CN112552385B

CN112552385B - 一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112552385B
Application number: CN202011468891.5A
Authority: CN
Inventors: 陆续; 李萍; 杜金法
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112552385A

Abstract

本发明公开了一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的GbEAG蛋白是如下（a1）或（a2）的蛋白质：（a1）由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白；（a2）将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与银杏内酯生物合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；同时本发明还涉及编码该银杏GbEAG蛋白的基因序列。本发明通过VIGS沉默和酵母单杂交实验证明了GbEAG能够调控银杏内酯生物合成途径的关键基因表达。本发明是首次克隆到调控银杏内酯生物合成的AP2/ERF类转录因子并对其进行了功能验证，为筛选银杏内酯合成途径相关功能基因提供了重要研究手段，同时对调控银杏内酯的生物合成具有重要意义。

Description

一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

银杏Ginkgo biloba L.，为银杏科、银杏属落叶乔木，又名白果树、公孙树，是仅存于我国的珍稀树种之一，有“活化石”之称。

银杏内酯是银杏中特有的一类活性成分，属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，二萜内酯主要包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C等，倍半萜内酯主要是白果内酯；银杏内酯作为血小板激活因子拮抗剂，能高度选择性地拮抗血小板聚集，防止血栓形成，被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。萜类化合物生物合成途径主要分为MEP途径和MVA途径，目前对于银杏中银杏内酯生物合成的研究主要集中在合成途径关键酶上，且停留在比较靠前的共同通路上，对于调控银杏内酯生物合成相关的转录因子研究较少，所以探寻银杏中调控银杏内酯合成相关转录因子，对进一步研究银杏内酯生物合成的转录调控具有重要意义。

AP2/ERF类转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，已报道AP2/ERF类转录因子可调控多种药用植物生物活性成分的合成，在萜类化合物的生物合成中，长春碱、丹参酮、青蒿素和紫杉醇等重要活性成分都报道有AP2/ERF类转录因子的调控。本发明筛选并克隆得到一个AP2/ERF类转录因子GbEAG，通过VIGS瞬时沉默和酵母单杂交验证其对银杏内酯生物合成的调控作用，为使用代谢工程手段调控银杏中银杏内酯的生物合成打下了坚实的基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种银杏GbEAG蛋白及其编码基因，该基因编码一个乙烯响应的AP2/ERF类转录因子，其蛋白可以直接结合到银杏内酯合成途径基因GbIDI的启动子上，进而调控银杏内酯的生物合成。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明涉及一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)的蛋白质：

(a1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白。

(a2)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列同源性≧95％且与调控银杏内酯生物合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)如序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列；

(b2)与序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列同源性≧95％的核苷酸序列。

含前文所述编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明还保护前文所述蛋白作为转录因子的应用。

前文所述的蛋白，或，前文所述的编码基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在结合具有GCC-Box区的启动子中的应用也属于本发明的保护范围。

前文所述的蛋白，或，前文所述的编码基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在调控银杏内酯生物合成中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护前文所述的蛋白，或，前文所述的基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物育种中的应用，其中，所述植物为银杏。

本发明利用银杏基因组与基因表达模式共分析的筛选方法从银杏中克隆并得到了一个AP2/ERF转录因子，命名为GbEAG(Ginkgo biloba，ERF transcription factorassociated with ginkgolides biosynthesis)。通过荧光定量分析表明此基因在银杏须根中高表达，这与银杏内酯生物合成途径相关基因的表达模式一致(“CombiningMetabolic Profiling and Gene Expression Analysis to Reveal the BiosynthesisSite and Transport of Ginkgolides in Ginkgo biloba L.”)。GbEAG属于ERF-B3亚家族，ORF长度为1179bp，编码393个氨基酸，聚类分析显示其可能结合于GCC-Box顺式作用元件，从而调控萜类化合物的生物合成。通过VIGS沉默分析，结果表明GbEAG的敲低会导致银杏内酯合成途径关键基因表达下降，从而导致银杏内酯A含量降低。进一步的酵母单杂交分析表明GbEAG可以结合于GbIDI启动子的GCC-Box上，调控银杏内酯的生物合成。本发明是首次从银杏中克隆并鉴定了AP2/ERF类转录因子，并对其功能进行了验证，为深入解析银杏内酯的生物合成途径与表达调控提供了技术依据与思路。

