一种蛋白质的固定化方法，其特征在于，所述方法为：在Ln3+、蛋白质、硝酸镱的混合溶液中加入氟化钠溶液，其中所述Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种。
优选地，所述Ln3+与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.4-1.5：20-25：65-90。
优选地，所述Ln3+与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.475：23：69。
优选地，所述反应温度为0-37℃。
优选地，所述Ln为铕或铽。
优选地，所述的蛋白质为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、胶原蛋白中的一种或几种。
优选地，所述的蛋白质为胰蛋白酶。
本发明的另一目的在于提供一种无机物Na5Yb9F32在制备稀土氟化物杂化纳米花中的应用。
优选地，所述无机物Na5Yb9F32由硝酸镱和氟化钠反应获得。
本发明的有益效果是：①本发明提供的稀土氟化物杂化纳米花的制备方法简单，条件温和、绿色环保、能耗低；②对于蛋白的固定化效果良好，且不会影响蛋白的活性；③制备的杂化纳米花具有较高的比表面积，在最大程度保证蛋白质的稳定性和活性基础上，附加了镧系金属独特的发光特性；④该方法对蛋白质的固定化效果良好，并且不会影响原有镧系金属的发光性能；⑤制备的纳米花同时掺杂不同种类的镧系元素离子，在生物传感、生物催化和医学诊断和治疗方面应用潜力巨大。
附图说明
图1实施例1制备的杂化纳米花粉末的结构谱图，其中图1a为X射线单晶衍射图，图1b为X射线光电子能谱图，图1c为红外分析图，图1d为热重分析图；
图2实施例1制备的杂化纳米花的扫描电镜，透射电镜，电子衍射以及能量散射X射线分析图，其中图2a和图2b为FESEM图，图2c为TEM图，图2d为HRTEM图，图2e为EDX图，图2f为HAADF-STEM图，图2g为Na5Yb9F32粒子正方形区域的C，Na，F和Yb的EDS映射图；
图3实施例2制备的杂化纳米花的扫描电镜图，其中图3a为不含蛋白的杂化纳米花，图3b为含胰蛋白酶的杂化纳米花，图3c为含溶菌酶的杂化纳米花，图3d为含重组胶原蛋白的杂化纳米花，图3e为含菠萝蛋白酶的杂化纳米花，图3f为含牛血清白蛋白的杂化纳米花；
图4固定化蛋白质的优良特性图，其中图4a为不同浓度尿素处理后的杂化纳米花和游离胰蛋白酶的酶活性图，图4b为不同浓度乙腈处理后的杂化纳米花和游离胰蛋白酶的酶活性图，图4c为不同温度下的杂化纳米花和游离胰蛋白酶的酶活性图，图4d为不同时间处理后的杂化纳米花和游离胰蛋白酶的酶活性图；
图5杂化纳米花重复使用效果图；
图6杂化纳米花的荧光光谱图，其中图6a为胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花荧光光谱图，图6b为胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Eu3+杂化纳米花的荧光光谱图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
以下实施例中所述的生物矿化材料为蛋白-Na5Yb9F32，由蛋白溶液、五水合硝酸镱溶液、氟化钠溶液混合反应获得；所述的蛋白包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、胶原蛋白等；
以下实施例中的反应均在25℃恒温下进行，但是需要说明的是，本发明在不影响蛋白质稳定性和活性的基础上，以蛋白质为矿化模板，制备了稀土氟化物杂化纳米花，因此，在能够维持蛋白质稳定性和活性的温度(0-37℃)下，该反应均可进行。
以下实施例中所述的镧系金属包括铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥等；
以下实施例中所述的EDX为能量散射X射线分析，XPS为X射线光电子能谱，SEM为扫描电镜，TEM为透射电镜，FT-IR为红外色谱，TGA为热重分析，FESEM为场发射扫描电子显微镜，HRTEM为高分辨率的透射电镜，HAADF-STEM为高角环形暗场像-扫描透射电子显微镜图。
实施例1胰蛋白酶-Na5Yb9F32的制备
在0.685mL水中分别加入1.0mg胰蛋白酶，再加入0.1mL(0.5M)硝酸镱溶液，搅拌1h后，得到无色透明且均匀的液体；再向该溶液中缓慢滴加0.3mL(0.5M)氟化钠溶液，得到白色的絮状物，搅拌10min，于在25℃的恒温箱中放置2天，得到白色沉淀；将沉淀10000rpm离心，弃去上清液，留下固体；用无水乙醇分散固体，纯化离心3次，在25℃恒温干燥箱中干燥，即得杂化纳米花胰蛋白酶-Na5Yb9F32。
将制备的杂化纳米花胰蛋白酶-Na5Yb9F32进行EDX、XPS、SEM、TEM、FT-IR、TGA、电子衍射以及能量散射X射线的分析。
结果如图1和图2所示，其中图1a为XRD图，该图谱中衍射峰与胰蛋白酶-Na5Yb9F32的衍射数据对应；图1b为XPS图，该图谱中衍射峰与胰蛋白酶-Na5Yb9F32的衍射数据对应；图1c为FT-IR图，表明在混合纳米材料中存在胰蛋白酶；图1d为TGA图，表明Na5Yb9F32纳米材料中包封了大约2.55％的胰蛋白酶；图2为杂化纳米材料胰蛋白酶-Na5Yb9F32形态的电子显微镜表征，其中图2a和图2b为FESEM图，图2c为TEM图，图2d为HRTEM图，图2e为EDX图，图2f为HAADF-STEM图，图2g为Na5Yb9F32粒子正方形区域的C，Na，F和Yb的EDS映射图，从图2可知，Na5Yb9F32纳米粒子形貌均一，呈花型，胰蛋白酶和Na5Yb9F32在花型内均匀分布。
实施例2发光蛋白-Na5Yb9F32：Tb3+的制备
在0.675mL水中分别加入1.0mg胰蛋白酶、4.0mg溶菌酶、1.0mg重组胶原蛋白Ftsz、1.0mg菠萝蛋白酶、4.0mg牛血清白蛋白和不加任何蛋白，再加0.1mL(0.5M)硝酸镱溶液，10μL(0.2M)硝酸铽溶液混合均匀，搅拌1h后，得到无色透明且均匀的液体；再向该溶液中缓慢滴加0.3mL(0.5M)氟化钠溶液，得到白色的絮状物，搅拌10min，于25℃的恒温箱中放置2天，得到白色沉淀；将产物于10000rpm离心，弃去上清液，留下固体；并用无水乙醇分散固体，再纯化离心3次，在25℃恒温干燥箱中干燥即得不同蛋白种类的发光蛋白-Na5Yb9F32杂化纳米花。
将制备的发光蛋白-Na5Yb9F32：Tb3+进行SEM分析。
结果如图3所示，其中图3a为不含蛋白的纳米花Na5Yb9F32：Tb3+，图3b为含胰蛋白酶的纳米花胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+，图3c为含溶菌酶的纳米花溶菌酶-Na5Yb9F32：Tb3+，图3d为含重组胶原蛋白的纳米花重组胶原蛋白-Na5Yb9F32：Tb3+，图3e为含菠萝蛋白酶的纳米花菠萝蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+，图3f为含牛血清白蛋白的纳米花血清白蛋白-Na5Yb9F32：Tb3+；结果表明，不同蛋白作为模板调控Na5Yb9F32均能形成良好的纳米花结构，该方法普遍适用于多种蛋白质及酶的固化。
实施例3胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+的活性测定
用酪蛋白作为底物，在50mM的PBS缓冲液(pH 7.4)中制备酪蛋白溶液(10g/L)。将胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+添加到1mL的10g/L酪蛋白中，并在30℃下孵育30min，9000rpm离心5min后收集上清液；将三氯乙酸(TCA)溶液(2mL，0.4M)添加到上清液中，并静置5min以终止酶促反应，离心收集上清液；将5mL碳酸钠溶液(0.4M)和1mL福林酚试剂与1mL上清液混合，将混合物在40℃下温育20min以完成显色反应；监测763nm处的光密度以评估酪蛋白的水解性能。通过相同的程序，使用杂合纳米花中相应量的胰蛋白酶，评估游离胰蛋白酶的活性。
不同量尿素或乙腈的条件下胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+和游离胰蛋白酶的酶学特征分析：使用Folin测定法在55℃，同时监测10h内不同时间间隔下的酶活性；并在40-55℃温度下检测胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+和游离胰蛋白酶的酶活性。
胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+的可重复利用性检测：将重组胶原V-CL(5mg/mL，50mM甘氨酸缓冲液，pH8.6)与2mg胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+在25℃下孵育约12h，离心收集上清液并储存在-20℃。沉淀物用甘氨酸缓冲液(50mM，pH8.6)洗涤3次，然后再次用于另一个循环；遵循相同规程，将VCL裂解实验重复8个循环；分析所有收集的上清液进行SDS-PAGE检测。