附图说明

图1为在银杏根中特异性高表达且受MeJA诱导的AP2/ERF类转录因子的表达量热图。

横坐标分别为叶、茎、根、MeJA诱导3小时的根、MeJA诱导6小时的根各取三个生物样本。

图2为筛选得到的银杏AP2/ERF类转录因子与已报道的调控萜类生物合成途径的AP2/ERF类转录因子共同构建的进化树。

图3左侧为GbEAG扩增ORF电泳检测图；右侧为VIGS扩增GbEAG靶片段电泳图。

图4为GbEAG与同源ERF转录因子氨基酸序列比对图(下划线表示ERF保守结构域)。

图5为GbEAG在银杏幼苗不同组织部位的表达情况，MR为Mature Root，FR为Fibrous Root，OS为Old stem，YS为Young Stem，L为Leaf。

图6为GbEAG以及银杏内酯合成途径相关基因在VIGS沉默后的基因表达情况(*代表P<0.05，**代表P<0.01)。

图7为VIGS沉默GbEAG后须根中银杏内酯的含量；GA为银杏内酯A、GB为银杏内酯B、GC为银杏内酯C、BB为白果内酯。

图8为GbEAG激活GbIDI启动子的酵母单杂交实验结果图，其中上为阳性对照，中为GbEAG与含GCC-Box的启动子互作结果，下为阴性对照，700ng/mL为AbA最低抑制浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，均按常规方法进行。

实施例1、调控银杏萜类物质生物合成途径AP2/ERF类转录因子的筛选

登陆pfam数据库，找到AP2/ERF类转录因子的特征保守结构域PF00847，下载对应的HMM模型，使用软件HMMER3.0搜索银杏基因组，初步筛选到所有的AP2/ERF类转录因子共149个，然后根据和银杏内酯合成途径基因具有相同表达模式即在须根中高表达且受MeJA诱导的特性进行进一步筛选，共得到16个(如图1所示)，将这16个转录因子与其他物种已报道的调控萜类生物合成途径的AP2/ERF类转录因子共同构建进化树(如图2所示)，GbEAG、Gb07949与AaERF1、NtERF32、AtERF2、GhERF5聚为同一支，亲缘关系较近。AaERF1、NtERF32、AtERF2、GhERF5均为GCC Box或GCC-like Box响应类转录因子，且GbEAG、Gb07949属ERF-B3亚家族，已有多报道可以结合GCC Box发挥转录调控作用，因此GbEAG和Gb07949最有可能调控银杏内酯的生物合成，并且GbEAG和Gb07949氨基酸高度相似，可能属于串联重复基因，因此选择GbEAG继续验证功能，将其命名为GbEAG，长度为1182bp，编码393个氨基酸。

实施例2、银杏GbEAG基因的克隆

2.1、银杏总RNA提取和逆转录合成cDNA

取银杏须根组织清洗干净，置于液氮中研磨，将粉末迅速加入含裂解液的1.5mLEppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照通用植物总RNA快速提取试剂盒的说明书抽提总RNA，测定RNA浓度和纯度，-80℃保存备用。

按照以下体系将总RNA逆转录合成cDNA。反应条件为：37℃ 15min，85℃ 5S，合成后的cDNA保存于-20℃备用。

2.2PCR扩增

以上述cDNA为模板，采用引物GbEAG-F和GbEAG-R扩增得到ORF。扩增ORF的引物如下(下划线为酶切位点)：

GbEAG-F：5’-CCGGATCCATGTTTTTGGGCAACGGAGAAAAAG-3’；

GbEAG-R：5’-CCACTAGTGCTAACCACAAGTTGCCCGG-3’。

PCR反应体系如下所示：

扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 40s，68℃ 1min 30s，35个循环；68℃延伸5min，4℃保存。

将PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，用Axygen凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收，将回收产物用BamHI和SpeI进行双酶切，同时将PHB-X-3*Flag载体也进行BamHI和SpeI酶切，将带有粘性末端的目的基因和质粒连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，将阳性克隆的重组菌送交测序。

测序结果表明：PCR扩增得到1179bp的ORF，其扩增电泳检测结果如图3左侧所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将其基因命名为GbEAG基因，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，将其蛋白命名为GbEAG蛋白。

利用Vector NTI软件将GbEAG与已知物种包括青蒿(Artemisia annua L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、陆地棉(Gossypium hirsutumLinn.)的同源氨基酸进行序列比对，均含有ERF转录因子保守结构域。

实施例3、银杏GbEAG基因的不同组织部位的表达情况分析

取银杏两年生幼苗，将其须根、主根、老茎、幼茎、叶五个组织部位分别取下，清洗干净后立即置于液氮中速冻，然后置于-80℃保存。RNA提取和逆转录步骤同实施例2。

以上述cDNA为模板，采用GbEAG-RT-F和GbEAG-RT-R为引物，以Gb18S引物为内参，通过实时荧光定量PCR对GbEAG进行不同组织部位表达量检测，根据

法分析各样品基因的相对表达量。引物序列如下表所示：

实时荧光定量PCR反应体系如下：

扩增程序为：Preincubation：95℃ 5min；2Step Amplification：95℃ 10s，60℃30s，40个循环；Melting：95℃ 15S，65℃ 60S，95℃ 15S；Cooling：37℃ 30S。

结果如图5所示，采用银杏Gb18S为内参基因，GbEAG在银杏5个不同组织部位的表达情况，发现GbEAG在银杏须根中特异性高表达，这与银杏内酯的生物合成途径基因的表达模式一致。推测GbEAG可能是调控银杏内酯生物合成的重要基因。

实施例4、VIGS沉默GbEAG

4.1、TRV2-GbEAG基因干扰载体的构建

根据GbEAG全长序列，结合干扰载体TRV2序列，设计引物，分别在引物两端添加Xbal和SacI酶切位点以及保护碱基，以cDNA为模板扩增长度为496bp的靶片段，靶片段序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，图3右侧为扩增靶片段的电泳图。对回收纯化的PCR产物和TRV2空载体使用Xbal和SacI酶切，酶切后的PCR片段和TRV2空载体连接，转化DH5α大肠杆菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行测序验证，验证成功后提取质粒保存。

扩增靶片段所用的引物序列如下(下划线为酶切位点)：

GbEAG-VIGS-F：CCTCTAGAATTCTATGCTGGTTCTCCCG

GbEAG-VIGS-R：TTGAGCTCTTCATTGGTGGTTGCTGTG

4.2、含TRV2-GbEAG干扰载体的GV3101农杆菌的获得

分别取1.5uL TRV1、TRV2、TRV2-GbEAG质粒采用融冻法转入GV3101农杆菌感受态中，经菌液PCR验证阳性后保存菌种，保存的菌种分别命名为Agro:pTRV1,Agro:pTRV2和Agro:pTRV2-GbEAG。

4.3、银杏VIGS系统的构建

分别挑取步骤4.2保存的Agro:pTRV1,Agro:pTRV2和Agro:pTRV2-GbEAG菌株单克隆，

分别加入800μL LB培养液(含Kana和Rif)中，初次摇菌28℃，24-36h，200rpm/min，28℃，避光；菌液浑浊时，再加入10-20mL LB培养液(含Kana和Rif)，进行二次摇菌12-24h，200r/min，28℃，避光；菌液浑浊时，离心，4000r/min，5-10min，弃掉LB培养液；加少量侵染缓冲液(含1mM MgCl₂,10mM MES和200uM AS)，将Agro:pTRV1,Agro:pTRV2和Agro:pTRV2-GbEAG菌块震荡打散，混匀，加适量侵染缓冲液，调节OD600至1.0。将OD600＝1.0的Agro:pTRV1和Agro:pTRV2,Agro:pTRV1和Agro:pTRV2-GbEAG，分别等体积混合，震荡混匀，静置2-3h，避光。