结果如图4和图5所示，图4为利用福林酚法测定的加入不同浓度的尿素、乙腈和不同温度以及不同时间对制备的胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花的固定酶活性的影响(其中黑色线代表游离的胰蛋白酶，灰色线代表胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花)，结果表明，无机物Na5Yb9F32对杂化纳米花的固定酶活性和维持酶稳定性具有重要意义；图5为制备的胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花可重复使用性的SDS-PAGE表征，胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花作为固定蛋白反应器，具有良好的可重复使用性。
实施例4发光胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Ln3+的荧光测定
在0.675mL水中加入1mg胰蛋白酶粉末，0.1mL(0.5M)硝酸镱溶液，10μL(0.2M)硝酸铽或者硝酸铕溶液混合均匀，搅拌1h后，得到无色透明且均匀的液体；再向该溶液中缓慢滴加0.3mL(0.5M)氟化钠溶液，得到白色的絮状物；将所得絮状混合物放在25℃的恒温箱中，放置2天，得到白色沉淀；将产物通过离心分离，离心条件为10000rpm，弃去上清液，留下固体；并用无水乙醇分散固体，再离心纯化3次，在25℃恒温干燥箱中干燥，即得发光胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+和胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Eu3+杂化纳米花。
用Hitachi FLS920荧光分光光度计对上述制备的发光胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+和胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Eu3+进行荧光表征分析。
结果如图6所示，图6a为胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Tb3+杂化纳米花荧光光谱图，该光谱显示，在369nm波长激发下发射绿光；图6b为胰蛋白酶-Na5Yb9F32：Eu3+的荧光光谱，该光谱显示，在394nm波长激发下发射红光；说明制备的杂化纳米花的发光特性良好，该方法不会影响原镧系金属离子的发光特性。
以上所述为本发明的一个示范性实施案例的细节。对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种稀土氟化物杂化纳米花，其特征在于，所述杂化纳米花的通式为：蛋白质-Na5Yb9F32：Ln3＋，其中所述的Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种；所述的蛋白质为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、重组胶原蛋白Ftsz中的一种或几种。
2.一种如权利要求1所述的稀土氟化物杂化纳米花的制备方法，所述方法步骤为：在Ln3 ＋、蛋白质、硝酸镱的混合溶液中，加入氟化钠溶液，反应即得稀土氟化物杂化纳米花，其中所述Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种；其中，所述Ln3＋与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.475：23：69。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应温度为0-37℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Ln为铕或铽。
5.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质为胰蛋白酶。
6.一种蛋白质的固定化方法，其特征在于，所述方法为：在Ln3＋、蛋白质、硝酸镱的混合溶液中加入氟化钠溶液，固化形成蛋白质-Na5Yb9F32：Ln3＋；其中，所述的Ln为铈、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥中的一种或几种；所述的蛋白质为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、重组胶原蛋白Ftsz中的一种或几种；所述Ln3＋与蛋白质、硝酸镱、氟化钠的浓度比为1：0.475：23：69。
7.一种无机物Na5Yb9F32在制备稀土氟化物杂化纳米花中的应用；所述稀土氟化物杂化纳米花的结构为：蛋白质-Na5Yb9F32；所述的蛋白质为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、重组胶原蛋白Ftsz中的一种或几种。
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