将处理好的侵染液注射银杏幼苗根茎和幼根，先用带针头注射器摩擦注射部位制造伤口，然后用不带针头注射器按压方式注射，剩余菌液灌根处理；病毒接种3周后取材，将须根全部取下液氮速冻后于-80℃保存。

实施例5、VIGS沉默GbEAG后银杏内酯合成途径相关基因的表达量和银杏内酯含量分析

5.1银杏内酯合成途径相关基因的表达量分析

采用通用植物总RNA快速提取试剂盒对VIGS处理的银杏幼苗须根部进行总RNA提取，对得到的总RNA进行浓度，完整性和纯度检测，对所提取的RNA进行逆转录合成第一链cDNA，然后设计合成定量PCR引物，如下表所示，对所有样品进行上机检测。使用18S作为内参基因，根据2^-ΔΔCT法分析各样品基因的相对表达量。

由图6可以看出，沉默GbEAG后，与空载体相比，银杏须根中GbEAG的表达量显著降低，表明银杏幼苗VIGS沉默体系发挥作用。此外，银杏内酯生物合成途径的一些关键基因，GbDXS2、GbDXR、GbIDS2、GbHDR、GbGGPPS1、GbHMGR1、GbFPS、GbLPS、GbIDI等的表达水平也发生了明显下调，推测GbEAG在银杏内酯生物合成过程中发挥了关键的转录调控作用。

5.2银杏内酯含量分析

液相色谱分析采用安捷伦1260液相系统，色谱柱采用Agilent Zorbax Extend C-18柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：水(A)-甲醇(B)。梯度洗脱程序：0-33min，25％-42％B；33-36min，42-95％B；36-40min，95％B。Post time 5min。

流速：0.8mL/min；进样体积：10μL。

ELSD采用安捷伦系统，雾化器温度：80℃；蒸发管温度：90℃；雾化气体(N₂)流速：1.5L/min。

对照品溶液制备取银杏内酯A、B、C、BB对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成1mg/mL的对照品溶液，取对照品进行混合并梯度稀释，分别制成0.25mg/mL、0.2mg/mL、0.15mg/mL和0.1mg/mL的标曲浓度。

供试品溶液制备称取0.1g经冷冻干燥的银杏须根样品，加入8mL70％甲醇溶液，涡旋3min，超声提取1h，期间每隔20min颠倒混匀一次；取上清液4mL，室温下13000rpm离心10min，小心吸取上清2mL，氮吹干燥后用0.5mL 70％甲醇复溶，涡旋3min后再次13000rpm离心5min，吸取100μL上清用于HPLC-ELSD分析。采用自动积分方法，利用标准曲线计算出相应的银杏内酯含量。

如图7所示，测定沉默GbEAG后银杏幼苗须根中的银杏内酯含量，与空载体相比，银杏内酯A的含量发生了显著性降低，白果内酯含量略有下降，而银杏内酯B和银杏内酯C的含量未有明显变化。这表明GbEAG被敲降后，银杏内酯A含量发生了明显降低，也表明了GbEAG对银杏内酯的生物合成具有一定的转录调控作用。

实施例6、GbEAG转录因子的转录激活验证

6.1载体构建

以构建的PHB-X-3*Flag-GbEAG为模板，采用GbEAG-AD-F和GbEAG-AD-R为引物扩增。引物序列如下所示(下划线为酶切位点)：

GbEAG-AD-F CCGAATTCATGTTTTTGGGCAACGGAGA

GbEAG-AD-R CCGAGCTCTTAGCTAACCACAAGTTGCCC

将扩增产物和pGADT7载体分别用限制性酶切位点EcoRI和SacI双酶切，连接，得到pGADT7-GbEAG载体，转化大肠杆菌并进行测序验证。

以4*GCC-Box-F和4*GCC-Box-R为引物，扩增300bp的4*GCC-Box阳性对照片段，该片段含有4个串联的GCC-Box motif，序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。引物序列如下所示(下划线为酶切位点)：

4*GCC-Box-F CCGGTACCAAGCTTGATCAGCCGCC

4*GCC-Box-R CCGTCGACTAATGCAGCTGGCACGA

将扩增产物和pAbAi载体分别用限制性酶切位点KpnI和SalI双酶切，连接，得到pAbAi-4*GCC-Box载体，转化大肠杆菌并进行测序验证。

以GbIDIpro-F和GbIDIpro-motif-R为引物扩增银杏内酯合成途径基因GbIDI启动子片段1，该片段含GCC-Box motif；以GbIDIpro-F和GbIDIpro-no motif-R为引物扩增GbIDI启动子片段2，该片段不含GCC-Box motif，作为阴性对照。启动子片段1和2序列如序列表SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。引物序列如下所示(下划线为酶切位点)：

GbIDIpro-F CCGGTACCGATGGTTCCAAACATAGGACTG

GbIDIpro-GCC Box-R TTCTCGAGGGGTGGATAAGTGAGAGCACTC

GbIDIpro-No GCC Box-R CCCTCGAGACCGGTTAATGAGAATCAAGACA

将扩增产物和pAbAi载体分别用限制性酶切位点KpnI和XhoI双酶切，连接，得到pAbAi-GbIDIpro-GCC Box载体和pAbAi-GbIDIpro-No GCC Box载体，转化大肠杆菌并进行测序验证。

6.2载体线性化及转化Y1HGold酵母

对pAbAi-4*GCC-Box、pAbAi-GbIDIpro-GCC Box载体和pAbAi-GbIDIpro-No GCCBox载体使用BstBI酶酶切线性化，线性化体系如下：

将线性化的载体转化Y1HGold酵母感受态细胞，涂布于SD/-Ura固体培养基上，30℃培养3-5天后挑阳性克隆进行菌液PCR验证。阳性菌液可-80℃冻存或划线保存。

6.3酵母诱饵质粒最低AbA抑制浓度筛选

将检测为阳性的Y1HGold酵母菌株，在SD/-Ura培养基上划线，30℃倒置培养3-5天。挑取单克隆于SD/-Ura液体培养基，30℃，200rpm震荡培养至OD值0.2左右。将菌液分别稀释10倍和100倍，将三种浓度的菌液分别吸取8uL滴于含有不同AbA浓度的SD/-Leu培养基上，在超净台风干。30℃倒置培养3-5天，观察长斑情况。

6.4pGADT7-GbEAG转化诱饵酵母

制备含pAbAi-4*GCC-Box、pAbAi-GbIDIpro-GCC Box载体和pAbAi-GbIDIpro-NoGCC Box载体的诱饵酵母感受态细胞，将pGADT7-GbEAG分别转入相应的诱饵酵母感受态中，涂布于SD/-Leu培养基上和SD/-Leu(AbA最低抑制浓度)，观察长斑情况。

如图8所示，含有GbEAG和阳性对照4*GCC-Box或GbIDIpro-GCC Box启动子片段的重组酵母能够正常生长，而含有GbEAG和GbIDIpro-No GCC Box启动子片段的重组酵母不能正常生长。这表明GbEAG能够结合到GbIDI的启动子GCC Box区域，从而调控银杏内酯的生物合成。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 1

atgtttttgg gcaacggaga aaaagcagag tattcagaga tgagcttctt ggatcaaatt 60

cgacaccatt tgctggggga tttctccgat tcaaatctca tgacttctgt acaagaatcc 120

tcattctatg ctggttctcc cgcagagtca tgtttgacgg tgaattgtcc gtcttctaac 180

agctgggatg ccatttcctc tgacgacaga tataacatca agtccgtcag aaatccagct 240

ttggacgata cagcgtcatg cggtagcagt ttggaacacg aaaatttcat ccaaaacgcg 300

atcgtgggcg attccgagga agaaaataga cgggaaattc aaacggagaa tatgaaaatg 360

ggcaagagat tttcccgtcc ctctctctcc gtctctgttc ctcaaacaga gtgtcatgaa 420

tgggagaaat ggggatccag ggcttctgtt aacgttagtt cgccttgtgt gagcccgtgt 480

ttatcagggg catgggggaa acttcccttg gatgagaatg actcagaaga catggttttg 540

tatggcattc tcaaggaggc cactacgaag ggatggatgc ctatcacgcc caaggagcca 600

cagcaaccac caatgaagca agacgctgtt tttcccgtca aacaacagac aactgttcgc 660

caagaggcgg aacctcagca gtctacgaag aagaagagcg ggggcaaaca ttacagaggc 720

gtgaggcaga gaccgtgggg caaattcgct gcagagatta gagactcggc gaggcagggg 780

gctagaattt ggcttgggac cttcaatacc gccgaagaag ccgcgcttgc atatgaccgt 840

gctgcttaca aaatgagggg gtctagggct ttgctcaact ttcctcaaca agttgtgtct 900

agatcaatgg aggaggatat atcatcgtct caagggacct tgaaatctag tgaagtgaga 960

aataggagtg acaatgtagg aaaaaagaga gaacgtgacc aagcacttga aggagaaggg 1020

gagaaacatt gtagagcaaa attagaggaa tctattttgg tggatgacac ggggaaagat 1080

ttgctcgagg agcttctttc ttcatcaaca ccaatacaaa ctagcggtgg aggtgcaagt 1140

tttccggtgt gtaattgccc cgggcaactt gtggttagct aa 1182

<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 2

Met Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu Ala Gly Thr Ser Gly Met Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gly Ile Ala His His Leu Leu Gly Ala Pro Ser Ala Ser Ala

20 25 30

Leu Met Thr Ser Val Gly Gly Ser Ser Pro Thr Ala Gly Ser Pro Ala

35 40 45

Gly Ser Cys Leu Thr Val Ala Cys Pro Ser Ser Ala Ser Thr Ala Ala

50 55 60

Ile Ser Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ile Leu Ser Val Ala Ala Pro Ala

65 70 75 80

Leu Ala Ala Thr Ala Ser Cys Gly Ser Ser Leu Gly His Gly Ala Pro

85 90 95

Ile Gly Ala Ala Ile Val Gly Ala Ser Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly

100 105 110

Ile Gly Thr Gly Ala Met Leu Met Gly Leu Ala Pro Ser Ala Pro Ser

115 120 125

Leu Ser Val Ser Val Pro Gly Thr Gly Cys His Gly Thr Gly Leu Thr

130 135 140

Gly Ser Ala Ala Ser Val Ala Val Ser Ser Pro Cys Val Ser Pro Cys

145 150 155 160

Leu Ser Gly Ala Thr Gly Leu Leu Pro Leu Ala Gly Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Ala Met Val Leu Thr Gly Ile Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Gly Thr

180 185 190

Met Pro Ile Thr Pro Leu Gly Pro Gly Gly Pro Pro Met Leu Gly Ala

195 200 205

Ala Val Pro Pro Val Leu Gly Gly Thr Thr Val Ala Gly Gly Ala Gly

210 215 220

Pro Gly Gly Ser Thr Leu Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Thr Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Leu Pro Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser

245 250 255

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ile Thr Leu Gly Thr Pro Ala Thr Ala Gly

260 265 270

Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Leu Met Ala Gly Ser

275 280 285

Ala Ala Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Val Val Ser Ala Ser Met Gly

290 295 300

Gly Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ser Gly Val Ala

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Val Gly Leu Leu Ala Gly Ala Ala Gly Ala Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Gly Gly Leu His Cys Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ile

340 345 350

Leu Val Ala Ala Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ser

355 360 365

Ser Thr Pro Ile Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ala Ser Pro Pro Val Cys

370 375 380

Ala Cys Pro Gly Gly Leu Val Val Ser

385 390

<210> 3

<211> 496

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 3

attctatgct ggttctcccg cagagtcatg tttgacggtg aattgtccgt cttctaacag 60

ctgggatgcc atttcctctg acgacagata taacatcaag tccgtcagaa atccagcttt 120

ggacgataca gcgtcatgcg gtagcagttt ggaacacgaa aatttcatcc aaaacgcgat 180

cgtgggcgat tccgaggaag aaaatagacg ggaaattcaa acggagaata tgaaaatggg 240

caagagattt tcccgtccct ctctctccgt ctctgttcct caaacagagt gtcatgaatg 300

ggagaaatgg ggatccaggg cttctgttaa cgttagttcg ccttgtgtga gcccgtgttt 360

atcaggggca tgggggaaac ttcccttgga tgagaatgac tcagaagaca tggttttgta 420

tggcattctc aaggaggcca ctacgaaggg atggatgcct atcacgccca aggagccaca 480

gcaaccacca atgaag 496

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 4

ccggtaccaa gcttgatcag ccgccggatc gatcagccgc cggatcgatc agccgccgga 60

tcgatcagcc gccggatccc tcgaggggtt ccatcccaat ggcgcgccga gcttggctcg 120

agcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 180

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 240

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 300

<210> 5

<211> 512

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 5

gatggttcca aacataggac tgttagagta aagcatttct ttgttaagag ctctagatag 60

tttaaaactt tgattttaat tatcatttcc atttgatatc ccaacattta tacattattt 120

gtgacccaac attagttgag aagtaaactt atttggctta gaattctaaa atatattatt 180

ggaagtatat catgcacaca taaactgcac ttcatgtaac taaagttaat gagaggttta 240

gcaaggattt ttttcacatt taatgtgccc caaaatatgt ccgctaaatt aactcatcaa 300

caacatttta cataaaatta gactttcaag gggtgcccta cctcattaga tattattaaa 360

aaaaatggta attaagtgga agattttgag gatagtcatg tcttgattct cattaaccgg 420

tagccgccca tatgcattaa gtcttattcc acacccctca ttttcacata gagataatca 480

cccacgtgtt gagtgctctc acttatccac cc 512

<210> 6

<211> 421

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 6

gatggttcca aacataggac tgttagagta aagcatttct ttgttaagag ctctagatag 60

tttaaaactt tgattttaat tatcatttcc atttgatatc ccaacattta tacattattt 120

gtgacccaac attagttgag aagtaaactt atttggctta gaattctaaa atatattatt 180

ggaagtatat catgcacaca taaactgcac ttcatgtaac taaagttaat gagaggttta 240

gcaaggattt ttttcacatt taatgtgccc caaaatatgt ccgctaaatt aactcatcaa 300

caacatttta cataaaatta gactttcaag gggtgcccta cctcattaga tattattaaa 360

aaaaatggta attaagtgga agattttgag gatagtcatg tcttgattct cattaaccgg 420

t 421

Claims

1.一种银杏GbEAG（Ginkgo biloba，ERF transcription factor associated withginkgolides biosynthesis）蛋白，是由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白。

2.权利要求1所述GbEAG蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述GbEAG蛋白的编码基因，其特征在于，所述基因为如序列表SEQ IDNO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列。

4.含权利要求2或3所述GbEAG蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

5.权利要求1所述的GbEAG蛋白作为转录因子的应用。

6.权利要求1所述的GbEAG蛋白，或权利要求2或3所述GbEAG蛋白的编码基因，或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用，为如下（c1）或（c2）：

（c1）结合具有GCC-Box区的启动子；

（c2）调控银杏内酯的生物合成。

7.权利要求1所述的GbEAG蛋白，或权利要求2或3所述GbEAG蛋白的编码基因，或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物育种中的应用，其中，所述植物为银杏。